一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法
【专利摘要】一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，涉及乳酸。将菌种接入含甘油的种子培养基中培养得种子液，再接入含甘油的扩大培养液扩大培养，流加碱溶液将扩大培养液的pH值控制在4.5～7.5，当扩大培养液中的菌体细胞浓度达到1.0～15.0g/L时，利用泵将扩大培养液泵入反应器内，当扩大培养液完全充满反应器后，维持扩大培养液在发酵罐和反应器中的循环，当游离菌体细胞浓度降至最低点时，视为固定化过程结束；菌体细胞固定化完成后，加入含甘油的发酵培养基控制初始甘油浓度为5～200g/L，或直接更换初始甘油浓度为5～200g/L的发酵培养基，进行固定化发酵后得乳酸。
【专利说明】—种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及乳酸，尤其是涉及一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法。
【背景技术】 [0002]乳酸，学名-羟基丙酸，可按其旋光性分为L型、D型和DL型。乳酸是一种十分重要的有机酸，可广泛用于食品、制药、纺织、印染、化妆品等领域。以乳酸为原料合成的聚乳酸(PLA)是一种强度高、可塑性强、环境友好的有机高分子材料，高品质的聚乳酸可用于医用手术缝合线、骨骼固定材料、组织缺损部位补强材料等，具有很好的生物相容性；较低品质的聚乳酸可用于农用大棚、一次性饭盒等，可在自然环境下被微生物降解，被认为是极佳的塑料替代品。随着对乳酸及其衍生物的研究越来越广泛和深入，乳酸的需求量也随之不断增加。
[0003]目前，乳酸的生产方法主要有化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。化学合成法的乳酸产品光学纯度低，且使用的原料具有很强的毒性；酶催化法生产乳酸条件苛刻、成本很高，很难实现工业化生产；微生物发酵法生产乳酸，其原料来源广泛、能耗小、安全性好，并且可以通过菌种的选育或控制其代谢途径来获得高光学纯度的乳酸，故微生物发酵法在世界范围内成为生产乳酸的主要方法。
[0004]21世纪，石油供需矛盾日益尖锐，石油化工及石化燃料燃烧造成的环境问题日益突出，开发新的对环境无害的可再生能源日益得到各国的重视。生物柴油是一种环境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年来，生物柴油产业迅速崛起，蓬勃发展，而甘油是生物柴油生产过程中的主要副产物，每生产I吨生物柴油会同时产生0.1吨粗甘油。随着世界范围内生物柴油需求量和生产量的迅猛增长，其副产物粗甘油成为丰富而廉价的原料，对它的有效利用也成为紧迫的课题。同时，传统乳酸发酵产业的主要原料葡萄糖、淀粉等糖质原料的成本不断增加，使得乳酸产业受到很大的原料成本压力。因此利用廉价的粗甘油生产高附加值的乳酸逐渐成为新的研究方向。目前，国内外利用微生物转化甘油生产乳酸的研究较少，其中清华大学的学者利用大肠杆菌可以以纯甘油为底物发酵得到85.8g/L的乳酸(洪安安，程可可，孙燕，等.代谢甘油高产乳酸的菌种选育及培养基优化[J].微生物学通报，2009，36 (8): 1195-1199)。但是，运用传统发酵工艺，直接以甘油作为原料发酵乳酸往往存在着底物抑制严重、生物量低、生产强度低等问题，限制了微生物转化甘油生产乳酸的工业化应用。
[0005]纤维床生物反应器(FBB)是在传统填充床反应器基础上改进设计出的一种简单、高效的生物反应器，尤其适用于厌氧或微氧条件下的微生物固定化发酵。纤维床生物反应器选择棉纤维织物等纤维材料作为固定菌体细胞的基质，具有以下优点:①材料化学惰性，不会对菌体细胞有毒害作用，也不会被菌体所降解，不影响菌体在发酵过程中的生长情况；②具有较高的比表面积和空隙率，传质性能良好；③单位体积可固定的细胞数量多；④价格便宜，易获得，固定化成本低制备方法简单，适合工业放大；⑥有较好的机械强度，能经受较长时间的使用；⑦稳定性好。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供可资源化利用廉价的生物柴油副产物粗甘油，降低乳酸发酵的原料成本，提高单位操作体积菌体密度，省去重复的菌种活化与接种等操作，提高乳酸生产强度的一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法。
[0007]本发明包括以下步骤:
[0008]I)将菌种接入含甘油的种子培养基中培养，得到种子液；
[0009]2)将种子液接入含甘油的扩大培养液，在发酵罐中进行扩大培养，同时用补料装置流加碱溶液将扩大培养液的PH值控制在4.5~7.5的范围内，培养过程中测定培养液中的菌体浓度；
[0010]3)当扩大培养液中的菌体细胞浓度达到1.0~15.0g/L时，利用泵将扩大培养液泵入纤维床生物反应器内，当扩大培养液完全充满纤维床生物反应器后，维持扩大培养液在发酵罐和纤维床生物反应器中的循环，菌体细胞固定化过程中测定扩大培养液中游离菌体细胞的浓度，当游离菌体细胞浓度降至最低点时，视为固定化过程结束；
[0011]4)菌体细胞固定化完成后，加入含甘油的发酵培养基控制初始甘油浓度为5~200g/L，或直接更换初始甘油浓度为5~200g/L的发酵培养基，进行固定化发酵后，得到乳酸。
[0012]在步骤I)中，所述菌种为戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) R3-8,该菌种已于2011年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，该保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.4726 ；
[0013]所述菌种接入含甘油的种子培养基中的接种量按质量百分比可为1%~15% ;所述种子培养基(/L)的组成为甘油40g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，乙酸钠6g，K2HPO4L 5g，pH6.5 ；所述培养的条件可为30~45°C培养5~25h。
[0014]在步骤2)中，所述甘油的浓度可为20~80g/L，所述扩大培养液(/L)的组成可为甘油40g，酵母粉6g，胰蛋白胨IOg,乙酸钠6g，K2HPO4L 5g，MnCl2 -H2O0.15g，消泡剂0.05g,pH6.0~6.2 ;所述扩大培养的条件可为:培养温度为30~45°C，搅拌速率为50~350rpm，并利用通气装置通入O~1.0vvm的空气；所述碱溶液的摩尔浓度可为4~7M。
[0015]在步骤3)中，所述固定化过程中，培养温度可为25~45°C，搅拌速率可为O~550rpm,并通入O~2.0vvm的空气，同时流加4~7M碱溶液将培养液的pH值控制在4.5~
7.5的范围内。
[0016]在步骤4)中，所述发酵培养基(/L)的组成可为甘油60g，酵母粉6g，胰蛋白胨10g，乙酸钠6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡剂0.05g, ρΗ6.0~6.2 ;所述固定化发酵过程中，发酵温度为25~45°C，通入O~2.0vvm的空气，同时流加4~8M碱溶液将发酵液的pH值控制在4.5~7.5的范围内。
[0017]本发明固定化发酵生产乳酸的底物，既可来源于生物柴油生产过程中的副产物粗甘油、化学法生产的粗甘油或生物发酵法生产的粗甘油等。
[0018]本发明固定化 发酵生产乳酸的底物为各行业所得的粗甘油，只需进行简单的分离提纯或直接利用，不需要精制成甘油纯品。[0019]本发明固定化发酵生产乳酸所使用的纤维床生物反应器是由同心式内、外圆筒构成的带夹层的填充柱体。
[0020]本发明固定化发酵生产乳酸所使用的纤维床生物反应器的夹层中通循环水控制温度，内圆筒中填充棉纤维织物作为填充基质，不锈钢丝网为支撑材料。
[0021]本发明的优点在于:
[0022]I)本发明将廉价的生物柴油副产物甘油资源化利用，进一步转化为高附加值的乳酸，有效利用甘油，从而延长了生物柴油的产业链，可用于生物柴油和乳酸的联产。
[0023]2)本发明利用纤维床生物反应器固定化菌体细胞，进行乳酸的发酵，较之传统发酵工艺，可显著提高微生物转化甘油发酵生产乳酸的生产强度，同时省去反复的菌种活化、接种、扩大培养以及清洗发酵罐体等工序，大大简化了操作流程，提高了生产效率。
[0024]3)本发明所使用的固定化装置结构简单、成本低、固定化效果好，有利于工业放大；且该装置可连续长期稳定运行，有利于工业化连续生产。
[0025]4)本发明所使用的底物甘油无需严苛的精制纯化，节省了原料的提纯分离费用。
[0026]5)本发明所使用的戊糖乳杆菌是一种益生菌，产品乳酸无生物安全性方面的隐
串
[0027]6)本发明所使用的发酵培养基可以不进行灭菌，直接用于发酵，从而减少了能耗，进一步降低生产成本。
[0028]7)本发明利用纤维床生物反应器固定化细胞直接转化甘油(包括未精制的化学法、生物发酵法生产的甘油及生物柴油产业的副产物粗甘油)发酵生产乳酸的工艺技术，用于提升以甘油为底物发酵乳酸的生产强度。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为本发明所用的利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的发酵装置示意图。其中:1.发酵罐；2.纤维床生物反应器；3.泵；4.通气装置；5.补料装置。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例将对本发明作进一步说明。
[0031]实施例1:
[0032]本实施例给出的是以生物柴油副产物粗甘油为原料进行纤维床生物反应器固定化戊糖乳杆菌批次发酵乳酸的工艺:
[0033]1.培养基(培养基中所加甘油均为生物柴油副产物粗甘油，培养基中的甘油浓度是指所加粗甘油中所含甘油的浓度):
[0034]I)种子培养基(/L):
[0035]甘油40g,酵母粉5g,胰蛋白胨IOg,乙酸钠6g, K2HPO4L 5g, pH6.5 ；
[0036]2)扩大培养液(/L):甘油40g，酵母粉6g，胰蛋白胨10g，乙酸钠6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g,消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0037]3)发酵培养基(/L ):
[0038]甘油60g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸钠 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;[0039]2.菌种:戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) R3-8 ;
[0040]3.发酵过程:
[0041]I)将戊糖乳杆菌接入种子培养基中(250mL三角瓶，装液量IOOmL),培养温度34°C，摇床转速150rpm，培养12h，得到种子液；
[0042]2)扩大培养使用5L搅拌式发酵罐，装入2L扩大培养液，将种子液以10%的接种量接入，培养温度为34°C，以6M氨水控制培养液pH为6.0，通入0.3vvm的空气，搅拌转速250rpm,进行扩大培养,过程中测定菌体浓度；
[0043]3)当培养液中菌体浓度达到lg/L时，利用蠕动泵以160mL/min的流速将培养液泵入如图1所示的纤维床生物反应器内，充满反应器后将泵的流速降为16mL/min保持循环，进行菌体细胞的固定化，固定化过程中，过程中保持温度为34°C，以6M氨水控制pH为6.0，通入0.3vvm的空气,搅拌转速250rpm,同时测定游离的菌体浓度，当菌体浓度下降至最低点时，视为固定化过程结束；图1中搅拌式发酵罐I通过管路连接带有恒温循环水夹套的亚克力材质纤维床固定化装置(50_X345mm),内部填充的固定化基质为700_X300_的棉纤维织物(厚约2_)，以不锈钢丝网固定成螺旋状，置于纤维床生物反应器2柱体内，反应器柱体底部装有布流器，使发酵液进入柱体时分布均匀，纤维床生物反应器的实际工作体积为468mL ；
[0044]4)停止循环，并利用泵3将发酵罐I和纤维床生物反应器2中的培养液泵出，并立即加入2L新鲜发酵培养基，保持发酵液在发酵罐I和纤维床生物反应器2中循环，发酵温度为34°C，以6M氨水控制发酵液pH为6.0，利用通气装置4通入0.3vvm的空气，搅拌转速250rpm,进行固定化发酵,过程中测定发酵液中的菌体浓度、甘油浓度和乳酸浓度，当发酵液中甘油浓度降至10g/L以下时，视为固定化批次发酵结束。在图1中，标记5为补料装置。
[0045]4.检测方法:
[0046]采用高效液相色谱(AgilentllOOSeries HPLC,北京安捷伦公司，Aminex-HPX_87H色谱柱)检测甘油浓度，采用生化分析仪(Bioprofile300, Nova)测定乳酸浓度。
[0047]5.发酵结果:
[0048]批次发酵33.4h后，发酵液中乳酸浓度为50.2g/L，乳酸对甘油的质量得率为0.960，乳酸生产强度达到1.50g/L/h。
[0049]实施例2:
[0050]本实施例给出的是以生物柴油副产物粗甘油为原料进行纤维床生物反应器固定化戊糖乳杆菌补料批次发酵乳酸的工艺:
[0051]1.培养基(培养基中所加甘油均为生物柴油副产物粗甘油，培养基中的甘油浓度是指所加粗甘油中所含甘油的浓度):
[0052]I)种子培养基(/L):
[0053]甘油40g,酵母粉5g,胰蛋白胨IOg,乙酸钠6g, K2HPO4L 5g, pH6.5 ；
[0054]2)扩大培养液(/L):
[0055]甘油40g,酵母粉 6g,胰蛋白胨 IOg,乙酸钠 6g, K2HPO4L 5g, MnCl2.H2O0.15g,消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0056]3)初始发酵培养基(/L):[0057]甘油60g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸钠 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0058]2.菌种:戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus R3-8)
[0059]3.发酵过程:
[0060]I)将戊糖乳杆菌接入种子培养基中(250mL三角瓶，装液量IOOmL),培养温度34°C，摇床转速150rpm，培养12h，得到种子液；
[0061]2)扩大培养使用5L搅拌式发酵罐，装入2L扩大培养液，将种子液以10%的接种量接入，培养温度为34°C，以6M氨水控制培养液pH为6.0，通入0.3vvm的空气，搅拌转速250rpm,进行扩大培养,过程中测定菌体浓度；
[0062]3)当培养液中菌体浓度达到lg/L时，利用蠕动泵以160mL/min的流速将培养液泵入如图1所示的纤维床生物反应器内，充满反应器后将泵的流速降为16mL/min保持循环，进行菌体细胞的固定化，固定化过程中，过程中保持温度为34°C，以6M氨水控制pH为6.0，通入0.3vvm的空气,搅拌转速250rpm,同时测定游离的菌体浓度，当菌体浓度下降至最低点时，视为固定化过程结束；
[0063]4)停止循环，并利用泵将发酵罐和纤维床生物反应器中的培养液泵出，并立即加入2L新鲜初始发酵培养基，保持发酵液在发酵罐和纤维床生物反应器中循环，发酵温度为34°C,以6M氨水控制发酵液pH为6.0,通入0.3vvm的空气,搅拌转速250rpm,进行固定化发酵，过程中测定发酵液中的菌体浓度、甘油浓度和乳酸浓度，当发酵液中甘油浓度降至IOg/L以下时，向发酵罐中流加IL粗甘油水溶液(其中甘油含量为250g/L)，直至发酵产物乳酸的浓度增长速率小于0.lg/L/h，视为固定化补料批次发酵结束。
[0064]4.检测方法同实施例1。
[0065]5.发酵结果:
[0066]发酵145.5h后，发酵液中乳酸浓度为88.5g/L，乳酸对甘油的质量得率为0.871，乳酸生产强度为0.6lg/L/h。
[0067]实施例3:
[0068]本实施例给出的是以生物柴油副产物粗甘油为原料进行纤维床生物反应器固定化戊糖乳杆菌反复批次发酵乳酸的工艺:
[0069]1.培养基(培养基中所加甘油均为生物柴油副产物粗甘油，培养基中的甘油浓度是指所加粗甘油中所含甘油的浓度):
[0070]1)种子培养基(/L):
[0071]甘油40g,酵母粉5g,胰蛋白胨IOg,乙酸钠6g, K2HPO4L 5g, pH6.5 ；
[0072]2)扩大培养液(/L):
[0073]甘油40g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸钠 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0074]3)发酵培养基(/L ):
[0075]甘油60g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 10g，乙酸钠 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2 ;
[0076]2.菌种:戍糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) R3-8 ;
[0077]3.发酵过程:[0078]I)将戊糖乳杆菌接入种子培养基中(250mL三角瓶，装液量IOOmL),培养温度34°C，摇床转速150rpm，培养12h，得到种子液；
[0079]2)扩大培养使用5L搅拌式发酵罐，装入2L扩大培养液，将种子液以10%的接种量接入，培养温度为34°C，以6M氨水控制培养液pH为6.0，通入0.3vvm的空气，搅拌转速250rpm,进行扩大培养,过程中测定菌体浓度； [0080]3)当培养液中菌体浓度达到lg/L时，利用蠕动泵以160mL/min的流速将培养液泵入如图1所示的纤维床生物反应器内，充满反应器后将泵的流速降为16mL/min保持循环，进行菌体细胞的固定化，固定化过程中，过程中保持温度为34°C，以6M氨水控制pH为6.0，通入0.3vvm的空气,搅拌转速250rpm,同时测定游离的菌体浓度，当菌体浓度下降至最低点时，视为固定化过程结束；
[0081]4)停止循环，并利用泵将发酵罐和纤维床生物反应器中的培养液泵出，并立即加入2L新鲜发酵培养基，保持发酵液在发酵罐和纤维床生物反应器中循环，发酵温度为34°C,以6M氨水控制发酵液pH为6.0,通入0.3vvm的空气,搅拌转速250rpm,进行固定化发酵，过程中测定发酵液中的菌体浓度、甘油浓度和乳酸浓度，当发酵液中甘油浓度降至IOg/L以下时，视为单个固定化批次发酵结束；
[0082]5)将发酵罐和纤维床生物反应器中上一批次的发酵液全部泵出，立即加入下一批次的发酵培养基，发酵参数同步骤4)，本实施例共连续反复进行了 5个批次发酵。
[0083]4.检测方法同实施例1。
[0084]5.发酵结果:
[0085]反复5个批次发酵平均发酵时间为31.2h，平均乳酸终浓度为50.6g/L，平均乳酸对甘油质量得率为0.968，平均乳酸生产强度为1.626g/L/h。
[0086]表1
[0087]
【权利要求】
1.一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将菌种接入含甘油的种子培养基中培养，得到种子液；所述菌种为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus) R3-8,该菌种已于2011年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.4726 ； 2)将种子液接入含甘油的扩大培养液，在发酵罐中进行扩大培养，同时用补料装置流加碱溶液将扩大培养液的PH值控制在4.5~7.5的范围内，培养过程中测定培养液中的菌体浓度； 3)当扩大培养液中的菌体细胞浓度达到1.0~15.0g/L时，利用泵将扩大培养液泵入纤维床生物反应器内，当扩大培养液完全充满纤维床生物反应器后，维持扩大培养液在发酵罐和纤维床生物反应器中的循环，菌体细胞固定化过程中测定扩大培养液中游离菌体细胞的浓度，当游离菌体细胞浓度降至最低点时，视为固定化过程结束； 4)菌体细胞固定化完成后，加入含甘油的发酵培养基控制初始甘油浓度为5~200g/L，或直接更换初始甘油浓度为5~200g/L的发酵培养基，进行固定化发酵后，得到乳酸。
2.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤I)中，所述菌种接入含甘油的种子培养基中的接种量按质量百分比为1%~15%;所述种子培养基(/L)的组成为甘油40g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，乙酸钠6g，K2HPO4L 5g，pH6.5。
3.如权利要求1所述 一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤I)中，所述培养的条件为30~45°C培养5~25h。
4.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤2)中，所述甘油的浓度为20~80g/L，所述扩大培养液(/L)的组成可为甘油40g，酵母粉 6g，胰蛋白胨 IOg,乙酸钠 6g，K2HPO4L 5g，MnCl2.H2O0.15g，消泡剂 0.05g，ρΗ6.0 ~6.2。
5.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤2)中，所述扩大培养的条件为:培养温度为30~45°C，搅拌速率为50~350rpm，并利用通气装置通入O~1.0vvm的空气；所述碱溶液的摩尔浓度可为4~7M。
6.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤3)中，所述固定化过程中，培养温度为25~45°C，搅拌速率为O~550rpm，并通入O~2.0vvm的空气，同时流加4~7M碱溶液将培养液的pH值控制在4.5~7.5的范围内。
7.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤3)中，所述纤维床生物反应器是由同心式内、外圆筒构成的带夹层的填充柱体，夹层中通循环水控制温度，内圆筒中填充棉纤维织物作为填充基质，不锈钢丝网为支撑材料。
8.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵培养基(/L)的组成为甘油60g，酵母粉6g，胰蛋白胨10g，乙酸钠6g，K2HPO4L 5g, MnCl2.H2O0.15g,消泡剂 0.05g, ρΗ6.0 ~6.2。
9.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于在步骤4)中，所述固定化发酵过程中，发酵温度为25~45°C，通入O~2.0vvm的空气，同时流加4~8M碱溶液将发酵液的pH值控制在4.5~7.5的范围内。
10.如权利要求1所述一种利用固定化细胞转化甘油生产乳酸的方法，其特征在于所述甘油来源于生物柴油生产过程中的副产物粗甘油、化学法生产的粗甘油或生物发酵法生产的粗甘油。
【文档编号】C12N11/12GK103555777SQ201310576790
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】方柏山, 严正平 申请人:厦门大学