本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种细胞保存液及该保存液的制备方法和使用方法。
背景技术：
基因的提取是分子生物学检验工作中最基本的应用技术，临床上常用的方法有碘化钠法、酚-氯仿法、Chelex-100法和试剂盒法等。上述这些方法大多使用人全血作为基因提取的标本，采样过程存在一定困难，如采血过程中的安全隐患、血液样本易遭污染、患者拒绝率较高等问题，同时采取血样的成本高、操作较为繁琐，需要具有专业技能的人员进行操作才可靠。因此，探索更为取材简便、操作便捷，同时易于被患者接收的基因采集方法具有非常重要的意义。口腔黏膜上皮细胞的采集十分简便快捷，不仅方便易得，而且基本上无创，患者自行操作即可完成。现有技术中，许多医学领域中人体细胞提取的过程已适用提取口腔细胞进行分析，研究表明，口腔上皮细胞中提取到的DNA数量与质量比较理想，可作为人体细胞分析的样本进行使用。现有技术中口腔细胞提取的过程为：医护人员利用专业的口腔拭子在患者颊粘膜两侧轻刮数次，然后将拭子头置入细胞保存液中，让拭子头上留存的患者细胞落入细胞保存液中，然后将含有患者细胞的细胞保存液密封，最后送到各分析中心。
对于如上述非血液途径获取的细胞，如何维持细胞活性是一项极大的挑战，在短时间内保存细胞并在临床上应用时，往往使用生理盐水来维持细胞活性，然而细胞在生理盐水中活性降低的速度非常快，10小时之内细胞的活性丧失率可达30%甚至更高，然而许多对细胞的观察测试从取样到应用可能需要超过10小时、24小时，甚至多达数天，生理盐水无法满足需求。为了解决这一问题，各类细胞固定液应运而生。细胞保存液是一种能够帮助细胞保持原有形态、结构的一种化学药品，其功能是迅速防止细胞死亡后的变化，防止其自溶、腐败，尽量保持生长状态结构，同时使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其生前的形态，进一步地，好的细胞保存液还可使细胞更便于观察和鉴定。目前市场上有许多不同种类的细胞保存液，不同的厂商拥有自己的保存液配方，许多细胞保存液被用于与测试仪器一同进行销售，价格昂贵。
技术实现要素：
4%的多聚甲醛细胞保存液是使用较多的细胞保存液之一，具有对组织穿透性好、固定均匀的特性。但是，4%多聚甲醛细胞保存液则对细胞保存的时间非常敏感，超过12h以后其保存的细胞活性往往下降较快。针对4%多聚甲醛细胞保存液无法长时间对细胞进行高效保存的问题，本发明中提供了一种以4%多聚甲醛细胞保存液为基础的新的细胞保存液，该保存液不仅大幅提升了对细胞保存的时间，而且制备方法简单、适用范围广泛。
本发明的技术效果通过以下技术方案得以实现：
本发明中提供的一种细胞保存液，为超纯水配制的溶液，该溶液为多聚甲醛保存液，溶液中还包括如下浓度范围的组分：
戊二醛 0.4-0.8wt%
枸橼酸钾 0.05-0.1mol/L
双乙酸钠 0.035-0.15mol/L
六水氯化镁 0.1-0.3mol/L
氯化钠 0.08-0.4mol/L
α-硫辛酸 0.003-0.005mol/L
海藻糖 0.08-0.12mol/L
苦参碱 3-5mg/L
上述多聚甲醛保存液的制备方法为：将多聚甲醛溶解于30-40℃氢氧化钠水溶液中，用超纯水定容制成8wt%的多聚甲醛溶液，然后搅拌滴入0.2-0.3%v/v的焦炭酸二乙酯，持续搅拌至溶液清亮，然后加入PB缓冲液至多聚甲醛质量百分含量为4wt%；
所述细胞保存液的pH值为7.1-7.4，渗透压为290-315mmol/L。
4wt%甲醇溶液对细胞固定效果好，所有的保存液利用超纯水进行配制可有效防止杂质离子的进入，在本发明中，所有配制过程中使用的超纯水的生产时间不超过12小时，以免超纯水变质。在本发明的配方中，枸橼酸钾和双乙酸钠作为协同防腐抗凝剂进行使用，六水氯化镁和氯化钠共同作为缓冲盐。α-硫辛酸是一种抗氧化剂，在本发明的配方中，与其他添加元素协同使用能够有效提升长时间保存后的细胞的活性。苦参碱是来自于苦参、山豆根等中药中的活性成分，是四环喹嗪啶类衍生物，属于生物碱，现代药理研究表明，苦参碱具有抗炎、抗病毒、阻断细胞凋亡、稳定细胞膜等作用。海藻糖作为天然糖类的一种，还能够起到非渗透性低温保护剂的作用，海藻糖还是一种非还原性双糖，具有非常稳定的理化作用，对细胞无任何毒副作用，能够有效稳定细胞膜和蛋白质结构。将海藻糖和苦参碱这两种来自于动植物的活性成分加入细胞保存液中，可有效增强了保护作用。同时，为了消除添加的物质对多聚甲醛对细胞固定能力的影响，添加少量戊二醛与之相匹配使用。
在多聚甲醛保存液的制备过程中，发明人发现现有的制备方法中往往直接将多聚甲醛溶于PB缓冲液或者PBS缓冲液中，由于多聚甲醛难溶于水，所以溶解时间非常长并需要辅助进行加热，往往需要在60℃甚至更高的温度下溶解4小时以上。考虑到上述制备过程中耗时的问题，本发明利用了多聚甲醛难难溶于水但是在碱溶液中溶解速度加快的特点，首先将多聚甲醛溶解于少量的氢氧化钠水溶液中，为进一步提升溶解速度，对碱液进行加热，只需略加热至30-40℃即可。在溶解多聚甲醛的步骤中，使用的氢氧化钠水溶液浓度为5-10wt%，溶解时使用的量不宜过多，能够浸没多聚甲醛使其快速溶解即可，以免影响保存液整体pH值。多聚甲醛溶解后用超纯水定容，然后滴入焦炭酸二乙酯（DEPC），持续搅拌至溶液清亮，最后加入PB缓冲液即可。
本发明中使用PB缓冲液而非PBS缓冲液，其目的是避免引入过多离子，所述PB缓冲液为0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4以体积比1:1.5-4混合配制而成。
进一步地，本发明中细胞保存液还包括0.1-0.2wt/L的氨基酸，所述氨基酸为甘氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸中的一种或多种。氨基酸能够协同保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基酶不被破坏，即延长细胞保存时间。
为保证细胞保存液的纯度，本发明细胞保存液中所用原料都为分析纯。
本发明中还提供一种制备上述细胞保存液的方法，包括如下步骤：
步骤一：按照保存液配方称取多聚甲醛保存液及其他原料；
步骤二：将其他原料倒入多聚甲醛保存液中，搅拌均匀，利用0.2mol/L的NaH2PO4和/或0.2mol/L的Na2HPO4将pH值调整至7.1-7.4；
步骤三：将步骤二中制备得到的溶液灭菌，即得到所需细胞保存液。
本发明还提供一种细胞的保存方法，即利用本发明中的细胞保存液密封静置保存。进一步地，该细胞保存方法尤其适用于对口腔细胞进行保存，保存的细胞浓度为105-108个/ml。
本发明具有如下技术效果：
1、本发明中提供了一种细胞保存时间长、效果好的细胞保存液。
2、本发明中的细胞保存液制备方法简单、适用范围广泛，针对非血液途径获取的细胞，能够在较长时间内有效维持其活性，尤其适用于口腔细胞。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的内容进行进一步的描述。
1、多聚甲醛保存液的制备
将称取的多聚甲醛溶解于38℃的5wt%氢氧化钠水溶液中，然后用超纯水定容制成8wt%的多聚甲醛溶液，然后搅拌滴入0.23%v/v的焦炭酸二乙酯，持续搅拌至溶液清亮，然后加入PB缓冲液至多聚甲醛质量百分含量为4wt%。溶解时使用氢氧化钠溶液的量不宜过多，能够浸没多聚甲醛使其快速溶解即可。利用本实施例中多聚甲醛的保存液的制备方法，比直接用PB缓冲液溶解的方法快2个小时。
本实施例中，使用的PB缓冲液为0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4以体积比1:3.6混合配制而成。
本实施例中配置过程使用的水全部为新制备的超纯水化学试剂为正规试剂生产厂家生产的分析纯试剂。
2、实施例中细胞保存液的制备
多聚甲醛保存液中的添加组分及含量按照下表中的成分含量进行配比：
细胞保存液的制备方法如下：
步骤一：按照保存液配方称取多聚甲醛保存液及其他原料；
步骤二：将其他原料倒入多聚甲醛保存液中，搅拌均匀，利用0.2mol/L的NaH2PO4和/或0.2mol/L的Na2HPO4将pH值调整至7.1-7.4；
步骤三：将步骤二中制备得到的溶液灭菌，即得到所需细胞保存液。
上述实施例中细胞保存液的渗透压均在290-315mmol/L范围内。
3、对比例细胞保存液的制备
4、测试及结果对照
将实施例及对比例中的细胞保存液应用于口腔细胞的保存中。利用同样的取样拭子取人体口腔细胞，细胞浓度在3×106-107个/ml范围内，然后将取样拭子静置密封保存于细胞保存液中，将细胞保存液置于4℃环境中静置密封保存。在保存24h、48h、72h、96h后分别取出细胞，用台盼蓝染色，在显微镜下计数观察存活细胞的数量。
由试验结果可以看出，由本实施例中的细胞保存液保存细胞平超过4天以后，仍旧有非常高的细胞存活率，而且采用本实施例中提供的细胞保存液进行保存的细胞平均活性下降率低。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明实施例的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明实施例的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明实施例技术方案的范围。