用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒，包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，装有荧光标记的单克隆抗体CD45的试剂管、装有荧光标记的单克隆抗体CD9的试剂管、装有荧光标记的单克隆抗体CD81的试剂管、装有荧光标记的单克隆抗体CD56的试剂管、装有红细胞裂解液的试剂管和装有PBS缓冲液的试剂管被设置在所述小孔内。该试剂盒结构简单、设计合理，在使用时检测速度快、操作方法简单，检测灵敏度高，适于在临床广泛推广应用。
【专利说明】用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物【技术领域】，涉及一种用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒。
【背景技术】
[0002]神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)是儿童最常见的颉外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤。有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。神经母细胞瘤属于神经内分泌性肿瘤，可以起源于交感神经系统的任意神经脊部位。其最常见的发生部位是肾上腺，但也可以发生在颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织。对于神经母细胞瘤的发病原因尚不清楚。一些遗传易感因素被发现与神经母细胞瘤的发病相关。家族型神经母细胞瘤被证明与间变淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)的体细胞突变(somaticmutation)所导致。此外,在神经母细胞瘤还发现有许多分子突变。N_myc基因的扩增突变在神经母细胞瘤也很常见。其扩增类型呈双向分布:在一个极端为3-10倍扩增，在另一个极端为100-300倍扩增。N-myc基因的扩增突变往往与肿瘤的扩散相关。LMOl基因被证明与肿瘤的恶性程度相关。目前认为神经母细胞瘤的病因是以上因素互相作用导致的。
[0003]目前，神经母细胞瘤的诊断及检测方法主要有影像学检测法、骨髓形态学检测法、检测尿VMA/AVA，VMA及HVA、骨髓或组织活检；这些诊断、检测方法的优缺点如下:
[0004]影像学检测法:间位腆代苄胍与放射性物质如碘-131或者是碘-123耦联后，即可作为放射性药物而用于神经母细胞瘤的诊断以及疗效监测。但不能判断肿瘤病理类型，而且碘-131、碘-123耦联有放射性对身体有害。
[0005]骨髓形态学检测法:能见到密集成巢或小叶性分布，成菊花状、环状，其细胞成分不一，分化程度不等，但单个弥散分布的NB细胞体积形态与急淋、急粒细胞相似，不仔细观察极易误诊。而且通常只看200-500个细胞，检测灵敏度低。
[0006]检测尿VMA/AVA，VMA及HVA:神经母细胞瘤时儿茶酚胺合成增加，故其代谢物尿VMA/HVA增加。可用分光光度法、层析法检测，但尿液中有大量的化合物，尤其是苯酣类、酸性酣和芳香环化合物的代谢物。能干扰结果，而且分光光度法特异性较差。
[0007]骨髓或组织活检:免疫组化学检查显微镜下，神经母细胞瘤呈现为蓝染的小圆形细胞，菊花形排列。肿瘤细胞围绕神经毡(neuropil)呈菊花形排列，其他还有一些神经母细胞瘤所特异的免疫组化染色，用以与其他肿瘤(尤因肉瘤，淋巴瘤等)进行鉴别诊断。但操作复杂，对患者损伤较大。
[0008]临床急需一种检测速度快，而且灵敏度高的检测技术的出现，更有利于患者的及时诊治。
实用新型内容
[0009]为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒，可以快速、简便、高灵敏度地检测神经母细胞瘤微小残留。[0010]为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是:一种用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒，包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有荧光标记的单克隆抗体CD45的试剂管(4)、装有荧光标记的单克隆抗体CD9的试剂管(5)、装有荧光标记的单克隆抗体CD81的试剂管(6)、装有荧光标记的单克隆抗体CD56的试剂管(7)、装有红细胞裂解液的试剂管(8)和装有PBS缓冲液的试剂管(9)被设置在所述小孔内。
[0011]其中，上述单克隆抗体使用不同的荧光标记；优选地，单克隆抗体⑶45使用PerCP标记，单克隆抗体CD9使用FITC标记，单克隆抗体CD81使用PE标记，单克隆抗体CD56使用APC标记。
[0012]其中，所述红细胞裂解液和所述PBS缓冲液均为本领域常规试剂。
[0013]其中，所述衬垫(3)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
[0014]通过以上技术方案，本实用新型的有益效果如下:
[0015](I)本实用新型的试剂盒结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染。
[0016](2)本实用新型的试剂盒在使用时，检测速度快、操作方法简单，检测灵敏度高，检测中受检测者主观因素的影响小，特别是可以准确检测已经确诊并经过治疗之后残留的神经母细胞瘤病灶，适于在临床广泛推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本实用新型的结构示意图；
[0018]在该图中，1-盒体，2-盒盖，3-衬垫，4-装有荧光标记的单克隆抗体⑶45的试剂管，5-装有荧光标记的单克隆抗体CD9的试剂管，6-装有荧光标记的单克隆抗体CD81的试剂管，7-装有荧光标记的单克隆抗体CD56的试剂管，8-装有红细胞裂解液的试剂管，9-装有PBS缓冲液的试剂管。
[0019]图2是是正常人⑶56、⑶9、⑶81表达情况的示意图；
[0020]图3是神经母细胞瘤患者治疗之后⑶56、⑶9、⑶81表达情况的示意图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本实用新型的【具体实施方式】作进一步描述，本实用新型的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围构成任何限制。
[0022]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024]如图1所示，本实用新型提供了一种用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒，包括盒体1、盒盖2和设置在盒体I内的衬垫3，所述衬垫3上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫3上分成两排平行排列,装有荧光标记的单克隆抗体CD45的试剂管4、装有荧光标记的单克隆抗体CD9的试剂管5、装有荧光标记的单克隆抗体CD81的试剂管6、装有荧光标记的单克隆抗体CD56的试剂管7、装有红细胞裂解液的试剂管8和装有PBS缓冲液的试剂管9被设置在所述小孔内。[0025]其中，单克隆抗体⑶45使用PerCP标记，单克隆抗体⑶9使用FITC标记，单克隆抗体⑶81使用PE标记，单克隆抗体⑶56使用APC标记；优选的，上述荧光标记的单克隆抗体均购自BD公司。
[0026]其中，所述红细胞裂解液购自美国BD公司，所述PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0027]检测步骤如下:
[0028](I)取两支流式专用管，分别编号为I号管和2号管，向I号管加入CD45-PerCP20 ii 1，向 2 号管加入 CD45_PerCP20 y 1、CD9-FITC20 y 1、CD81_PE20ii 1、CD56-APC5 uI ；
[0029](2)对待检测的骨髓标本进行白细胞计数，将细胞浓度调至3X107/ml，向每个管内分别加入待检测的骨髓标本70iU，低速涡旋混匀，2°C至8°C避光孵育20分钟；
[0030](3)向每个管内分别加入红细胞裂解液1ml，低速涡旋混匀，在2°C至8°C避光裂解红细胞10分钟；
[0031](4)裂解结束后立即以1500转/分钟离心5分钟，离心结束后弃上清，然后向各管内加入Iml PBS，低速涡旋混匀，以1500转/分钟离心5分钟；离心结束后弃上清，向各管内加入0.5ml PBS重悬，低速涡旋混匀，24h内使用流式细胞仪上机检测；
[0032](5)在检测时，调节好个通道电压，使淋巴细胞平均荧光强度在104，收集Pl门内细胞100万，应用BD FACSDive软件分析数据。
[0033]检测结果如下:
[0034]数据以散点图形式显示，如出现成群⑶45阴性⑶56阳/强阳的细胞群，表明有神经母细胞残留细胞。
[0035]如图2和图3所示，图2是是正常人⑶56、CD9、CD81表达情况，未见CD45阴性⑶56阳/强阳的细胞，图3是神经母细胞瘤患者治疗之后⑶56、⑶9、⑶81表达情况，见大量CD45阴性CD56阳/强阳的细胞。
[0036]上面已经举例说明了本实用新型的实施例，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本实用新型的精神和范围下可以对本实用新型技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本实用新型的保护范围内。
【权利要求】
1.一种用于检测神经母细胞瘤微小残留的试剂盒，其特征在于:包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有荧光标记的单克隆抗体CD45的试剂管(4)、装有荧光标记的单克隆抗体CD9的试剂管(5)、装有荧光标记的单克隆抗体CD81的试剂管(6)、装有荧光标记的单克隆抗体CD56的试剂管(7)、装有红细胞裂解液的试剂管(8)和装有PBS缓冲液的试剂管(9)被设置在所述小孔内。
2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述单克隆抗体使用不同的荧光标记，其中，单克隆抗体CD45使用PerCP标记，单克隆抗体CD9使用FITC标记，单克隆抗体CD81使用PE标记，单克隆抗体⑶56使用APC标记。
3.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述衬垫(3)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(3 )上分成两排平行排列。
【文档编号】G01N33/577GK203535054SQ201320688913
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】王显凤, 秦晓明, 吴纯斌, 刘丽媛, 王绪华, 梁超, 方国伟, 黄士昂, 陈忠 申请人:北京海思特临床检验所有限公司