脐带血造血干细胞的体外扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种脐带血造血干细胞的体外扩增方法。
【背景技术】
[0002]近年来，人民试图用人类脐带血造血干细胞(HSC)代替成年人骨髓进行移植，以治疗一些恶性疾病。但是按骨髓及外周血移植所需的最低标准(1-2X 18CelVkg体重或0.5-1.0X 16⑶34+细胞/体重)计算，每10ml脐血所含的干细胞量只能满足不大于30kg的儿童，而对成人应用因素量有限而受到限制。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种脐带血造血干细胞的体外扩增方法，经过该方法扩增后的HSCA，不仅能够满足大量级的人群需要同时还具有比骨髓移植后拥有更长的寿命且移植物抗宿主病的发生率低。
[0004]本发明是这样实现的:脐带血造血干细胞的体外扩增方法，包括如下步骤:
1)将脐带血和无血清培养基按1:1的体积比进行混合；用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血中的单个核细胞，用50ml离心管分离淋巴细胞分离液与脐带血混合液混合，其体积比为10:35，室温下2000rpm离心20分钟；
2)吸取单个核细胞悬液，将所取单个核细胞悬液用30ml生理盐水洗两次，每次100rpm离心10分钟，弃上清；
3)将所得单个核细胞的1/3量进行体外细胞培养，另2/3细胞量进行液氮保存；
4)体外细胞培养用无血清培养基，并加入干细胞生长因子100ng/ml、促血小板生成素100ng/ml以及粒细胞刺激因子100ng/ml，细胞浓度调整为5xl05/ml ;在37°C，质量百分比浓度为5% C0J?育箱中培养5天；
5)将冻存的另外2/3量的单个核细胞复苏，加入到已经体外培养的单个核细胞中继续共同培养；同时补足干细胞生长因子的浓度，培养时间为10天；在这10天细胞培养过程当中，每3-4天换液一次，补足干细胞生长因子；
6)培养结束后，将细胞用生理盐水洗2次，检测⑶34+细胞数，并进行生物安全监测。
[0005]为了验证本发明的技术效果:申请人采用根据本发明的方法获得的产品进行如下实验:
脐血细胞重建小鼠造血功能实验 1、小鼠移植模型的建立
小鼠24只，8 — 10周龄，体重25 — 289,移植前一周始，高压灭菌饮用水中添加庆大霉素(40万单位/L)和两性霉素B(50mg/L)小鼠接受总剂量为
2.75Gy半致死量全身照射，剂量率为0.2Gy/min
照射时间为I小时，照射小鼠均在辐照后4小时内回输移植细胞，
小鼠存活10周后断颈处死，其中每7天抽取血液作检测发现血液中红细胞及白细胞数稳步上升，特别是⑶34+细胞也是稳步回升。
[0006]然后脐血细胞经流式细胞仪检测，⑶34+阳性百分率均值为92%，最高为98%。纯化细胞CD45抗原的表达较弱，CD34抗原表达为弱至中等，细胞体积小，细胞内颗粒少，为一较集中分布的细胞群。纯化的脐血CD34+细胞经瑞氏染色后观察，细胞大小均一，细胞体积较小，细胞核的染色质深、粗，呈条块状，胞浆很少，核浆比值大，胞浆中见不到颗粒。
[0007]由于采用了以上技术方案，本发明对培养过程进行了优化筛选，使其培养获得的HSCA不仅能够满足大量级的人群需要，同时还具有比骨髓移植后拥有更长的寿命且移植物抗宿主病的发生率低。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【具体实施方式】
[0008]本发明的实施例:脐带血造血干细胞的体外扩增方法，包括如下步骤:
1)将脐带血和无血清培养基按1:1的体积比进行混合；用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血中的单个核细胞，用50ml离心管分离淋巴细胞分离液与脐带血混合液混合，其体积比为10:35，室温下2000rpm离心20分钟；
2)吸取单个核细胞悬液，将所取单个核细胞悬液用30ml生理盐水洗两次，每次100rpm离心10分钟，弃上清；
3)将所得单个核细胞的1/3量进行体外细胞培养，另2/3细胞量进行液氮保存；
4)体外细胞培养用无血清培养基，并加入干细胞生长因子100ng/ml、促血小板生成素TP0100ng/ml以及粒细胞刺激因子100ng/ml，细胞浓度调整为5xl05/ml ;在37°(:，质量百分比浓度为5% C0J?育箱中培养5天；
5)将冻存的另外2/3量的单个核细胞复苏，加入到已经体外培养的单个核细胞中继续共同培养；同时补足干细胞生长因子的浓度，培养时间为10天；在这10天细胞培养过程当中，每3-4天换液一次，补足干细胞生长因子。
[0009]6)培养结束后，将细胞用生理盐水洗2次，检测⑶34+细胞数，并进行生物安全监测。
[0010]根据本发明制得的产品输给病人时，常用量为单个核细胞数1Vkg体重，或⑶34+细胞105/kg体重，采用一次性静脉缓慢点滴输注。
[0011]本发明所述并不限于【具体实施方式】中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1.一种脐带血造血干细胞的体外扩增方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)将脐带血和无血清培养基按1:1的体积比进行混合；缓慢加入淋巴细胞分离液上层；用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离脐带血中的单个核细胞，50ml离心管中其体积比为10:35，室温下2000rpm离心20分钟； 2)吸取单个核细胞悬液，将所取单个核细胞悬液用30ml生理盐水洗两次，每次100rpm离心10分钟，弃上清； 3)将所得单个核细胞的1/3量进行体外细胞培养，另2/3细胞量进行液氮保存； 4)体外细胞培养用无血清培养基，并加入干细胞生长因子100ng/ml、促血小板生成素100ng/ml以及粒细胞刺激因子100ng/ml，细胞浓度调整为5xl05/ml ;在37°C，质量百分比浓度为5% COJ?育箱中培养5天； 5)将冻存的另外2/3量的单个核细胞复苏，加入到已经体外培养的单个核细胞中继续共同培养；同时补足干细胞生长因子的浓度，培养时间为10天；在这10天细胞培养过程当中，每3-4天换液一次，补足干细胞生长因子； 6)培养结束后，将细胞用生理盐水洗2次，检测⑶34+细胞数，并进行生物安全监测。
【专利摘要】本发明提供了一种率脐带血造血干细胞的体外扩增方法。本发明对培养过程进行了优化筛选，使其培养获得的HSCA不仅能够满足大量级的人群需要，同时还具有比骨髓移植后拥有更长的寿命且移植物抗宿主病的发生率低。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分类】C12N5/0789
【公开号】CN105018428
【申请号】CN201510277206
【发明人】边曙光
【申请人】贵州北科泛特尔生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年5月27日