一种短乳杆菌、醛缩酶及其基因和制备他汀中间体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种短乳杆菌、醛缩酶、编码该醛缩酶的基因、含 有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备醛缩酶的方法，以 及利用醛缩酶制备他汀中间体（3R，5S)-6-氯-2, 4, 6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷的方法。
【背景技术】
[0002] (3R，5S) -6-氯-2, 4, 6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷[(3R，5S) -6-chloro_2, 4, 6-trideoxy-D_erythr0-hexapyranoside，CTeHP]是合成他汀类药物的重要手性中间体，其分 子式为C 6H11O3Cl, CAS号为714963-27-6。他汀类药物泛指羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA) 还原酶抑制剂，通过竞争性抑制内源性HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使 细胞内胆固醇合成减少，从而反馈刺激细胞膜表面（主要为肝细胞）低密度脂蛋白受体数 量和活性增加、提高胆固醇清除能力、降低血清胆固醇水平。他汀类药物还可抑制肝脏合成 载脂蛋白B-100,从而减少血浆载脂蛋白的合成和分泌，作为一类经典、有效的降脂药物，广 泛应用于高脂血症的治疗。
[0003] 大多数他汀类药物拥有一个共同的侧链，该侧链的生产方法包括两大类：不对称 化学合成法以及酶合成法。与化学合成法相比，酶合成法具有反应条件温和、环境友好、产 物光学纯度高等优点，非常适于工业应用。在酶合成法制备他汀手性侧链中间体中，研究较 多的酶是羰基还原酶。但羰基还原酶在催化制备他汀侧链手性中间体的过程中存在反应步 骤较多、需要添加昂贵的辅因子以及需要使用辅酶再生体系等缺陷。研究人员开发了一条 利用2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA)催化醛缩反应制备他汀侧链关键手性中间体的路 线（J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 8422 - 8423)。该路线以结构简单、廉价易得的乙醛和氯乙醛 作为起始底物，连续两步酶促反应直接制备带有两个手性中心的他汀侧链中间体CTeHP，反 应在中性水溶液中进行，不需要额外添加辅因子，也不需要进行pH调节，是合成他汀侧链 最简洁的路线。美国Diversa公司通过宏基因组筛选方法得到了一个新的DERA酶，催化剂 用量为20g/L时，时空产率为30. 6g/L/h。浙江工业大学郑裕国课题组对Diversa公司得到 的DERA酶进行了纯化表征，活性为I. 8U/mg，当底物浓度为：氯乙醛80mM/乙醛160mM时，时 空产率为75. lg/L/d。荷兰皇家帝斯曼（DSM)公司采用易错PCR技术对来源于大肠杆菌的 2_脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶（EcDERA)进行了定向进化，所得到的突变体DERAVarH在工 业底物浓度条件（乙醒1M，氯乙醒0. 5M)下的时空产率达174g/L/d (Directed evolution of an industrial biocatalyst:2-deoxy-D-ribose 5-phosphate aldolase. Biotechnol. J.，2006, 1:537 - 548)。与传统的化学合成法相比，酶合成法制备CTeHP的方法具有反应条 件温和、环境友好、操作简单等优点，但是目前酶合成法仅限于实验室规模，且存在酶活性 低、催化剂使用量大、底物耐受性差（氯乙醛浓度不高于〇. 5M)、反应时间长等缺陷，不适合 工业化生产。因此，需要筛选活性高、稳定性好且能在较短反应时间获得较高浓度产物的 酶，以满足工业化生产他汀中间体CTeHP的需求。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前酶合成法制备CTeHP存在酶活性低、 底物耐受性差等缺陷，提供一种催化活性高、底物耐受性强的醛缩酶、表达所述醛缩酶的 基因及其重组表达载体和重组表达转化体、所述醛缩酶的制备方法和所述醛缩酶在制备 (3R，5S) -6-氯-2, 4, 6-三脱氧-D-赤型吡喃己糖苷中的应用。
[0005] 本发明的技术方案之一是：一种短乳杆菌（Lactobacillus brevis)，其保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO. 10135。
[0006] 所述短乳杆菌CGMCC No. 10135来源于上海植物园采集的土壤样本，检测土壤样本 中各个菌株的醛缩反应产物的浓度，发现其中1菌株表现出非常好的乙醛、氯乙醛缩合反 应效果，对该菌株进行鉴定，为短乳杆菌（Lactobacillus brevis),命名为EQJ8302。该菌 株已于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到 保藏中心登记入册编号CGMCC No. 10135,其具有以下的微生物学特性：细胞呈短杆状，大小 为0. 7?1. 0 μ mX 2. 0?4. 0 μ m，不产生芽孢，革兰氏染色呈阳性；接触酶、氧化酶阴性；兼 性厌氧；在PH5?9生长良好；发酵葡萄糖、葡萄糖酸钠、阿拉伯糖、果糖、乳糖、麦芽糖、半 乳糖产酸。
[0007] 本发明的技术方案之二是：一种醛缩酶（LbDERA)，其是如下（a)或（b)的蛋白质：
[0008] (a)如序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009] (b)由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基 酸而形成的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0010] 本发明所述醛缩酶LbDERA从所述短乳杆菌CGMCC NO. 10135中获得。所述短乳杆 菌CGMCC NO. 10135已于2014年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心（CGMCC)，采用鸟枪法对所述短乳杆菌CGMCC NO. 10135的醛缩酶进行了克隆，获 得一个具有较高活性和底物耐受性的重组醛缩酶，命名为LbDERA，其氨基酸序列如序列表 中 SEQ ID No. 2 所示。
[0011] 在筛选获得高活性及高底物耐受性醛缩酶LbDERA的基础上，发明人通过反复的 实验和艰苦的摸索，试图通过调整LbDERA氨基酸序列中一些位点的氨基酸种类来达到使 调整后的醛缩酶酶活性增大的目的，发现在SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的基础上对第29 位的苏氨酸残基、第78位的谷氨酸残基或第163位的苯丙氨酸残基进行单点替换后，仍具 有DERA活性，在此基础上获得了酶活性显著提高的突变体。
[0012] 因此，较佳地，本发明所述蛋白质（b)为将如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨 基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质 (LbDERAT29A)、将如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为 赖氨酸残基而形成的氨基酸序列组成的蛋白质（LbDERAE78K)或将如序列表中SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列的第163位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基而形成的氨基酸序列组 成的蛋白质（LbDERA n63v)。
[0013] 本发明所述醛缩酶的获得的方法为本领域常规；较佳地为分离获得、从重组表达 所述醛缩酶的转化体中分离获得或者人工合成获得。
[0014] 本发明的技术方案之三是：一种醛缩酶的基因，其
[0015] (1)核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；或
[0016] (2)编码如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或编码由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列在第29位、第78位或第163位替换一个氨基酸而形成的氨基酸序 列组成的蛋白质。
[0017] 本发明中，较佳地，所述醛缩酶的基因的核苷酸序列也可以是编码如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或编码由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经过替换一个氨基酸而 形成的氨基酸序列的其他任何碱基序列；更佳地，编码将如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨 基酸序列的第29位的苏氨酸残基替换为丙氨酸残基的氨基酸序列组成的蛋白质、编码将 如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的第78位的谷氨酸残基替换为赖氨酸残基的 氨基酸序列组成的蛋白质或编码将如序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的第163位 的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；最佳地，为按照密码 子的简并性，为了适合在宿主细胞中有效表达所述醛缩酶的序列。
[0018] 本发明所述醛缩酶的基因获得的方法为本领域常规；较佳地，为从所述短乳杆菌 CGMCC NO.