红细胞冰冻保存液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于红细胞冻存技术领域，具体涉及红细胞冰冻保存液及其应用。
【背景技术】
[0002] 临床输血工作中，最主要的是输用红细胞制品，其目的是改善临床患者的供氧状 态。在临床输血实践中发现，如果受血者或供血者的血清中存在针对对方红细胞抗原的抗 体，就有可能引起溶血性输血不良反应，表现出血管内或血管外溶血的临床症状，威胁受血 者生命安全。为确保临床输血安全，输血前需对受血者和供血者红细胞血型抗原及抗体进 行检测，避免溶血性输血不良反应的发生。
[0003] 红细胞血型抗体的检测主要是指不规则抗体的检测，目的是为了防止不规则抗体 引起溶血性输血不良反应的发生。由于血型的常规检测并不是对所有血型抗原均进行检 测，存在由未经检测的其它血型抗原刺激免疫系统产生不规则抗体的可能，所以需对不规 则抗体进行检测，并为受血者提供无相应抗原的红细胞，以确保输血安全。
[0004] 用已知的抗原来检测未知的抗体，是免疫学检测的基本方法。根据红细胞血型抗 体检测范围的要求，用于检测未知抗体的红细胞所携带的血型抗原种类应尽可能全面，显 然来源于单一个体的红细胞很难满足以上要求，单一个体的红细胞不可能表达所有的血型 抗原，而且也不可能同时表达相互矛盾的血型抗原，如某一抗原不可能即是阴性，又是阳 性。为满足抗体鉴定对红细胞应尽可能覆盖所有血型抗原的要求，解决的方法只能是选择 多个个体红细胞。通常将用于检测抗体特异性，携有多种血型抗原的多个个体的红细胞称 为红细胞谱细胞（panel cell of erythrocyte)，也称谱红细胞。为保证临床输血的安全， 选择谱红细胞时应满足两个条件：红细胞抗原种类应尽可能地覆盖当地人群所具有的抗 原，并包含临床意义显著的抗原，如含有RhD、RhC、RhE、Rhc、Rhe、M、N、S、s、PU Lea、Leb、K、 k、Fya、Fyb、Jka、Jkb等抗原。
[0005] 制备谱红细胞的要点是收集携带多种抗原的多个红细胞，构成逻辑判断格局的一 组红细胞，需要较长的时间才能完成，其技术关键点在于如何长时间保存不同发现时期的 可用作谱细胞组成的红细胞。冰冻红细胞是长期保存红细胞的有效技术，目前常用的冰冻 保存方法是_80°C或_196°C，这些方法除所需专用的细胞保存液外，还存在以下缺点：①此 类方法需要昂贵的设备，_80°C冻存方法需要专用的超低温冰箱，而_196°C冻存方法需要液 氮冻存设备，长期运行费用很高；②解冻红细胞的过程很长，需要多次洗涤红细胞，红细胞 破碎多，回收率很低。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种红细胞冰冻 保存液，能使红细胞放置于-20°c温度条件下长期保存，加入的组分能提高细胞膜对水的通 透性，减少细胞内冰晶的形成，有效保护红细胞膜；将冰冻的红细胞在室温下化冻，加入解 冻保护液后，可实现红细胞膜内外的生理平衡，避免红细胞膜的破裂，达到红细胞高回收率 的目标。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种红细胞冰冻保存液，包括 以下组分：一水枸橼酸三钾0. 8M，二水磷酸二氢钠0. 4M，十二水磷酸氢二钠0. 2M和20 %~ 60% (V/V)的甘油。
[0008] 本发明还公开了一种红细胞冰冻保存液冰冻保存红细胞的方法，该方法包括以下 步骤：
[0009] 将红细胞和红细胞冰冻保存液充分混合，所述红细胞和冰冻保存液的体积比为 1:1 ;将得到的混合均匀的红细胞-冰冻保存液密封后，低温保存；
[0010] 在需要使用红细胞时，将冰冻保存后的红细胞-冰冻保存液进行解冻处理后回收 得到红细胞；
[0011] 其中，所述红细胞冰冻保存液包括以下组分：一水枸橼酸三钾0. 8M，二水磷酸二 氢钠0. 4M，十二水磷酸氢二钠0. 2M和20 %~60 % (V/V)的甘油。
[0012] 进一步地，红细胞-冰冻保存液的低温保存温度为_20°C。
[0013] 进一步地，解冻保护液包括以下组分：5% (g/V)柠檬酸钠，10%~30% (V/V)的 甘油。
[0014] 进一步地，红细胞冰冻保存液包括以下组分：一水枸橼酸三钾0. 8M，二水磷酸二 氢钠0. 4M，十二水磷酸氢二钠0. 2M和40% (V/V)的甘油。
[0015] 进一步地，解冻保护液包括以下组分：5% (g/V)柠檬酸钠，10% (V/V)的甘油。
[0016] 进一步地，解冻处理的具体过程为：将冰冻保存的红细胞在室温下解冻，然后加入 解冻保护液混合均匀，加入生理盐水后离心处理，得红细胞悬液。
[0017] 进一步地，重复三次如下过程：加入生理盐水后离心处理。
[0018] 本发明红细胞冰冻保存液，可以实现在_20°C温度条件下长期保存红细胞；在冻 存过程中，不需要昂贵的设备；解冻过程为室温下化冻，加入解冻保护液后，即可通过加入 生理盐水洗涤回收红细胞，耗时短，红细胞回收率高。本发明红细胞冰冻保存液的应用，实 现了将小分子碳水化合物导入红细胞中，小分子碳水化合物即为冷冻保存液中的组分，避 免冰晶等因素在冰冻保存过程中对红细胞膜的损伤，在解冻过程中，加入解冻保护液，实现 红细胞膜内外的生理平衡，避免红细胞膜的破裂，达到红细胞高回收率的目标。经检测冰冻 保存后的红细胞的形态未发生改变，红细胞血型抗原没有明显下降。
【附图说明】
[0019] 图1是Iml红细胞经不同配比的冰冻保存液冰冻保存后，解冻后的红细胞溶解情 况图；
[0020] 图2是Iml红细胞经冰冻保存后，解冻后与未经冻存的红细胞的回收率对比图；
[0021] 图3是红细胞经冰冻保存后，解冻后在原子力显微镜下检测的形态图；
[0022] 图4是红细胞经冰冻保存后，解冻后检测A抗原和RhD抗原的凝集情况图； 图5是红细胞经冰冻保存后，解冻后检测A抗原和IgM抗-D单克隆抗体的凝集情况图。
【具体实施方式】
[0023] 取健康自愿者静脉血2ml，EDTA抗凝，用生理盐水洗涤3次，去除血浆成分、白细胞 和血小板。将洗涤后的富集的红细胞按照1:1体积比的比例加入冰冻保存液，充分混合。冰 冻保存液成分包括一水枸橼酸三钾0. 8M，二水磷酸二氢钠0. 4M，十二水磷酸氢二钠0. 2M， 以及20%~60% (V/V)的甘油；解冻保护液的成分包括5% (g/V)柠檬酸钠，10%~30% (V/V)的甘油。经解冻后，观察红细胞的溶解情况。
[0024] 如图1所示，图中0号试管为红细胞中加入水的全破裂对照，为对比例1 ;1号和2 号试管中为红细胞中加入生理盐水的正常对照，为对比例2和对比例3 ;3号试管中为加入 实施例1中的冰冻保存液和解冻保护液的解冻后的红细胞状态；4号试管中为加入实施例 2中冰冻保存液和解冻保护液的解冻后的红细胞状态；5号试管中为使用实施例3中的冰冻 保存液和解冻保护液的状态；6号试管中为使用实施例4中的冰冻保存液和解冻保护液的 状态；7号试管中为使用实施例5中的冰冻保存液的状态。从图中可见，采用实施例1 一实 施例5中的红细胞冰冻保存液冻存红细胞后，红细胞破坏较少，其中以实施例3中的红细胞 破坏最少，上清液透明清亮。
[0025] 表1实施例和对比例参数表（其中解冻保护液的组分一定）
[0026]
【主权项】
1. 一种红细胞冰冻保存液，其特征在于，包括以下组分：一水枸橼酸三钾0. 8M，二水磷 酸二氢钠0.41?，十二水磷酸氢二钠0.21和20%~60%(￥/￥)的甘油。
2. -种红细胞冰冻保存液冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： 将红细胞和红细胞冰冻保存液充分混合，所述红细胞和冰冻保存液的体积比为1:1 ; 将得到的混合均匀的红细胞-冰冻保存液密封后，低温保存； 在需要使用红细胞时，将冰冻保存后的红细胞-冰冻保存液进行解冻处理后回收得到 红细胞； 其中，所述红细胞冰冻保存液包括以下组分：一水枸橼酸三钾〇. 8M，二水磷酸二氢钠 0.41?，十二水磷酸氢二钠0.21和20%~60%(￥/￥)的甘油。
3. 按照权利要求2所述的一种冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，所述红细胞-冰冻 保存液的低温保存温度为-20 °C。
4. 按照权利要求2或3所述的一种冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，所述解冻保护 液包括以下组分：5% (g/V)柠檬酸钠，10%~30% (V/V)的甘油。
5. 按照权利要求2或3所述的一种冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，所述红细胞冰 冻保存液包括以下组分：一水枸橼酸三钾〇. 8M，二水磷酸二氢钠0. 4M，十二水磷酸氢二钠 0· 2M 和 40% (V/V)的甘油。
6. 按照权利要求5所述的一种冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，所述解冻保护液 包括以下组分：5% (g/V)柠檬酸钠，10% (V/V)的甘油。
7. 按照权利要求2或3所述的一种冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，所述解冻处理 的具体过程为：将冻保存的红细胞在室温下解冻，然后加入解冻保护液混合均匀，加入生理 盐水后离心处理，得红细胞悬液。
8. 按照权利要求7所述的一种冰冻保存红细胞的方法，其特征在于，重复三次如下过 程：加入生理盐水后离心处理。
【专利摘要】本发明公开了一种红细胞冰冻保存液，包括以下组分：一水枸橼酸三钾0.8M，二水磷酸二氢钠0.4M，十二水磷酸氢二钠0.2M和体积浓度为20％～60％的甘油。能使红细胞放置于-20℃温度条件下长期保存，加入的组分能提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，有效保护红细胞膜；在室温下化冻，加入解冻保护液后，可实现红细胞膜内外的生理平衡，避免红细胞膜的破裂，达到红细胞高回收率的目标。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104705287
【申请号】CN201510047839
【发明人】王宝燕, 万春晶, 王袁, 徐华, 许亚莉
【申请人】王宝燕
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年1月30日