一种阿法骨化醇的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种阿法骨化醇的药物组合物及其医药用途，本发明提供的阿法骨化醇的药物组合物中含有阿法骨化醇和一种从天麻的干燥块茎中分离得到的结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，阿法骨化醇、化合物(Ⅰ)单独作用时，可以通过降低胶原浓度的作用来干预肾血管性高血压模型大鼠的心肌纤维化；阿法骨化醇和化合物(Ⅰ)联合作用时，干预效果更好，可以开发成防治肾血管性高血压患者心肌纤维化的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
-种阿法骨化醇的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，设及阿法骨化醇的新用途，具体设及阿法骨化醇的药 物组合物及其在肾血管性高血压致屯、肌纤维化中的应用。
【背景技术】
[0002] 阿法骨化醇化学名（5Z，7E) -9，10-开环胆酱-5，7，10 (19) -S締-1 a，30-二醇。
[0003] 阿法骨化醇在肝脏被迅速转化成1,25-二径基维生素 D3,后者为维生素 D3的代谢 物，起到调节巧和憐酸盐代谢的作用。由于运一转化过程很迅速，故阿法骨化醇的临床效应 与1，25-二径基维生素 D3基本一致。其主要作用是通过提高体内血循环中1，25-二径基维生 素 D3水平，从而增加巧、憐酸盐的肠道吸收，促进骨矿化，降低血浆甲状旁腺激素水平，同时 减少骨巧消溶。适用于防治骨质疏松症，肾原性骨病(肾病性何僕病，甲状旁腺功能亢进(伴 有骨病者）、甲状旁腺功能减退、营养和吸收障碍引起的何僕病和骨软化症、假性缺巧(D-依赖型I)的何僕病和骨软化症等。
[0004] 高血压病引起的屯、脏病理改变主要是屯、肌实质重构和间质重构。高血压引起的主 要屯、脏病理改变不仅指屯、肌细胞的肥大，而且还包括屯、肌纤维化(MF)和冠状微血管的结构 改变，研究表明，由此引起屯、功能障碍与屯、肌间质胶原堆积、间质重建、形成M F有关。
[0005] 迄今为止，尚未见阿法骨化醇及其药物组合物与肾血管性高血压的相关性报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种阿法骨化醇的药物组合物，该药物组合物中含有阿法 骨化醇和一种天然产物，阿法骨化醇和该天然产物可W协同治疗肾血管性高血压致屯、肌纤 维化。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[000引一种具有下述结构式的化合物(I)，
[0009
[0010] -种阿法骨化醇的药物组合物，包括阿法骨化醇、如权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可W接受的载体，制备成需要的剂型。
[0011] 进一步地，药学上可W接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0012]进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0013] 上述化合物（I)的制备方法，包含W下操作步骤：（a)将天麻的干燥块茎粉碎，用80 ~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水饱和的 正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步骤(a)中正下 醇取物用大孔树脂除杂，先用30%乙醇洗脱6个柱体积，再用85%乙醇洗脱12个柱体积，收 集85%洗脱液，减压浓缩得85%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中85%乙醇洗脱浓缩物用正 相硅胶分离，依次用体积比为100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到4个 组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和2:1的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分 离，用体积百分浓度为88 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集13~16个柱体积洗脱液，洗脱液减 压浓缩得到化合物(I)。
[0014] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)用85%乙醇热回流提取，合并提取 液。
[0015] 进一步地，化合物(I)的制备方法中，所述大孔树脂为DlOl型大孔吸附树脂。
[0016] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，步骤(a)中用二氯甲烧代替乙酸乙醋进行萃 取，得到二氯甲烧萃取物。
[0017] 上述化合物(I)在制备治疗肾血管性高血压致屯、肌纤维化的药物中的应用。
[0018] 上述阿法骨化醇的药物组合物在制备治疗肾血管性高血压致屯、肌纤维化的药物 中的应用。
[0019]本发明的优点：
[0020] 本发明提供的阿法骨化醇的药物组合物中含有阿法骨化醇和一种从天麻的干燥 块茎中分离得到的结构新颖的天然产物，阿法骨化醇和该天然产物单独作用时，对肾血管 性高血压致屯、肌纤维化具有治疗作用；二者联合作用时，对肾血管性高血压致屯、肌纤维化 的治疗效果进一步提高，可W开发成治疗肾血管性高血压致屯、肌纤维化的药物。本发明与 现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0023] 试剂来源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲烧为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024] 分离方法：（a)将天麻的干燥块茎(2kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取（1化X3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋(化X3次)和水饱和的 正下醇(化X3次)萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步骤 (a)中乙酸乙醋萃取物用DlOl型大孔树脂除杂，先用30%乙醇洗脱6个柱体积，再用85%乙 醇洗脱12个柱体积，收集85%洗脱液，减压浓缩得85%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中85% 乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为100:1(12个柱体积）、50 :1(10个柱体 积）、25:1(8个柱体积)和12:1(8个柱体积）的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步 骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(6个柱体积）、12:1(8个柱体 积)和2:1(6个柱体积)的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八 烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为88 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集13~ 16个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)(440mg，HPLC归一化纯度大于98%)。
[00巧]结构确证:淡黄色无定形粉末;皿-ESI-MS显示[M+化r为m/z 353.1726,结合核磁 特征可得分子式为C20出604，不饱和度为8。核磁共振氨谱数据如(ppm，DMSO-ds，500MHz):H-I (2.22，dt，J=4.8，11.7)，H-2(1.35，m)，H-2(1.57，m)，H-3(1.43，m)，H-3(1.52，m)，H-4 (1.28，m)，H-6(4.06，s)，H-9(1.81，t，J=13.7)，H-9(1.87，dd，J = 4.2，13.9)，H-10(1.39， dt，J = 4.4，13.5)，H-13(1.89，s)，H-14(0.91，s)，H-15(0.87，d，J = 6.6)，H-3，（6.52，qq，J = 1.4,7.0)，H-4'（1.81，dt，J=1.0,7.1)，H-5'（1.84，t，J=l.l);核磁共振碳谱数据 Sc (ppm,DMSO-ds，125MHz):42.9(CH，1-C)，24.8(C 出，2-C),29.1(C此，3-C)，30.5(CH，4-C)， 56.8(C，5-C)，82.1(CH，6-C)，155.1(C，7-C)，112.8(C，8-C)，35.5(CH2,9-C)，38.7(CH，10-C)，126.8(C，ll-C)，171.0(C，12-C)，8.9(Ol3，13-C)，15.1(CH3，14-C)，15.7(ai3，15-C)， 205.1化，1'-0，127.6((：，2'-0，137.4(邸，3'-0，14.8((：出，4'-0，12.6((：曲，5'-0。红外 光谱表明该化合物含有a，e-不饱和-丫-内醋和幾基（1760和1650cnri)DiH和I 3C-NMR谱显示 一个 2-甲基-2-下締酬结构[化 1.8U3H，^，J=1.0,7.1Hz，H-4'），1.84(3H，t，J=l.lHz，H-5,），6.52(lH，qq，J= 1.4,7.0Hz，H-3，）；SC205.1(C-r)，127.6(02,），137.4(03,），14.8 (C-4'），12.6(C-5'）]，一个含有甲基侧链的 a，e-不饱和-丫-内醋[如1.89(3H，s，H-13);S C155. l(C-7)，112.8(08)，126.S(C-Il) ,171.0(C-12)，8.9(C-13)]dUC-NMR谱显示20个碳 信号，包括五个甲基，=个亚甲基，五个次甲基(一个締属次甲基，一个含氧次甲基），W及屯 个季碳(一个酬幾基碳，一个醋基碳，S个締控季碳，一个含氧季碳）。HMB幻普中，H-3 '与C-r 和C-5'，出-4'与C-2'，W及出-5'与C-r的相关性表明该化合物含有2-甲基-2-下締酬结构； H-I与C-r的相关性表明2-甲基-2-下締酬位于C-I位上。质子信号为姐0.91 (3H，s)和5 册.87 (3H，d，J = 6.細Z)的甲基分别位于C-5和C-4位上，HMBC谱中Me-14与C-IO和C-4的相关 性验证了上述推论。HMBC谱中，H-6与C-4、C-8和C-11的相关性，W及C-6和C-8的核磁数据表 明C-6和C-8通过氧桥相连。NOESY谱中，Me-14与H-IO和H-I的相关性表明运些质子为0构型。 综合氨谱、碳谱、HMB幻普和NOESY谱，W及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物 如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
[0026]该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0027]
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[0028] 实施例2:药理作用
[0029] 1、材料与方法
[0030] 1.1 动物
[0031] 正常雄性SD大鼠（广州中医药大学实验动物中屯、提供），体重90~120g。
[00创 1.2试剂与样品
[0033] 阿法骨化醇购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。 琉甲丙脯酸:常州制药厂。
[0034] 1.3大鼠分组及模型制备
[0035] 采用经典的肾动脉错夹方法。若术后血压大于术前的3个标准差且高于115mm化， 则确定模型建立。假手术组仅游离肾动脉，不套上银夹。将肾血管性高血压大鼠（畑R)随机 分为6组：假手术组、模型对照组、阳性对照组（琉甲丙脯酸，10mg/100g)和阿法骨化醇组 (lOmg/lOOg)、化合物（I)组（lOmg/lOOg)、阿法骨化醇与化合物（I)组合物组【5mg/100g阿法 骨化醇巧mg/lOOg化合物（I)】。于术后第5周开始给药，持续治疗8周，处死动物。模型对照 组:注射用水2ml/100g体重灌胃，每天1次。其他药物组:药物体重灌胃，每天1次。假手术组： 除不夹肾动脉外，均与模型组相同。
[0036] 1.4血压的测量
[0037] 采用尾袖法，血压仪为大鼠电脑血压屯、率仪(RBP-1大鼠血压仪，中日友好医院研 制）。于上午卵寸测定大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压，连测3次，取平均值。
[0038] 1.5左屯、室重量(LVW)、左屯、室重量指数(LVI =左屯、室重量/体重)测定
[0039] 实验结束时大鼠称重，断头处死，取出屯、脏，4°C预冷生理盐水冲洗血污，滤纸吸干 称重。沿房室交界处去除屯、房和大血管，去除右屯、室游离壁，分离左屯、室并称重，W此作为 LVW，并计算LVW/BW。然后立即置液氮中冷冻，-70°C保存待测。
[0040] 1.6 胶原浓度(Coll)
[0041] 采用南京建成生物工程研究所提供的径脯氨酸测试盒测定屯、肌径脯氨酸浓度。算 出径脯氨酸含量，然后乘W8.2，算出胶原浓度。
[0042] 1.7统计学方法
[0043] 实验数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差 分析和t检验，WP<0.05为差异有统计学意义。
[0044] 2、实验结果
[0045] 2.1对肾血管性高血压(畑R)模型大鼠左屯、室重量指数LVI的影响
[0046] 与正常对照组比较，模型对照组大鼠的左屯、室重量指数LVI升高；与模型对照组比 较，阿法骨化醇与化合物（I)组合物组和阳性药组大鼠左屯、室重量指数LVI显著降低（P< 0.01);与模型对照组比较，阿法骨化醇组、化合物（I)组大鼠左屯、室重量指数LVI降低(P< 0.05)。
[0047] 试验结果见表1。
[004引2.2对肾血管性高血压模型大鼠胶原水平的影响
[0049] 与正常对照组比较，模型对照组大鼠的胶原水平升高(P<0.05)。与模型对照组比 较，阿法骨化醇与化合物（I)组合物组和阳性对照组大鼠胶原水平显著降低(P<〇.01);与 模型对照组比较，阿法骨化醇组、化合物（I)组大鼠胶原水平降低(P<〇.05)。
[0050] 试验结果见表1。
[0051] 表1对肾血管性高血压模型大鼠左屯、室重量指数LVI和胶原(COll)水平的影响
LUU山U 巧iliu玉*71胆口、J王女心、肥:爪1?[义又/|、1乂:T日心、月；L针P月凹口XI/jQyV, IIU上L心'凹了白心、月；L亡T矣巧1七 (MF)和冠状微血管的结构改变，研究表明：由此引起屯、功能障碍，与屯、肌间质胶原堆积，间 质重建，形成MF有关。现代研究表明：R皿是研究屯、肌纤维化最为典型的动物模型。在术后4 周RHR屯、肌呈反应性纤维化表现，在术后12周则呈修复性纤维化表现。
[0054] 上述结果表明，阿法骨化醇、化合物（I)单独作用时，可W通过降低胶原浓度的作 用来干预肾血管性高血压模型大鼠的屯、肌纤维化;阿法骨化醇和化合物（I)联合作用时，干 预效果更好，可W开发成防治肾血管性高血压患者屯、肌纤维化的药物。
[0055] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种阿法骨化脬的约物组合物，具特祉在t:包拈N法骨化醇、如权利要求1所述的 化合物(I)和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的阿法骨化醇的药物组合物，其特征在于:药学上可以接受的载 体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载 体或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的阿法骨化醇的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、 胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射 剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将天 麻的干燥块茎粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用30%乙醇洗脱6个柱体积，再用85% 乙醇洗脱12个柱体积，收集85%洗脱液，减压浓缩得85%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中 85 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为100:1、50 :1、25:1和12:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比 为20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷 基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为88%的甲醇水溶液等度洗脱，收集13~16 个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用85%乙醇热回 流提取，合并提取液。7. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为DlOl型 大孔吸附树脂。8. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯进行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗肾血管性高血压致心肌纤维化的药物中的 应用。10. 权利要求2~4任一所述的阿法骨化醇的药物组合物在制备治疗肾血管性高血压致 心肌纤维化的药物中的应用。
【文档编号】A61P9/00GK105837591SQ201610263909
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月23日
【发明人】陈斌
【申请人】陈斌