负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，尤其涉及一种负载羊膜固有干细 胞的冻存活性羊膜微粒及其条件培养基与应用。
【背景技术】
[0002] 羊膜来源于分娩生产过程中的胎盘废弃组织，其结构与正常皮肤结构类似，包括 上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，不含血管、神经、淋巴组织。羊膜作为外 用覆盖物用于烧伤及角膜损伤保护已有100多年历史，目前国内外均有商品化的去细胞羊 膜问世（国内瑞济生物羊膜江西瑞济生物工程技术有限公司，国外EpiFix? dHACM，MiMedx Group, Inc.)，并广泛用于各种急、慢性创面的保护。
[0003] 羊膜在创面修复中的应用主要集中在两方面：一是研究发现羊膜上皮细胞具有 干细胞特性，可以分泌多种细胞/生长因子，不仅能够诱导角质细胞迀移促进创面上皮化， 而且含有许多促血管生成因子，能够增强慢性创面或溃疡的肉芽组织增生，加速创面愈合 (Franz MG, Payne WG, Xing L, et al.The use of amnion-derived cellular cytokine solution to improve healing in acute and chronic wound models. Eplasty. 2008 ； 8:e21.)，因此目前有研究者采用羊膜上皮细胞或羊膜来源细胞因子溶液改善创面愈合； 另一方面羊膜天然的基底膜结构和细胞外基质成分可以作为真皮替代物重建真皮支架， 此外研究还发现羊膜基质中含有多种促创面愈合的生物活性因子，能够为表皮细胞、成 纤维细胞的粘附、增殖提供丰富的营养因子，基于此，本发明人在前期研究中制备了含表 皮细胞、成纤维细胞的片状活性皮肤替代物（Huang G，Ji S，Luo P，Liu H，Zhu S，Wang Gj Zhou Pj Xiao Sj Xia Z.Accelerated expansion of epidermal keratinocyte and improved dermal reconstruction achieved by engineered amniotic membrane. Cell Transplant. 2013 ;22 (10) : 1831-44.)，并在此基础上进一步制备了可模拟表皮干细胞生 长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物（Ji SZ，Xiao SC，Luo PF，Huang GF，Wang GY,Zhu SH, et al. An epidermal stem cells niche microenvironment created by engineered human amniotic membrane. Biomaterials2011 ;32 (31) : 7801-11)，此石开究成 果也获得了中国专利CN201110148123. 6,发明名称为"模拟表皮干细胞生长niche微环境 的羊膜微载体及其皮肤替代物"，授权公告号为CN102367434B。
[0004] 然而上述单独采用羊膜上皮细胞或脱细胞羊膜基质用于改善创面愈合的方式均 难以同时有效发挥羊膜分泌活性因子和羊膜天然基质的双重优势。
[0005] 到目前为止，也未曾有将羊膜制备成同时含羊膜上皮细胞及羊膜基质的活性羊膜 微粒构建活性真皮替代物的研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种能同时有效发挥羊膜分泌活性因子和羊膜天然基质 的双重优势的羊膜微粒；本发明的另一目的在于提供含有该羊膜微粒的条件培养基，以及 该羊膜微粒在制备真皮替代物中的应用
[0007] 本发明的主要技术方案如下：
[0008] 本发明通过获取活性羊膜后剥离去除纤维母细胞层和海绵层保留完整的羊膜上 皮细胞和羊膜基质（基底膜和致密层），在此基础上，制备微载体大小的活性羊膜微粒，并 采用无血清干细胞冻存液冻存在液氮中，以长期保存羊膜微粒活性，同时在半年后对羊膜 进行重新检测，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的羊膜进行临床应用，可在有 效保留羊膜上皮细胞活性及天然基质成分的同时，避免疾病传播。
[0009] 本发明制备的含羊膜上皮细胞的活性羊膜微粒不仅保留了羊膜干细胞的分泌特 性，同时能够发挥羊膜天然基质作为真皮替代物的作用，可显著促进创面愈合，改善创面修 复质量。
[0010] 本发明的第一方面，提供了一种负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒，所述 的羊膜微粒的构建方法包括以下步骤：
[0011] A、羊膜的获取
[0012] 经医院伦理委员会批准，产妇知情同意，选择肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均 为阴性的剖腹产妇的新鲜胎盘组织，在无菌条件下钝性分离绒毛膜，剥离去除纤维母细胞 层和海绵层，经含100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、0. 25 μ g/ml两性霉素的phosphate buffered saline (PBS)浸泡冲洗 3 X 15min，将羊膜切割成 4-lOcmX 2_8cm(较优为 8 X 6cm) 大小的片状羊膜。
[0013] B、活性羊膜微粒的制备、冻存、复苏
[0014] 将上述制备的片状羊膜经微粒皮切割机制备成300-600 μ m大小的羊 膜微粒，1000 rpm离心十分钟，去除上清，以微粒Iml: 5ml无血清干细胞冻存液 (CTS?Synth-a_Freeze? Medium, life technology)为比例加入相应干细胞冻存液，将含 有冻存液的羊膜微粒分别放入不同规格大小（如3. 8ml、I. 8ml等）的冷冻管中，将冷冻管 放置于液氮中长期保存备用。
[0015] 根据创面应用需要取出上述冷冻管复苏，置37 tC水浴充分解冻1分钟，PBS反复冲 洗离心3次。
[0016] 本发明的第二方面，提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒在制 备条件培养基中的应用。
[0017] 所述的条件培养基，是指经细胞培养一段时间后获取的含细胞分泌的各种因子的 培养基。
[0018] 进一步地，本发明提供了一种负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒的条件培 养基，其制备方法如下：
[0019] 液氮中取出冻存管后迅速置于37°C水浴充分解冻1分钟，PBS反复冲洗离心3次 后去除上清，以微粒Iml :6ml DMEM培养基为比例加入六孔板中，在37°C、5% 0)2培养箱继 续孵育48h，收集上清，1000 rpm离心十分钟，取上清经0. 2 μπι过滤器过滤后-80°C冰箱冻存 备用。
[0020] 由此获得本发明的活性羊膜微粒条件培养基（conditioned medium，简称CM)。
[0021] 本发明制备的负载固有干细胞的活性羊膜微粒及其条件培养基优点如下：
[0022] 1)羊膜微粒保留了活性羊膜上皮细胞及完整的羊膜基质结构，不仅能够分泌多种 促创面愈合的活性因子，同时其天然的细胞外基质可作为真皮替代物诱导真皮重建，而且 羊膜微粒大小为300-600 μπι，移植创面后，创面血浆能较好渗透至羊膜微粒间，保证羊膜上 皮细胞存活。此外最近研究发现羊膜上皮细胞具有干细胞的多项分化潜能，而且无免疫源 性和致瘤特性，因此被用于各种组织的再生和修复（Toda A, Okabe Μ, Yoshida T，et al. The Potential of Amniotic Membrane/Amnion-Derived Cells for Regeneration of Various Tissues. J PharmacolSci 2007 ; 105 (3) :215 - 228.)，包括皮肤附属器毛囊、皮脂腺等的重 建（Knezevic V. Differentiation potential of rat amnion. JAnat 1996 ； 189 (I):1-7. Fliniaux I, Viallet JP, Dhouailly D, et al.Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation 2004 ;72 (9-10): 558-65·)，本发明制备 的活性羊膜微粒有望在皮肤附属器重建修复中发挥作用。
[0023] 2)采用无血清干细胞冻存液冻存羊膜微粒，可在保留羊膜完整基质成份的同时， 长期保留羊膜上皮细胞活性并可制备富含多种活性因子的条件培养基，而且避免了含血清 冻存液保存可能导致的疾病传播，此外在半年后可对羊膜组织重新检测，进一步排除可能 存在的传染性病毒（肝炎病毒、梅毒、HIV病毒），可有效防止疾病传播。
[0024] 3)本发明中活性羊膜微粒及其条件培养基制备方法简单，临床应用便捷，而且羊 膜上皮细胞活性容易长期保存，避免了羊膜上皮细胞分离培养或脱细胞羊膜基质的制备处 理过程，可有效防止细胞分离培养或羊膜基质制备中导致的细胞、基质损伤，提高了活性羊 膜的应用效率，促进了实验室到临床转化。
[0025] 本发明的第三方面，提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒在制 备创面修复移植材料或软组织缺损填充物中的应用。
[0026] 本发明提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒在制备真皮替代 物中的应用。
[0027] 本发明还提供了上述的负载羊膜固有干细胞的冻存活性羊膜微粒条件培养基在 细胞培养中的应用。
[0028] 所述的细胞培养，具体是指用于创面修复细胞培养中的应用，如人表皮细胞、成纤 维细胞、内皮细胞等。
[0029] 体外实验表明，活性羊膜微粒冻存6个月、2年后进行复苏，复苏后活性羊膜 微粒中羊膜上皮细胞活性分别为73. 4±3. 4 %，66. 35±3. 83 %，明显高于片状羊膜 (55. 63±2. 37%，43. 93±2. 89%，P < 0. 01)。同时活性羊膜微粒条件培养基能明显促进人 表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞的增殖、迀移，明显高于DMEM培养基组（P〈0. 01)。此外糖 尿病小鼠创面（db/db糖尿病小鼠）移植实验发现，本发明制备的负载羊膜固有干细胞的冻 存活性羊膜微粒可以通过调节炎症反应、促进血管化、加快上皮化等多条途径来改善创面 愈合，而且羊膜基质可以作为真皮替代物重塑真皮支架，创面愈合后不仅外观平整、柔软， 收缩程度轻，而且新生表皮出现明显乳突状结构，羊膜微粒逐步降解诱导真皮重建，新生真 皮层胶原纤维排列规则、有序，可明显改善创面愈合质量。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明中活性羊膜微粒和片状羊膜冻存6个月、2年后复苏，Hoechst/PI染 色后荧光镜下观察羊膜上皮细胞活性。（上排是片状羊膜，下排是活性微粒羊膜）
[0031] 图2为采用活性羊膜微粒条件培养基体外培养人表皮细胞（图2A)、成纤维细胞 (图2B)、内皮细胞（图2C)，与10% FBS组（10%胎牛血清组）和DMEM组比较对三种细胞