一种增强ctl免疫反应的dc细胞培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞制备领域，具体为一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法。
【背景技术】
[0002]CTL:又称细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL):是白细胞的亚群，为一种特异CD8+T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。
[0003]蛋白质泛素化修饰:是泛素?蛋白酶体系统降解细胞内蛋白质的主要步骤，通过由泛素激活酶(ubiquitin ?activating enzyme, El, UbelL)、泛素结合酶(ubiquitinconjugating enzyme, E2)和泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)等一系列酶活动将泛素连接到特定蛋白质分子上，然后连接泛素的蛋白质被蛋白酶体降解或发生功能改变。
[0004]泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。
[0005]DC 细胞:又称树突状细胞(Dendritic cells, DC)，1973 年，Steiman 和 Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞(dendritic cells,DCs) 0 DCs是机体免疫反应的始动者，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，是唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。未成熟DC具有较强的迀移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。
[0006]DC抗肿瘤的机制如下:①DC可以高表达MHC?I类和MHC?II类分子，MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽?MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC?I类限制性CTL反应和MHC?II类限制性的⑶4+Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(⑶80/B7?1、⑶86/B7?2、⑶40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。②DC与T细胞结合可大量分泌IL?12、IL?18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Thl型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用！③DC分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines，CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了 T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL?12、IFN?γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化DC，上调IL?12及⑶80、⑶86的表达；同时DC也直接向⑶8+Τ细胞呈递抗原肽，在活化的⑶4+Τ细胞辅助下使⑶8+Τ细胞活化，⑶4+和⑶8+Τ细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。
[0007]DC分布广泛，但数量极微.它主要来源于骨髓系，也可由人外周血单核细胞在细胞因子诱导下直接分化形成成熟的树突状细胞。目前的经典制备方法是:采集人体外周血，分离得到单个核细胞，在体外利用磁珠分选的方法分离出单核细胞，然后应用各种细胞因子共同培养7天后诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原，制成负载肿瘤抗原的DC。再将这些DC细胞注入体内后刺激体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞增殖，发挥长期肿瘤监视作用和肿瘤杀伤作用，达到消灭肿瘤的目的。
[0008]现有技术中⑶细胞的培养方法通常为:
[0009]I)、将采集的血液以密度梯度离心法分离，收集单个核细胞。
[0010]2)、细胞沉淀用含I %胎牛血清(FBS)的RPM1-1640培养基重悬，调节细胞浓度3?4X 106/mL，于37°C，5% C02培养箱中孵育2小时，弃去悬浮细胞。
[0011]3)、用含10% FBS的RPM1-1640培养基重悬贴壁细胞，调整细胞浓度为IX 106/mL，并加入终浓度为50?100ng/mL的细胞因子GM-CSF和IL-4，于37°C ,5% C02培养箱中培养7天。期间每隔3天半量换液，补充细胞因子。
[0012]4)、第七天加入 IL-1 β (10ng/mL)，IL-6 (10ng/mL)，TNF-a (lOng/mL)，PGE2 (I μ g/mL)，孵育24小时。
[0013]5)、第8天收获成熟DC细胞。
[0014]但是这种方法使用含有胎牛血清的培养基，在人体可能会产生针对异种蛋白的过敏反应，培养时间为8天，漫长的培养过程降低了 DC细胞的活性，增加了体外培养过程中细菌等微生物污染的机会，现有的促进DC成熟的细胞因子，不能大量地诱导Thl-DC的产生，因此不能有效地促进细胞毒性T细胞增殖，最终获得的DC抗原摄取、加工和呈递能力较低，只有15?20%，不能有效地激活细胞毒性T细胞(CTL)的增殖和杀伤能力。因此，寻求一种有效的DC培养方法是提高免疫治疗疗效的关键。
【发明内容】
[0015]本发明要解决的技术问题是克服现有技术中获得的DC周期长、摄取和呈递肿瘤抗原的能力只有15?20%，不能有效地激活细胞毒性T细胞(CTL)的增殖和杀伤能力的缺陷，提供一种有效的DC培养方法是提高免疫治疗疗效的方法。
[0016]为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案:
[0017]一种增强CTL免疫反应的DC细胞培养方法，其特征在于，包括以下几个步骤:
[0018]I)、米集血液，制备贴壁单核细胞；
[0019]2)、贴壁单核细胞的诱导分化
[0020]用含I %人血白蛋白的无血清培养液重悬贴壁单核细胞，调整贴壁单核细胞的浓度为I?2 X loVmL,加入400?lOOOpFU/细胞量的UbelL sh-RNA慢病毒于37°C，5 %体积浓度的C02培养箱中孵育2小时后，更换新鲜的I %人血白蛋白的无血清培养液，并加入终浓度为50?100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15?50ng/ml的细胞因子IL-4，于37°C，5%体积浓度的C02培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测；
[0021]培养第72h，半量补充新鲜的1%人血白蛋白的无血清培养液和终浓度为50?100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15?50ng/ml的细胞因子IL-4，并加入促熟细胞因子组合，于37°C，5% C02培养箱中孵育16?24小时；
[0022]培养第96h，收集成熟DC细胞，进行细胞染色和流式检测和Western blotting方法检测蛋白质ISGylat1n表达水平。
[0023]进一步的，所述步骤2)中的促熟细胞因子组合的添加量为10?20 μ g/mLpoly (IC)，5 ?10 μ g/mL LPS, 500 ?1000IU/mL IFN ?γ，10 ?20ng/mL TNF ?α。
[0024]进一步的，采集血液，制备贴壁单核细胞的方法为:
[0025]I)、将新鲜采集的血液收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，摇匀；
[0026]2)、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，按照稀释后的血液与淋巴细胞分离液的体积比为3:2，将稀释后的血液缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，注意保持液层分界清晰；
[0027]3)、在20°C下900g离心25min，离心结束后，吸取单个核细胞层液体，移入新的离心管中；
[0028]4)、以5倍于3)中收集到的单个核细胞层液体积的生理盐水稀释单个核细胞层液，在4°C下400g离心5min ；
[0029]5)重复步骤4)两次，去除上清液；
[0030]6)、用无血清培养液重悬细胞，调节细胞密度为2?3X 106/mL，于37°C，5%体积浓度的C02培养箱中孵育I小时，弃去悬浮细胞，获得贴壁的单核细胞。
[0031]本发