一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应 用。
【背景技术】
[0002] 烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌（Wsioflia 侵染引起的一种在世 界范围内广泛传播的土传病害。该病菌株系复杂、寄主范围广、极易爆发流行，防治难度较 大。烟草青枯病在我国长江流域及其以南地区普遍发生，尤以福建、广东、湖南、贵州等烟区 危害较重，重病田块发病率高达90%以上，严重影响烟草的产量和品质，造成重大的经济损 失。
[0003] 目前，在生产中主要通过栽培抗病品种、改善耕作制度和采用化学防治等措施来 防治烟草青枯病。但培育抗病品种周期长，且易受环境影响，防治效果不理想。改善耕作制 度，采用轮作是目前对抗该病的有效措施，但是在实际生产中很难实现。化学药剂虽在一定 程度上可减轻该病的危害，但是防治效果不高，且长期使用化学农药带来的环境污染、农药 残留、病菌抗药性不断增强等问题日益突出。因此寻找一种有效、安全的防治措施是当务之 急。生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，已成为解决土传病害的有效途径。 其中，利用拮抗微生物防治植物病害已成为生物防治中的重要方向。迄今为止，筛选出的生 防菌主要有假单胞菌、芽孢杆菌、菌根真菌及少数放线菌。但总体来说，我国利用拮抗菌株 防治烟草青枯病的研究基础还相对薄弱，特别是高效菌种明显匮乏。
[0004] 放线菌（Actinomycetes)是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰 富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的约8000种生物活性物质当中，近70%是 由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，如中生菌素、阿维菌素 等。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。 因此从烟田根围土壤分离获得对烟草青枯病菌具有拮抗作用的放线菌，对该病害的防治具 有重要意义，符合农业的可持续发展要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于：针对烟草青枯病病发生面积逐年扩大，化学防治效果不理想， 同时带来环境污染的实际情况，提供一种高效防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应 用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现： 本发明首先提供了一种生防放线菌菌株，所述的菌株为链霉菌5/7.) Κ4,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24 日，保藏号为CGMCC NO. 8949。
[0007] 本发明还提供了所述的生防放线菌菌株在制备生防菌剂中的应用。
[0008] 所述生防菌剂的制备方法如下：所述生防菌剂的制备方法如下：将所述的链霉菌 (5/7. )K4接种于高氏一号液体培养基中，28 °C，180 r/min，培养2_3d后，制 成种子液，接种于发酵培养基中；发酵培养基的配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、 NaCl 0. 3%、CaC03 0. 2%，发酵条件为：接种量10% V /V、装瓶量60mL /250mL、发酵培养基初 始pH值8. 0、28 °C，180-200 r/min，培养5-6 d，制成浓度为108CFU/ml的K4菌株发酵液， 作为生防菌剂。
[0009] 以及，所述的生防放线菌菌株在烟草青枯病生物防治中的应用。具体应用为：所述 生防菌剂在烟苗移栽时随定根水使用；或者在烟苗移栽4-5天后灌根使用；或者与有机肥 混合制成菌肥使用。
[0010] 灌根使用时，每株50ml，连续使用2-3次，每次间隔8-12天。
[0011] 本发明的有益效果： 本发明筛选出的生防放线菌K4能够明显抑制烟草青枯病菌的生长。由于是生物制剂， 因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染具有重要的作用，而且有利 于烟叶的绿色生产。
[0012] 本发明菌株分离自烟草根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的 优势。
[0013] 盆栽试验结果显示，该生防菌对烟草青枯病的防治效果显著，高达82. 91%。同时， 该菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为菌株K4气生菌丝和孢子丝形态(光学显微镜下40X )。
[0015] 图2为菌株K4孢子形态（电子显微镜7000X )。
[0016] 图3为菌株K4依据16SrDNA序列构建的系统发育树。
[0017]图4为菌株K4发酵液对烟草青枯病菌的平板抑菌效果图。其中，1为优化之前的 抑菌效果，2和3为优化之后的抑菌效果。
[0018] 图5为菌株K4对烟草青枯病的温室盆栽控病作用。其中，左边为施用K4发酵液， 右边为清水对照。
【具体实施方式】
[0019] 为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不 是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0020] -株生防放线菌，菌种命名为K4,分类命名：链霉菌5/7.)，其保藏 编号：CGMCC No. 8949,保藏日期：2014年3月24日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0021] 实施例一拮抗放线菌的筛选 具体过程如下： 1、土壤样品的采集 从福建省政和县采集不同烟田地块5-20cm深处的根围土壤，共4份，分装标记后带回 实验室，待自然风干后分离。
[0022] 2、放线菌的分离 采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品l〇g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三 角瓶中，震荡30min后静置5分钟，依次稀释10倍，分别配制成10'10'10'10'KT6的 悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各〇. Iml加到高氏一号培养基(加入终浓度为50mg /L的 K2GrO7)平板上，均匀涂布后置于28°C培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯 化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4°C保存备用，共分离得到126株放线菌。
[0023] 3、拮抗放线菌的筛选 采用琼脂块法对分离得到的放线菌进行抑菌活性的初筛。将放线菌接种于高氏一号培 养基上培养5d后，用灭过菌的直径6 _的打孔器打出若干菌饼，挑取一块放入PDA平板中 央，于28 °C培养4 d后，倒入含烟草青枯病菌（108CFU/ml )的NA培养基10mL，待凝固后 置于28 °C，2d后记录抑菌圈的大小和有无，重复3次。经初筛发现有15株放线菌对烟草 青枯病菌具有不同程度的抑制作用(表1)，其中菌株Ρ1〇、Ρ12、Κ2、Κ4、Κ13和K24对烟草青 枯病菌的抑菌圈直径都在30mm以上。
[0024] 表1 15株放线菌对烟草青枯病菌的抑制作用
【主权项】
1. 一种生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为链霉菌（5/7. )K4,已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保 藏号为 CGMCC NO. 8949。
2. 如权利要求1所述的生防放线菌菌株在制备生防菌剂中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生防菌剂的制备方法如下：将所述的 链霉菌（5/7. )K4接种于高氏一号液体培养基中，28 °C，180 r/min，培养2_3d 后，制成种子液，接种于发酵培养基中；发酵培养基的配方为：淀粉2%、葡萄糖I. 5%、黄豆粉 2%、NaCl 0.3%、CaC03 0.2%，发酵条件为：接种量10% V /v、装瓶量60mL /250mL、发酵培养 基初始pH值8. 0、28 °C，180-200 r/min，培养5-6 d，制成浓度为108CFU/ml的K4菌株发 酵液，作为生防菌剂。
4. 如权利要求1所述的生防放线菌菌株在烟草青枯病生物防治中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生防菌剂在烟苗移栽时随定根水使 用；或者在烟苗移栽4-5天后灌根使用；或者与有机肥混合制成菌肥使用。
【专利摘要】本发明公开了一种防治烟草青枯病的放线菌菌株及其应用方法，属于微生物技术领域。所述的菌株为链霉菌（<i>Streptomyces？sp.</i>）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC？NO.8949。该菌株通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，对烟草青枯病表现出较好的防治效果。所述的生防放线菌菌株用于制备生防菌剂，应用时可以在烟苗移栽时随定根水使用；或者移栽4-5天后灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。所述菌株K4是从烟田根围土壤中获得，与土壤生态和谐相容，因此在烟草青枯病的生物防治中具有良好的应用前景。CGMCC No. 89492014.03.24
【IPC分类】A01N63-00, C12N1-20, A01P1-00
【公开号】CN104560827
【申请号】CN201510010789
【发明人】谢世勇, 丁雪玲, 谢廷鑫, 陈志厚, 林勇, 黄建成, 陈庆河, 李本金
【申请人】福建省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月9日