牙齿来源间充质干细胞体外分离与培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于干细胞培养技术，尤其涉及牙齿来源间充质干细胞体外分离与培养方法。
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【背景技术】
[0003]2000 年 Gronthos 首先提出牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)的概念，把一群从牙腔内提取出来，在体外具有克隆形成能力及高增殖率的一群干细胞命名为DPSCs0 2003年，Miura从脱落乳牙的冠和根的牙髓中分离出具有多分化能力的干细胞，将其命名为乳牙牙髓基质干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)。SHED体外培养时具有很高的增殖能力和克隆形成能力，并可以分化成神经细胞、成骨细胞和成牙本质细胞，把体外培养的细胞移植回小鼠体内后可形成骨和牙本质。
[0004]对牙髓干细胞的研究显示，牙髓干细胞可应用于牙髓再生、牙本质再生、骨骼再生、神经细胞再生、心肌和血管再生等。牙髓干细胞的应用于牙科诊疗，可以促进牙本质再生，从单一牙齿分离获取大量的牙髓干细胞可以应用牙科进行大量的牙齿修复。有数据显示，体外培养的牙髓干细胞，无论是细胞增殖能力还是克隆形成率都要强于骨髓来源的间充质干细胞。
[0005]综合考虑来看，牙髓干细胞有如下优点:牙髓干细胞是一类非常特异的干细胞；牙髓的来源比较容易而且是非侵入性的，可以来源于7-8岁小孩子脱落的牙齿，或者是19-35岁成年人的智齿；牙髓干细胞可以分化出多种类型的细胞；应用前景非常广，如牙髓干细胞形成的新的骨组织移植到体内以后可以形成新的血管，可以使移植物充分融入周围组织中或者可以使牙本质再生等等。
[0006]干细胞储存业务从单纯的脐带血储存发展到现今的脐带、胎盘、牙齿等多种来源的干细胞储存，其重要性和必要性已经为越来越多的人所认可。然而仍有相当多的孩子，由于其父母从前对干细胞的认识不足，从而失去第一次为孩子储存脐带血干细胞或是脐带干细胞的时机，而乳牙牙髓干细胞储存业务的开展可以弥补这一遗憾，为孩子的健康买一份保险。
[0007]本发明对牙髓干细胞的培养方法进行了优化，取单细胞悬液进行原代培养，降低污染风险，更容易获得较单一、纯化的大量原代细胞，并且在培养过程中维持较好的干性。
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【发明内容】
[0009]本发明使用物理方法破碎牙齿获取牙髓组织，利用I型胶原酶(CollagenaseType I )和中性蛋白酶(Dispase)进行消化，获取单细胞悬液，进行原代种植培养10-15天，进而进行细胞传代；有效的解决了原代细胞混杂牙齿其它组分，并且细胞团块培养过程中易发生老化的问题。
[0010]本发明采用的技术方案为:
1、一种牙齿来源间充质干细胞体外分离与培养方法，包括步骤:
A)将牙齿表面的牙龈和周围的组织刮去，依次使用碘酒和医用酒精清洁牙齿表面；再用生理盐水洗涤3-5次，去除碘酒和酒精；将其保存在牙齿保存液中；
B)在离心管加入培养液，将牙髓收集到离心管中，再用剪刀剪碎；
C)加入2-3mg/ml的I型胶原酶(Collagenase Type I )和2-4 mg/ml的中性蛋白酶(Dispase)消化牙髓组织；
D)单细胞悬液的制备:加入3-5倍体积的完全培养液来终止消化，过滤获得单细胞悬液；
E)对获得的单细胞进行原代培养，原代细胞种植密度1-5X1Vcm2;
F)细胞传代培养:每3-4天换液培养，待细胞长至70-90%汇集度，可以进行收获并传代。
[0011]进一步的是:所述C步骤中加入的I型胶原酶浓度为3 mg/ml，加入的中性蛋白酶浓度为4 mg/ml ο
[0012]更进一步的是:所述原代和传代培养中使用的培养基包括a -MEM基础培养液和新生胎牛血清。
[0013]更进一步的是:所述的新生胎牛血清浓度为10%。
[0014]采用本发明所述的技术方案的分离培养方案，可以获取成分较为单一的单细胞悬液，可以获得成分单一的间充质干细胞，并在培养过程中维持较好的干性。
[0015]本发明能从7-8岁小孩子脱落的健康牙齿或者是19-35岁成年人的智齿中快速分离出间充质干细胞，易于培养与保存。
[0016]由于牙齿较为坚硬，相对于刮匙、镊子等工具外力打开，或者吸出，细胞与表面接触，增加污染的可能，并且容易出现失误。无菌纱布包裹牙齿，用台钳轻轻挤碎牙齿牙齿露出牙髓，操作简单，降低牙髓遭受污染的机会。
[0017]针对常用的胰酶消化法，常伤害细胞，并且在培养时不稳定。本发明使用温和的酶混合液消化，达到同样的消化目的的同时，不会给细胞膜带来伤害，更加有利于细胞的培养与收获。
[0018]直接组织块培养法细胞较杂，组织成团培养，容易分化、老化，同时可能会带入牙齿等碎片，增加污染的机会。本发明在消化后，用70μπι的滤网过滤获得单细胞悬液，相对直接组织块培养法更加有优势。
[0019]a -MEM (Minimum Essential Medium)在短期内(7-11 天)即可获得一定数目的细胞克隆。并且牙髓干细胞增殖速度非常快。根据实验，牙髓干细胞体外培养P2代平均可收获4.35X 17细胞，P4代平均可收获2.03X 10 9细胞，收获量非常可观。细胞形态呈较为幼稚的短梭形或圆形，具有很好的均一性。
[0020]本发明提供的消化分解方法，可以很好的从牙齿获取单细胞进行原代培养，在传代过程中，能很好的保持细胞均一性以及细胞干性维持。该培养方法所采用的牙髓组织采集方便，使用温和的酶混合液消化降低对细胞的伤害，通过消毒和细胞过滤降低细胞污染，操作简单。
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【附图说明】
[0022]图1本发明实施例二中牙齿来源间充质干细胞的原代细胞克隆形成。
[0023]图2本发明实施例二中牙齿来源间充质干细胞的细胞形态。
[0024]图3本发明实施例二中牙齿来源间充质干细胞的细胞收获数目。
[0025]图4本发明实施例二中牙齿来源间充质干细胞的体外培养累积倍增次数图5本发明实施例三中牙齿来源间充质干细胞CFU-F assay结果。
[0026]图6本发明实施例四牙齿来源间充质干细胞表面抗原流式分析的结果示意图。
[0027]图7本发明实施例二中牙齿来源间充质干细胞的成骨诱导分化。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[0029]实施例一牙齿来源间充