°C，5% CO2培养箱中，静置培养，得到药物组合物。
[0100]实施例4
[0101]按照以下步骤，检测实施例3中制备获得的药物组合物促进皮肤愈合和毛囊再生的效果，具体如下:
[0102]将BALB/c裸鼠用I %的戊巴比妥钠麻醉，用打孔器在其背部皮肤上制造面积约7mm2的伤口，接着，将实施例2中制备获得的药物组合物移植到裸鼠皮肤伤口表面，并用3M膜覆盖裸鼠伤口表面，然后用绷带将裸鼠伤口包扎。正常饲养裸鼠，3周后拆开绷带去除3M膜，观察裸鼠皮肤愈合和毛囊再生情况。
[0103]实验结果如图6所示。由图6可以看出，裸鼠皮肤伤口完全愈合，并生长出毛发，表明本发明的药物组合物能够有效用于皮肤愈合和毛囊再生。
[0104]实施例5
[0105](I)采用固相合成方法进行多肽合成，通过多肽合成仪合成多肽分子，肽链的N端和C端通过乙酰化和酰胺化进行修饰，防止其迅速降解。合成后的多肽RADA16-1 (Ac-RADARADARADARADA-C0NH2)，用HPLC进行纯化后，冷冻干燥，得到RADA16-1多肽冻干粉。
[0106](2)将步骤(I)中制备获得的RADA16-1多肽冻干粉分别用去离子水溶解，得到多肽浓度为lg/100mL的RADA16-1溶液，然后用0.22 μ m的滤膜过滤除菌，得到无菌的RADA16-1 溶液。
[0107](3)将无菌的RADA16-1溶液超声30分钟。
[0108](4)将悬浮培养的第3代小鼠皮肤真皮干细胞(SKP) 14个，离心去除培养基，用ImLlO%无菌蔗糖溶液洗涤细胞，然后离心，去除上清，再加入20 μ LlO%无菌蔗糖溶液配制成细胞悬液。
[0109](5)将20 μ L细胞悬液与100 μ L超声后的RADA16-1溶液快速混匀后，加入24孔transwell中，然后沿着培养板孔壁缓慢加入培养基。
[0110](6)在5% C02、37°C培养箱中静置30min后，用枪头慢慢吸走培养基，再重新补加新鲜的培养基到24孔transwell和孔板中,放回培养箱。
[0111](7)静置30min，然后重复步骤￠)的操作。
[0112](8)再静置30min，然后重复步骤￠)的操作。
[0113](9)再静置30min，然后重复步骤￠)的操作
[0114](10)将所得到的药物组合物置于37°C，5% CO2培养箱中，静置培养，得到药物组合物。
[0115]将上述得到的药物组合物在37°C，5% CO2培养箱中培养3天后，通过倒置显微镜(Nikon)观察真皮干细胞在自组装多肽水凝胶中的生长情况，显微镜照片见图8。从图8可以看出，多数真皮干细胞可以在RADA16-1自组装多肽水凝胶中能够较好的生长。
[0116]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0117]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物，其特征在于，包括: 自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-1和PRG的至少一种形成的；以及 皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，当所述水凝胶由RADA16-1和PRG共同形成时，在所述自组装多肽水凝胶中，所述RADA16-1和所述PRG的质量比为1:1。3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，在所述自组装多肽水凝胶中，所述皮肤细胞的含量为14-1O8个/mL。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述皮肤细胞为选自真皮细胞和表皮细胞的至少一种， 任选地，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞， 任选地，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括: 有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子， 任选地，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。6.一种制备权利要求1-5任一项所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括: (1)提供RADA16-1溶液和PRG溶液，其中，所述RADA16-1溶液的浓度为0.l-lg/100ml,所述PRG溶液的浓度为0.l-lg/100ml ； (2)将所述RADA16-1溶液和所述PRG溶液等体积混合，以便获得混合水凝胶溶液； (3)在所述RADA16-1溶液、所述PRG溶液或所述混合水凝胶溶液中接种皮肤细胞，并在适于所述皮肤细胞生长的条件下进行孵育，以便获得所述药物组合物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之前，预先将所述RADA16-1溶液和所述PRG溶液进行0.22 μ m过滤除菌处理， 任选地,所述接种细胞进一步包括: 用10%无菌蔗糖溶液将所述皮肤细胞配成浓度为14-1O8个/mL的细胞悬液，将所述混合水凝胶溶液和所述细胞悬液按照体积比为5:1的比例混合， 任选地，所述孵育进一步包括: 每隔30分钟，移除孔板中的培养基，补加等体积新鲜培养基到孔板中，重复3-5次，任选地，所述培养基中包含有利于细胞存活、生长的细胞活性因子和/或细胞外基质分子， 任选地，所述细胞活性因子为选自bFGF、EGF的至少一种，所述细胞外基质分子为选自透明质酸、纤维粘连蛋白的至少一种。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RADA16-1溶液的浓度为lg/100mL， 任选地，所述PRG溶液的浓度为lg/100mL， 任选地，所述皮肤细胞为选自表皮细胞和真皮细胞的至少一种， 任选地，所述真皮细胞为新分离的真皮细胞或培养0-30代的真皮干细胞， 任选地，所述表皮细胞为新分离的表皮细胞或培养0-30代的表皮干细胞。9.权利要求1-5任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于皮肤愈合和毛囊再生。10.一种用于皮肤愈合和毛囊再生的药物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的药物组合物。
【专利摘要】本发明提供了用于皮肤愈合和毛囊再生的药物组合物及其制备方法和用途，其中，该药物组合物包括：自组装多肽水凝胶，所述自组装多肽水凝胶是由RADA16-I和PRG的至少一种形成的；以及皮肤细胞，所述皮肤细胞设置于所述自组装多肽水凝胶内部。发明人发现，利用本发明的该药物组合物，能够有效促进皮肤愈合和毛囊再生。另外，本发明的药物组合物中的自组装多肽水凝胶全人工合成，不传播动物源性疾病，具有良好的组织特异性，有利于组织特异性干细胞分化微环境的构建，且材料来源更加稳定，质量标准易于控制。
【IPC分类】A61K9/06, A61P17/00, A61L27/38, A61K35/36, A61L27/22, A61L27/60, A61L27/54, A61L27/52, A61P17/02, A61K38/16, A61K38/10
【公开号】CN105079783
【申请号】CN201410220064
【发明人】吴耀炯, 王潇潇, 郭玲
【申请人】清华大学深圳研究生院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月22日