专利名称：一种转化甘油制备乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种乳酸，尤其是涉及一种转化甘油制备乳酸的方法。
背景技术：
乳酸，学名为α -羟基丙酸，分子式为C2H5OCOOH,是一种重要的、多用途的生物基平台化合物，被广泛应用于食品、医药、日用化工和有机化工等领域，其中最重要的工业应用是用于合成可降解聚合物——聚乳酸(PLA)。这种高分子材料不仅具有良好的化学惰性和易加工性，而且具有良好的生物相容性，广泛用于制造人造骨骼、手术缝合线、包装材料、 日用塑料制品、农用地膜、家用装饰品等物品。目前，乳酸的合成方法主要有三种，即化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法制备乳酸具有原料来源广泛、生产成本低、 产品光学纯度高等优点，是生产乳酸的主要方法，在全球乳酸生产中，仅有10%是由化学合成法生产的，其余90 %都是由微生物发酵法生产。21世纪，石油供需矛盾日益尖锐，石油化工及石化燃料燃烧造成的环境问题日益突出，开发新的对环境无害的可再生能源日益得到各国的重视。生物柴油是一种环境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年来，生物柴油产业异军突起，飞速发展，而废甘油是生物柴油生产过程中的主要副产物，每生产1吨生物柴油会副产0. 1吨废甘油。随着世界范围内生物柴油需求量和生产量的迅猛增长，废甘油成为丰富而廉价的原料，对它的有效利用也成为紧迫的课题。目前，以甘油为原料制备乳酸主要有两种方法1.化学法转化甘油制备乳酸中国专利200810057540. 8公开了一种化学法转化甘油制备乳酸的方法，其特点是以甘油为原料，在反应压力为1 15atm、反应温度为20 140°C、反应时间为0. 5 48h，在催化剂和氧化剂存在的碱性条件下，反应得到乳酸。该方法需要使用贵金属作为催化剂，生产成本较高，另外反应过程中需要大量使用碱，会对环境造成污染。2.微生物发酵甘油制备乳酸中国专利20081010 . 4公开了一种微生物发酵甘油制备乳酸的方法，该方法所使用的菌种为克雷伯氏杆菌、大肠杆菌或粪肠球菌，三者均为条件致病菌，存在生物安全性方面的隐患，另外，该方法需对发酵培养基进行灭菌，能耗较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备乳酸的菌种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)R3-8。本发明另一目的在于提供一种转化甘油制备乳酸的方法。所述菌种为戊糖乳杆菌(LactcAaCilluSpentOSuS)R3-8，是一种益生菌，从土壤样品中筛选得到，已于2011年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，该保藏中心登记入册编号为CGMCC No. 4726。所述转化甘油制备乳酸的方法的具体步骤为将戊糖乳杆菌(LactcAacillus pentosus)R3-8接入含有甘油的种子培养基中培养，然后把种子液加入含废甘油浓度50 100g/l的发酵培养基中进行微氧发酵，发酵过程中通入空气，搅拌，流加废甘油，使发酵液中甘油浓度控制在10 30g/l，同时流加6 8M 碱溶液，控制PH值为5. 0 7. 0，发酵过程中测定菌体干重浓度、甘油和乳酸浓度，当菌体干重浓度低于1. 5g/l时，停止流加甘油，结束发酵。所述种子培养基(g/L)为蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042，乙酸钠5，纯甘油20， pH6. 5,0. IMPa 灭菌 20min。所述发酵培养基(g/L)为蛋白胨10，酵母膏6，K2HPO4L 5，乙酸钠6，废甘油(甘油含量 96% w/w) 80，CaCO3 (单独灭菌)30，pH 6. 5,0. IMPa 灭菌 20min。所述培养的温度可为30 40°C，培养的时间可为6 12h。所述废甘油可为生物柴油生产过程中的副产物。所述微氧发酵的温度可为30 45°C，所述发酵过程中通入空气可通入0. 6 1. 5vvm。所述搅拌的转速可为150 400rpm。本发明的突出优点在于1)本发明所用发酵培养基无需进行灭菌，可直接用于发酵。2)本发明使用微生物将廉价原料废甘油转化为具有高附加值的生物基平台化合物乳酸，找到了一条有效利用废甘油的出路。3)本发明所用菌种为益生菌，无生物安全性方面的隐患。 4)本发明由于发酵过程中无需对培养基进行灭菌，因此减少了能耗，降低了生产成本。
图1为乳酸和甘油标准品的色谱图。在图1中，横坐标为保留时间(min)，峰高 (RIU)；保留时间为13. 832min的谱峰是乳酸峰，保留时间为15. 287min的谱峰是甘油峰。图2为发酵产物的色谱图。在图2中，横坐标为保留时间(min)，峰高(RIU)；保留时间为13. 836min的谱峰是乳酸峰，保留时间15. 283min的谱峰是甘油峰。
具体实施例方式实施例1(1)菌种的分离和纯化将新鲜的土壤样品Ig或水样Iml置于IOOmL富集培养基中，富集培养48h，取富集培养液5ml转入新的富集培养基中，依次转接3代。取富集培养液lml，以10倍梯度连续稀释，选择合适稀释度(10_4，10_5，10_6)的菌悬液0. 5ml，与分离培养基混合后倒平板。37°C 下，培养4 后，挑取透明圈大的菌株。将得到的菌株转入液体发酵培养基，37°C下静置培养7 后，发酵结束后，按下述方法测定发酵液中乳酸浓度采用高效液相色谱对反应产物进行定性与定量分析(Agilent IlOOSeries HPLC， 北京安捷伦有限公司，分离柱为Aminex-HPX-87H色谱柱，流动相为0. 5mM的硫酸超纯水水溶液，流速为0.5ml/min，柱温65°C，示差折光检测器。)用乳酸和甘油(均购自Sigma公司)作为标准品，制作标准曲线。检测结果如图1和2所示，其中图1为乳酸和甘油标准品色谱图，图2为发酵产物的色谱图。乳酸标准曲线为y = 4X10_6x+0. 0111，R2 = 0. 9998 ；甘油标准曲线为y = 3X 10-6X+0. 0532, R2 = 0.9999。结果表明，发酵产物在色谱图上的峰同乳酸标准品在色谱图上的峰保留时间完全相同，均为13.8;3min。最终获得一株可以转化甘油高产乳酸的菌株 R3-8。菌种的分离和纯化过程中所用培养基组成如下富集培养基(g/L)酵母粉5，葡萄糖1，废甘油50，0. IMPa灭菌20min。分离培养基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，K2HP042，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠 5，废甘油 50，吐温 801 (ml)，MgSO4 · 7H20 0. 58，MnSO4 · H2O 0. 25，琼脂粉 20，pH 6. 5， CaCO3 (单独灭菌)30，0. IMPa 灭菌 20min。发酵培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042,乙酸钠5，废甘油50， MgSO4 · 7Η200· 58，MnSO4 · H2O 0. 25，pH 6. 5,0. IMPa 灭菌 20min。(2)菌种的鉴定将步骤(1)筛选得到的菌株R3-8进行形态特征和16S rDNA序列鉴定，具体过程如下菌株R3-8为革兰氏阳性杆菌，短链或成排排列，无芽孢，无鞭毛，无荚膜；其单菌落为圆形、直径约l_2mm、乳白色、低凸起、边缘整齐、不透明的光滑型菌落。菌株R3-8的16S rDNA核苷酸序列如下
catgcctgcaggtcgacgattggttaccttgttacgacttcaccctaatcatctgtccca60
ccttaggcggctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcat120
ggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgc180
gattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaat240
ggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagc300
acgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccg360
gtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataaggg420
ttgcgctcgttgcgggacttctcacgacacgagctgacgacaaccatgca480
ccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtca540
agacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcg600
ggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgctt660
aatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgttta720
cggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgt780
cagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttc840
accgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgc900
acttcttcggttgagecgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctt960
tacgcccaataaatccggacaacgcttgcc acctacgtattaccgcggctgctggcacgt1020
agttagccgtggctttctggttaaataccg tcaatacctg aacagttactctcagatatg1080
ttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacg cggcgttgct1140
ccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttggg1200
ccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccat1260
ggtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagcc1320
gaagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgt1380
ttccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgcca1440
ctcactcaaatgtaaatcatgatgtaatcaccaatcaataccagagttcgttcgacttgc1500
atgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccaggatcaaactctaatctctagag1560
gatccccggg tacc1574
其与模式菌株戊糖乳杆菌Lactobacilluspentosus JCM 1558的同源性最高，可达
99. 867%。基于以上特征将步骤(1)筛选得到的菌株R3-8鉴定为戊糖乳杆菌 (Lactobacillus pentosus)。实施例2(1)发酵方式250ml三角瓶，静置发酵。(2)菌种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)R3-8CGMCC No. 4726。(3)培养基种子培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042,乙酸钠5，纯甘油20，pH 6. 5， 0. IMPa 灭菌 20mino发酵培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏6，K2HPO4L 5，乙酸钠6，废甘油(甘油含量约 96% w/w) 80，CaCO3 (单独灭菌)30，pH 6. 5,0. IMPa 灭菌 20min。(4)发酵过程种子培养将戊糖乳酸杆菌接到含20g/l甘油的种子培养基中O50ml三角瓶，装液量100ml)，37°C下静置培养8h。发酵培养将种子液按6%接种量转接到含80g/l废甘油的发酵培养基O50ml三角瓶，装液量100ml)中，在37°C下静置培养72h。(5)发酵结果发酵结束时，发酵液中乳酸浓度39. 3g/L，生产强度0. 55g/L · h。实施例3(1)发酵方式5L机械搅拌发酵罐，通空气分批发酵。(2)菌种同实施例2。(3)培养基种子培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042,乙酸钠5，纯甘油20，pH 6. 5， 0. IMPa 灭菌 20mino发酵培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏6，K2HPO4L 5，乙酸钠6，废甘油(甘油含量约 96% w/w) 80，pH 6. 5,0. IMPa 灭菌 20min。(4)发酵过程种子培养同实施例2。发酵培养使用5L发酵罐，装液量2L，发酵温度控制在34°C，pH用浓度为7. 5mol/ L NaOH溶液自动调节维持在6. 0，将种子液按6%接种量转接到含80g/l废甘油的发酵培养基，搅拌转速250rpm，通入空气量为0. 8vvm,发酵时间为96h。(5)发酵结果发酵结束时，乳酸浓度达到60. 2g/L，生产强度为0. 63g/L · h。实施例4(1)发酵方式5L机械搅拌发酵罐，发酵培养基不进行灭菌，通空气分批发酵。(2)菌种同实施例2。(3)培养基种子培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042,乙酸钠5，纯甘油20，pH 6. 5， 0. IMPa 灭菌 20mino发酵培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏6，K2HPO4L 5，乙酸钠6，废甘油(甘油含量约 96% w/w)80, pH 6. 5。(4)发酵过程种子培养同实施例2。发酵培养使用5L发酵罐，装液量2L，发酵温度控制在34°C，pH用浓度为7. 5mol/ L NaOH溶液自动调节维持在6. 0，将种子液按6%接种量转接到含80g/l废甘油的发酵培养基，搅拌转速250rpm，通入空气量为0. 8vvm,发酵时间为96h。(5)发酵结果发酵结束时，乳酸浓度达到58. 8g/L，生产强度为0. 61g/L化。在整个发酵过程中， 镜检所有样品，未发现染菌现象。实施例5(1)发酵方式5L机械搅拌发酵罐，发酵培养基不进行灭菌，通空气补料分批发酵。(2)菌种同实施例2。(3)培养基种子培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042,乙酸钠5，纯甘油20，pH 6. 5， 0. IMPa 灭菌 20mino发酵培养基(g/L)蛋白胨10，酵母膏6，K2HPO4L 5，乙酸钠6，废甘油(甘油含量约 96% w/w)80, pH 6. 5。(4)发酵过程种子培养同实施例2。发酵培养使用5L发酵罐，装液量2L，发酵温度控制在34°C，pH用浓度为7. 5mol/ L NaOH溶液自动调节维持在6. 0，将种子液按6%接种量转接到含80g/l废甘油的发酵培养基，搅拌转速250rpm，通入空气量为0. 8vvm，发酵过程中流加废甘油，控制发酵液中甘油浓度在20g/l左右，当菌体干重浓度明显下降(低于1.5g/l)时，停止流加甘油，结束发酵，发酵时间为12他。(5)发酵结果发酵结束时，发酵液中乳酸浓度达到70. 6g/L，生产强度达到0. 56g/L *h。在整个发酵过程中，镜检所有样品，未发现染菌现象。
权利要求
1.一种制备乳酸的菌种，所述菌种为戊糖乳杆菌(LactcAacillus pentosus)R3-8，已于2011年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该保藏中心登记入册编号为 CGMCC No. 4726。
2.一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于其具体步骤为将戊糖乳杆菌(LactcAacillus pentosus)R3-8接入含有甘油的种子培养基中培养，然后把种子液加入含废甘油浓度50 100g/l的发酵培养基中进行微氧发酵，发酵过程中通入空气，搅拌，流加废甘油，使发酵液中甘油浓度控制在10 30g/l，同时流加6 8M碱溶液，控制PH值为5. 0 7. 0，发酵过程中测定菌体干重浓度、甘油和乳酸浓度，当菌体干重浓度低于1.5g/l时，停止流加甘油，结束发酵。
3.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述种子培养基为单位为g/L，蛋白胨10，酵母膏5，K2HP042,乙酸钠5，纯甘油20，pH 6. 5,0. IMPa灭菌 20mino
4.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述发酵培养基为单位为g/L，蛋白胨10，酵母膏6，K2HPO4L 5，乙酸钠6，废甘油80，CaC0s30, pH 6.5， 0. IMPa 灭菌 20mino
5.如权利要求4所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述废甘油中的甘油含量为96% w/w。
6.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述培养的温度为 30 40°C，培养的时间为6 12h。
7.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述废甘油为生物柴油生产过程中的副产物。
8.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述微氧发酵的温度为30 45°C。
9.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述发酵过程中通入空气的量为0. 6 1. 5vvm。
10.如权利要求2所述的一种转化甘油制备乳酸的方法，其特征在于所述搅拌的转速为 150 400rpm。
全文摘要
一种转化甘油制备乳酸的方法，涉及一种乳酸。提供一种制备乳酸的菌种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)R3-8。将戊糖乳杆菌R3-8接入含有甘油的种子培养基中培养，将种子液加入发酵培养基中微氧发酵，发酵过程中通入空气搅拌，流加废甘油，同时流加6～8M碱溶液，控制pH值为5.0～7.0，发酵过程中测定菌体干重浓度、甘油和乳酸浓度，当菌体干重浓度低于1.5g/l时，停止流加甘油，结束发酵。发酵培养基无需进行灭菌，直接用于发酵；所用菌种为益生菌，无生物安全性方面的隐患；减少了能耗，降低了生产成本。
文档编号C12N1/20GK102250811SQ20111019885
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者方柏山, 赵耿 申请人:厦门大学