一种重组大肠杆菌利用甘油生产乳酸的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体地说将参与乳酸生物合成的一个基因克隆 并与大肠杆菌高拷贝载体PUC19连接，将重组质粒转入大肠杆菌中，使用氨苄青霉素作为 筛选标记，以加强该基因在大肠杆菌中的表达量，使乳酸可以在大肠杆菌中大量合成。
【背景技术】：
[0002] 乳酸（Lactate)又名2-羟基丙酸，α-羟基丙酸或丙醇酸，广泛存在于自然界中， 乳酸、乳酸盐及其衍生物是重要的生物化工产品，在啤酒酿造、医药、食品及食品保鲜、化妆 品，卷烟、皮革、印染、化工等领域有着广泛的应用。乳酸纯品为无色液体，熔点18°C，沸点 122°C。能与水、乙醇、甘油混溶，不溶于氯仿、二硫化碳和石油醚。分子式为C 3H6O3。乳酸 中心有不对称碳原子，因此具有旋光性，可分为是L-型，D-型和DL-型。以L-乳酸为单体 经化学合成的新型高分子材料一聚乳酸，具有优良的生物可降解性，能最终降解成二氧化 碳和水，属环保型材料，可以用来解决日益严重的"白色污染"问题。由于L-乳酸是皮肤固 有天然保湿因子，所以被广泛用作许多护肤品的滋润剂。很多微生物能够发酵生产D-乳 酸，一些乳酸菌如保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus)能够生产高纯度的D-乳 酸。但是人体只能代谢L-乳酸。自然界中很多菌如一些乳酸菌：乳杆菌（Lactobacillus helveticus)、嗜淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylophilus)和德式乳杆菌（Lactobacillus delbruckii)则能够生产L-乳酸。（钱志良，劳含章，王健。2003.)
[0003]
【主权项】
1. 一株可利用甘油生产乳酸的大肠杆菌LDH16172,质粒pLDH，基因工程菌LDH16172和 乳酸合成相关酶的基因 ldhA。
2. 根据权利要求1中，利用甘油发酵生产乳酸的方法，包括培养所需条件和培养基配 方。
3. 根据权利要求1中利用甘油发酵生产乳酸的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，包 括： a. 利用设计的引物扩增得到一个相关合成酶的基因片段 b. 利用热击法将构建质粒转化入大肠杆菌的方法 c. 用氨苄青霉素筛选阳性克隆并用于生产的方法。
4. 根据权利要求1中乳酸合成酶的相关基因设计的引物为：引物序列1，2。
5. 根据权利要求1中利用基因工程菌生产乳酸的发酵方法及培养基： LB 培养基（IL) :Tryptone (胰蛋白胨）：10g，Yeast Extract (酵母提取物）：5g， NaCl (氯化钠）：10g。若配制固体培养基，则再加入15g Agar (琼脂）。 M9培养基（IL) :Na2HP04.7H20(七水合磷酸氢二钠）：12.8g，KH 2P04(磷酸二氢钾）：3g， NaCl (氯化钠）：0.5g，NH4Cl (氯化铵）：lg，Glycerol (甘油）：20g。Yeast Extract (酵母 提取物）：5g，IM MgSO4 · 7H20(七水合硫酸镁）1ML，0. IM CaCl (氯化钙）：1ML。 将所得基因工程菌在3ML含有氨苄青霉素的LB培养基中37°C，250rpm培养12小时， 转入M9培养基，M9培养基在使用前加入氨苄青霉素，37°C培养3小时，加入4 μ L浓度为 0. 5mM的IPTG诱导，并转入30°C，250rpm培养24-48小时。
6. 根据权利要求5中，利用基因工程菌大量发酵生产乳酸的扩大培养方法，包括分批 补料，流加等发酵方法。
【专利摘要】本发明涉及一种使用重组大肠杆菌利用甘油生产乳酸的方法，包括构建含有乳酸生物合成所需蛋白的编码基因的重组载体。参与乳酸生物合成的基因有ldhA，将此基因克隆并与大肠杆菌高拷贝载体pUC19连接，将重组质粒转入大肠杆菌BW25141中，通过氨苄青霉素的筛选标记，从而获得了大肠杆菌高产乳酸的菌株，通过生物发酵生产乳酸，并从发酵液中回收乳酸。
【IPC分类】C12N1-21, C12N15-70, C12R1-19, C12P7-56
【公开号】CN104560839
【申请号】CN201310485910
【发明人】刘立栋
【申请人】常州邱鸿生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月17日