盐酸文拉法辛的药物组合物以及生物医药用图
【专利摘要】本发明公开了盐酸文拉法辛的药物组合物以及生物医药用途，本发明提供的盐酸文拉法辛的药物组合物中含有盐酸文拉法辛和一种从甘草的干燥根茎中分离得到的结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，盐酸文拉法辛、化合物(Ⅰ)单独作用时，具有促进骨折愈合的作用；盐酸文拉法辛和化合物(Ⅰ)联合作用时，促进骨折愈合的效果更为明显，二者存在协同作用，可以开发成促进骨折愈合的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
盐酸文拉法辛的药物组合物以及生物医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及盐酸文拉法辛的新用途，具体涉及盐酸文拉法辛 的药物组合物及其在生物医药中的应用。
【背景技术】
[0002] 盐酸文拉法辛是三种生物源性胺类(5-羟色胺，去甲肾上腺素和多巴胺）的再摄取 抑制剂，其中对5-羟色胺再摄取抑制作用最强，对去甲肾上腺素再摄取抑制作用也较强。文 拉法辛对毒蕈碱、烟碱、组胺和肾上腺素受体无作用，对单胺氧化酶无抑制作用。
[0003] 盐酸文拉法辛主要通过同时阻断NE和5-HT的再摄取，升高NE和5-HT浓度而发挥双 重抗抑郁作用，对多巴胺(DA)的重摄取，仅有轻微的抑制作用。对Μ胆碱受体，肾上腺素 α1、α 2、β受体，组胺HI受体几乎无亲和力。其活性代谢产物0-去甲基文拉法辛亦可抑制5-HT和NE 的重摄取，活性比原形药低。有研究表明，该品小剂量时主要抑制5-HT的再摄取，大剂量时 对5-HT和NE的再摄取均有抑制作用。该药对5-HT再摄取的抑制作用弱于选择性5-HT重摄取 抑制剂(SSRI);对NE再摄取的抑制作用也弱于某些三环类抗抑郁药(TCA)或选择性NE再摄 取抑制药。但该品单次或多次给药均可降低由异丙肾上腺素刺激大鼠松果体产生的cAMP浓 度，引起肾上腺素 β受体的快速下调，而TCA则需长期给药才有此效应。现认为文拉法辛对肾 上腺素 β受体的快速下调作用与其起效快有关。
[0004] 迄今为止，尚未见盐酸文拉法辛及其药物组合物与骨折愈合的相关性报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种盐酸文拉法辛的药物组合物，该药物组合物中含有盐 酸文拉法辛和一种结构新颖的天然产物，盐酸文拉法辛和该天然产物可以协同促进骨折愈 合。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0008]
[0009] -种盐酸文拉法辛的药物组合物，包括盐酸文拉法辛、如权利要求1所述的化合物 (I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0010] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0011]进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0012]上述化合物⑴的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将甘草的干燥根茎粉碎，用85 ~95%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的 正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁 醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用70%乙醇洗脱12个柱体积， 收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用 正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个 组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓 缩得到化合物(I)。
[0013] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用90%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0014] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0015]进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯进行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0016] 上述化合物(I)在制备促进骨折愈合的药物中的应用。
[0017] 上述盐酸文拉法辛的药物组合物在制备促进骨折愈合的药物中的应用。
[0018] 本发明的优点:本发明提供的盐酸文拉法辛的药物组合物中含有盐酸文拉法辛和 一种从甘草的干燥根茎中分离得到的结构新颖的天然产物，盐酸文拉法辛和该天然产物单 独作用时，具有促进骨折愈合作用；二者联合作用时，促进骨折愈合的效果进一步提高，可 以开发成促进骨折愈合的药物。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。
[0020] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0021] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰。
[0022] 分离方法：（a)将甘草的干燥根茎(2kg)粉碎，用90%乙醇热回流提取(20L X 3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4LX3次）、乙酸乙酯(4LX3次)和水饱和的 正丁醇(4LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用70%乙醇 洗脱12个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70 %乙 醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1 (8个柱体积）、20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组 分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为8:1(8个柱体积）、5:1(10个柱体积)和2:1(5个 柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合 的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (275mg，HPLC归一化纯度大于98% )。
[0023] 结构确证:册431-]\^显示[]\?1]+为111/2 219.1346，结合核磁特征可得分子式为 &4Η18〇2，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据δΗ( ΡΡπι，CDC13，500MHz): H-4(6 · 32，d，J = 9 · 6Hz)， H-5(6.21，dd，J=9.6,3.1Hz)，H-6(2.39，m)，H-7(3.73，m)，H-8a(1.78，m)，H-8b(1.55，dd，J = 12.2,8.1Hz)，H-10a(2.53，d，J=15.8Hz)，H-10b(2.31，d，J=15.8Hz)，H-ll(10.13，s)， !1-13(0.84，(1，了 = 7.3抱），!1-14(1.04,8)，!1-15(1.17,8);核磁共振碳谱数据6。(卯111，〇)(：1 3， 125MHz):199.8(C，卜C)，141.2(C，2-C)184.8(C，3-C)，132.3(CH，4-C)，154.7(CH，5-C)， 31.1(CH，6-C)，52.7(CH，7-C)，45.3(CH2,8-C)，37.7(C，9-C)，51.2(CH2，10-C)，186.9(CH， 11-C)，19.2(CH 3，13-C)，28.3(CH3，14-C)，29.1(CH3，15-C)。红外波谱表明该化合物含有羰 基（1735cm-醛基1628cm-O^C-NMRJEPT和HSQC谱中显示有14个碳信号，包括三个甲基， 两个亚甲基，五个次甲基(一个醛基和两个烯烃碳），以及四个季碳(两个烯烃碳和一个羰基 碳），以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为双环结构。 1H-NMR谱结合HSQC谱显示三 个甲基质子信号知0.84(3!1，(1，1 = 7.3抱）、1.04(3!1，8)、1.17(3!1，8)，两组亚甲基质子信号 δΗ 1.78( lH，m)与1.55( lH，dd，J= 12.2，8.1Hz)、2.53( lH，d，J= 15·8Ηζ)与 2.31( lH，d，J = 15.8抱），一对烯烃质子信号5[16.32(1!1，(1，了 = 9.6!^)与6.21(1!1，(1(1，了 = 9.6,3.1抱），一个 醛基质子信号知10.13(lH，s)，两个次甲基质子信号δΗ 2.39(lH，m)与3. COSY谱中存在H-4/H-5/H-6/H-7/H2-8相关信号，同时HMBC谱中显示有H-4与C-2和C-3，H-5 与 C-4、C-6 和 C-7，H-6 与 C-1 和 C-4，H-7 与 C-5，H2-10 与 C-l、C-7、C-8 和 C-14，H-11 与 C-l、C-2 和C-3，H3-13与C-5和C-7，H3-14与C-8、C-9和C-10，H 3-15与C-9和C-10相关信号，通过上述 匪R谱中的相关信息可以构建该化合物的连接方式，并且上述波谱数据表明该化合物为12 位碳缺失的notremulane型倍半萜。HMBC谱中Η-ll和H-4与C-3的相关性表明C-3为酮羰基。 在notremulane型倍半砲中，H-6与H-7位一般为β构型，出 -14构型通常处是β位，出-15构型为 α位。在该化合物的Ν0Ε试验中体现的Η-6/Η-7与Η-7/Η3-14相关信号符合tremulane型倍半 萜的构型关系。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基 本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0024] 该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0025]
[0026] 实施例2:药理作用 [0027] 1、材料与方法
[0028] 1.1动物
[0029] 青紫兰健康家兔50只，体质量2.0~2.5kg，雌雄兼用。兔标准颗粒饲料喂养。均由 兰州生物制品研究所提供。
[0030] 1.2试剂与样品
[0031 ]盐酸文拉法辛购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例 1。仙灵骨葆胶囊：由淫羊藿、续断、补骨脂等药物组成。贵州仙灵药业有限责任公司生产。硫 喷妥钠，麻醉用药，上海新亚药业有限公司生产。使用时用生理盐水配制成2%的溶液供腹 腔注射。青霉素钠，哈尔滨制药总厂生产。
[0032] 1.3家兔分组及模型制备
[0033] 将上述50只家兔适应性饲养3d后，腹腔注射2 %硫喷妥钠40mg/kg麻醉。取桡骨中 段纵行切口，显露桡骨中段，用牙科钻的圆砂轮将桡骨锯成3mm宽的骨缺损标准横断骨折。 不做固定，术后每天肌注青霉素钠4X10 4U/kg，连用3d，动物造模后随机分为5组，分别为空 白对照组、阳性对照组(仙灵骨葆胶囊，280mg · kg<)和盐酸文拉法辛组(20mg · kg<)、化合 物（I)组（20mg · kg<)、盐酸文拉法辛与化合物（I)组合物组【10mg · kg<盐酸文拉法辛+ 10mg · 1?1化合物⑴】。药物混悬液灌胃法给药，术后第1天开始灌胃。阳性对照组灌服仙灵 骨葆0.28g/kg，均以10ml/kg蒸馏水稀释，空白对照组灌服10ml/kg生理盐水。各兔灌胃1次/ d，连续至处死日期为止。
[0034] 1.4标本采集与处理
[0035] 灌胃后第3周于耳中央动脉采血检测血清碱性磷酸酶(ALPase)。于灌胃第14天用 空气栓塞法处死第一批兔子，每组内也用随机法分为2个亚组，每个亚组5只。于肘关节离断 前臂，置同一胶片盒摄X线片，然后完整分离桡骨，剔除附着的软组织及骨膜，用生理盐水纱 布块包裹桡骨标本，置_20°C冰箱冷藏备用。将另一侧桡骨标本于骨折部上下方各lcm处锯 断，4%甲醛固定备用。第31天同前法处死第二批兔子，采集标本。
[0036] 1.5血清 ALPase 测定
[0037] 采用比色法测定血清碱性磷酸酶[S_ALP(IU/L)]。
[0038] 1 · 6骨痂生物力学测试
[0039]将桡骨标本于测试前2h取出，自然解冻，置万能材料实验机，作三点弯曲实验，测 试桡骨骨痂力学强度。跨距50mm，加载速度10mm/min，以最大载荷作为桡骨愈合程度的标 志。视骨折断面为椭圆，用游标卡尺测量骨折部最大直径(dl)和最小直径(d2)，得出最大半 径(a)和最小半径(b)，求出椭圆的横截面积，计算出最大应力。计算公式如下：
[0040]横截面积:F = Jiab(单位:mm2);最大应力=最大载荷/横截面积(单位:N · mnf2)
[00411 1.7统计学方法
[0042] X线片评分结果按分数编秩，SPSS19.0软件进行组间秩和检验。其余各数据均以X ± s表示，用SPSS19.0软件进行方差分析，LSD法进行显著性检验。
[0043] 2、实验结果
[0044] 2.1对骨折家兔模型血清ALPase检测结果。
[0045] 和空白对照组相比，阳性对照组血清ALPase含量升高(P〈0.05);与空白对照组相 比，盐酸文拉法辛与化合物（I)组合物组血清ALPase含量显著升高(P〈0.01);盐酸文拉法辛 和化合物（I)组血清ALPase含量升高(P〈0.05)。结果见表1。
[0046] 2.2对骨折家兔模型骨生物力学测试结果
[0047] 14天时，和空白对照组相比，阳性对照组最大应力升高(P〈0.05)，最大载荷显著升 高(P〈0.01);和空白对照组相比，盐酸文拉法辛与化合物（I)组合物组最大应力和最大载荷 明显升高(P〈〇.01);盐酸文拉法辛组、化合物（I)组最大应力和最大载荷升高(P〈〇.05) ;31 天时，和空白对照组相比，盐酸文拉法辛与化合物（I)组合物组与阳性对照组最大应力和最 大载荷明显升高（p〈0.01);盐酸文拉法辛组、化合物（I)组最大应力和最大载荷升高（p〈 0.05)。结果见表2和表3。
[0048] 表1对骨折家兔模型血ALPase的影响
[0049]
[0050]表2对骨折家兔模型骨生物力学的影响（14天）
[0051]
[0052]表3对骨折家兔模型骨生物力学的影响(31天）
[0053]
[0054] 上述结果表明，盐酸文拉法辛、化合物（I)单独作用时，具有促进骨折愈合的作用； 盐酸文拉法辛和化合物（I)联合作用时，促进骨折愈合的效果更为明显，二者存在协同作 用，可以开发成促进骨折愈合的药物。
[0055]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种盐酸文拉法辛的药物组合物，其特征在于:包括盐酸文拉法辛、如权利要求1所 述的化合物(I)和药学上可W接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的盐酸文拉法辛的药物组合物，其特征在于:药学上可W接受的 载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附 载体或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的盐酸文拉法辛的药物组合物，其特征在于：所述剂型包括片 剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注 射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含W下操作步骤：（a)将甘 草的干燥根茎粉碎，用85~95 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中正下醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱10个柱体积，再用 70%乙醇洗脱12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b) 中70 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲 烧-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为8:1、5:1和2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基 硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~14个柱 体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用90%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烧代 替乙酸乙醋进行萃取，得到二氯甲烧萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备促进骨折愈合的药物中的应用。10. 权利要求2~4任一所述的盐酸文拉法辛的药物组合物在制备促进骨折愈合的药物 中的应用。
【文档编号】C07C45/78GK105906497SQ201610240959
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月18日
【发明人】潘立, 李义高, 李小彪, 赵阳
【申请人】镇江高海生物药业有限公司