一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，该方法步骤如下：1）接种用主要器具准备；2）烟苗培育；3）接种用细菌液的准备；4）离体叶片的采集；5）离体叶片的处置；6）接种病菌；7）接种后处置。本发明的优点是：1.本发明所用器具简单，接种发病过程时间短，占用空间场地少，方法简易便捷，无需高难度的技术操作，工作效率高；2.本发明利用较小的烟叶，烟苗的培育准备快速易行；发病症状与田间症状一致，清晰易识别，重现性好，接种发病局部条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。
【专利说明】一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法【技术领域】
[0001]本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法。
【背景技术】
[0002]在植物病害控防研究中，许多基础问题的研究或重要理论问题的研究均离不开人工接种发病这基本手段。植物病害人工发病可以在活体植株上接种，也可在植物离体器官材料上接种。采用活体植株接种发病的研究结果，虽然更能反映寄主-病菌互作的本貌，但在活体上接种，往往需要较多的时间和空间场地，耗费较多的精力和财力，而且在许多情况下，局部条件控制的难度较大；而采用植物离体器官材料接种发病，往往需要较少的时间和空间需求，简单易行，接种发病的局部条件较容易控制，容易提高试验的规模与效率；许多植物病理学问题，采用离体材料接种手段进行研究，也能达到研究目的，或者说，采用在离体材料上接种与在活体植株上接种的研究结果是一致的。因此，在稻瘟病、稻纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、大豆锈病、马铃薯晚疫病、葡萄霜霉病、以及瓜类疫病、瓜类霜霉病、多种作物炭疽病等许多重要植物病害研究中，均有采用离体接种方法进行有关研究。
[0003]烟草青枯病全球普遍发生，是烟草生产的毁灭性病害，该病害的病原菌(Ralstonia solanacearum)也是当前国际上研究植物病原细菌致病机制的模式系统之一。在烟草青枯病的有关研究中，也有许多采用离体叶接种人工发病的应用案例，但长期以来，烟草青枯病离体叶人工发病，主要采用如下的技术方法。
[0004]用注射器将青枯病菌菌液通过细小的针头注入叶片组织内，或者通过无针头方式将菌液压渗入叶片组织内， 并以接种点附近组织的色泽变化为主要依据，判别接种发病的结果。虽然该接种方法体系很有效，但也存在一些明显的弊病:1)操作技术难度大，要将细菌液准确地压渗入或者注入到厚度与针头直径几乎等同的较薄的叶片组织内，不但需要训练有素的操作者，操作的效率也较为低下；2)接种结果主要表现为在接种点附近组织的局部坏死，与该病害的系统侵染症状有一定的差距。在高节奏的当代工作中，往往要求应用的技术方法工作起来简易便捷，并能高效率、高通量和高准确性，上述的弊病显然使得当前的烟草离体接种方法难以适应要求。
[0005]烟草青枯病的主要症状表现为萎蔫，同时还可以引起输导系统及其附近组织的坏死，叶片的输导组织分布在叶脉上，输导系统及其附近组织的坏死，可导致叶脉外观上呈褐色至黑色的坏死，这种症状特征应在人工接种发病中加以利用，但至今未见有将这种清晰的症状表现，在人工发病实践中的应用及其配套技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0008]一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，主要内容是在倾斜的培养皿内将烟草离体叶片接种烟草青枯病菌，导致叶片的叶脉组织坏死而表现出清晰的发病症状，人工发病方法的步骤如下:
[0009]1.接种用主要器具准备:用普通培养皿作接种用主要器具，清洁消毒后备用；
[0010]2.烟苗培育:按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，直至烟苗叶片长度与步骤I的培养皿直径相近时，即可使用；
[0011]3.接种用细菌液的准备:将烟草青枯病菌移植到NA等一般细菌培养基平板上，NA培养基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30°C培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水将细菌量调配成108cfu/ml的浓度级别，作为接种用细菌液。
[0012]4.离体叶片的采集:用干净剪刀，剪取步骤2烟草植株上的叶片长度与步骤I的培养皿直径相近的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面后待用。
[0013]5.离体叶片的处置:将步骤I备好的培养皿倾斜放置，打开皿盖，取步骤4准备的离体叶片展开放入培养皿内，叶片的顶端置于倾斜培养皿的高处，叶片的基端置于培养皿的最低处，并用一段干净灭菌的短玻璃棒将叶片的基端压住，每培养皿放一片叶片。
[0014]6.接种病菌:取步骤3准备的接种细菌液注入步骤5的放有离体叶片的培养皿内，使细菌液浸没叶片基部，盖回培养皿盖。
[0015]7.接种后处置:将步骤6的带有叶片和细菌液的培养皿置于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在28~30°C。
[0016]接种结果导致叶片出现非常清楚的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，一般接种后2天开始表现症状，4~6天后整个叶片全部坏死。
`[0017]本发明的优点是:
[0018]I)利用较小的烟叶，烟苗的培育准备快速易行。
[0019]2)所用器具简单，接种发病过程时间短，占用空间场地少。
[0020]3)发病症状与田间症状一致，清晰易识别，重现性好。
[0021]3)方法简易便捷，无需高难度的技术操作，工作效率高。
[0022]5)接种发病局部条件容易控制，容易实现技术方法的标准化。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是本发明接种用的培养皿处于倾斜状态。
[0024]图2是本发明的离体叶片的放置方式及接种后的状态。
[0025]图3是本发明接种发病初期症状，图中A、B、C、D、E是接种病菌的叶脉坏死表现，F是接种清水空白对照的表现。
[0026]图4是本发明接种发病较重的症状，图中A、B、C、D、E是接种病菌的叶脉坏死表现，F是接种清水空白对照的表现。
[0027]图5是本发明接种发病严重时的症状，图中A、B、C、D、E是接种病菌的叶脉坏死表现，F是接种清水空白对照的表现。
[0028]图6是本发明接种发病叶片全部坏死的症状，图中A、B、C是接种病菌的坏死表现，D是接种清水空白对照的表现。【具体实施方式】
[0029]下面结合附图与实施例对本发明作进一步描述。
[0030]发明人发现，在烟草离体叶片上接种病菌，无需用注射器强行压注方式导入病菌到叶片组织内，只要简单地将细菌液加在叶片基端的主脉切口上，细菌便由切口侵入叶片的叶脉组织内，快速导致叶脉组织坏死，出现清晰且与田间症状一致的发病症状。
[0031]为了将烟草青枯病菌接种用细菌液持续稳定地加在叶片基端的切口上，只需要将接种用的器具培养皿倾斜放置，如图1所示，并将离体叶片的基部切口置于倾斜培养皿的最低处，然后往培养皿内注入烟草青枯病菌细菌液，使细菌液浸泡过叶片基部切口即行，实际操作中，可在叶片基部上放置一截粗短玻璃棒，以利于将叶片基端压在细菌液内，如图2所示。
[0032]一般接种2天后可见叶脉出现坏死，初期往往是主脉基部先发病，如图3所示；往后坏死向上扩展，主脉与侧脉不断坏死，如图4所示；直至主脉与侧脉全部坏死，如图5所示；在叶脉坏死的同时，也逐步伴随着脉间叶肉组织的坏死，最后整个叶片全部坏死，如图5和图6所示；整个过程主叶脉坏死现象非常清楚。
[0033]接种导致病情发展的轻重或快慢，往往与如下一些接种条件等有关，I)接种用菌株，不同的菌株导致结果病情有差异。2)接种用细菌液的浓度，用低于2.5X108cfu/ml浓度的细菌液接种，同样可导致发病，但发病速度变慢；而用高于2.5X108cfu/ml浓度的细菌液接种，结果发病更快，不过采用过高浓度的细菌液接种，会导致发病过快过重，结果容易掩盖一些发病的差异细节，从而影响结果定量化的准确性，而且要获得很高浓度的细菌液，病菌培养工作量要增加。3)接种后的培养温度,在低于27°C条件下培养，同样可导致发病，但发病速度变慢；在高于30°C条件下培养，发病速度有所变快，但温度过高会加快烟草离体叶片衰老，也不利于操作者`在研究过程中的跟踪观察。
[0034]病情轻重可用主叶脉坏死长度等指标来衡量。
[0035]实施例1
[0036]一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-1 ;按如下步骤操作:
[0037]I)接种用主要器具准备:采用直径为15cm的普通培养皿，清洁消毒后备用；
[0038]2)烟苗培育:按常规方法培育烟苗品种云烟87，常规水肥管理，直至烟苗叶片长度与步骤I)的培养皿直径一致时(叶片长度为14cm左右)，即可使用；
[0039]3)接种用细菌液的准备:将本实施例用菌株移植到NA培养基平板上，(NA培养基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml)，30°C培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的三角瓶内，用无菌水调配成2.5X108cfu/ml (菌落形成单位/ml)的细菌液，作接种用细菌液。
[0040]4)离体叶片的采集:用干净剪刀剪取步骤2)获得的烟草植株上的长度约14cm的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面后待用。
[0041]5)离体叶片的处置:如图1所示将步骤I)备好的培养皿倾斜放置，打开皿盖，取步骤4)准备的离体叶片放入培养皿内，叶片的顶端置于倾斜培养皿的高处，叶片的基端置于培养皿的最低处，并用一段干净灭菌的短玻璃棒将叶片的基端压住，每培养皿放一片叶片(如图2所示)。
[0042]6)接种病菌:取步骤3)准备的本实施例用的接种细菌液30ml，注入到步骤5)的放有离体叶片的培养皿内，细菌液浸没叶片基端切口，盖回培养皿盖。
[0043]7)接种后处置:将步骤6)的带有叶片和接种细菌液的培养皿置于具备正常散射光的普通室内培养架上培养，培养室温度维持在28~30°C。
[0044]结果表现出如图3~图6 —样清晰的叶脉坏死症状；接种后65小时离体叶片的主叶脉坏死长度为6.4cm。
[0045]实施例2
[0046]—种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-3 ;按实施例1的步骤I)至步骤7)操作实施。结果表现出如图3~图6 —样清晰的叶脉坏死症状；接种后65小时离体叶片的主叶脉坏死长度为7.3cm。
[0047]实施例3
[0048]一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-4 ;按实施例1的步骤I)至步骤7)操作实施。结果表现出如图3~图6 —样清晰的叶脉坏死症状；接种后65小时离体叶片的主叶脉坏死长度为5.2cm。
[0049]实施例4
[0050]一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-2 ;按实施例1的步骤I)至步骤7)操作实施，其中在步骤3)调配的细菌液浓度，本实施例用的是2.5X 107cfu/ml，而不是实施例1用的2.5X 108cfu/ml，结果同样表现出如图3~图6 —样清晰的叶脉坏死症状，接种后65小时离体叶片的主叶脉坏死长度为3.0cm。
[0051]实施例5
[0052]一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，在烟苗品种云烟87离体叶片上接种烟草青枯病菌菌株Rso-2 ;按实施例1的步骤I)至步骤7)操作实施，其中在步骤7)接种后，本实施例的培养温度为24~27°C，而不是实施例1的28~30°C，结果同样表现出如图3~图6 —样清晰的叶脉坏死症状，接种后65小时离体叶片的主叶脉坏死长度为4.0cm0
【权利要求】
1.一种烟草青枯病离体接种的人工发病方法，其特征在于，在倾斜的培养皿内将烟草离体叶片接种烟草青枯病菌，导致叶片的叶脉组织坏死而表现出清晰的发病症状； 人工发病方法的步骤如下: 1)接种用主要器具准备:用普通培养皿作接种用主要器具，清洁消毒后备用； 2)烟苗培育:按常规方法培育烟苗，常规水肥管理，直至烟苗叶片长度与步骤I)的培养皿直径相近时，即可使用； 3)接种用细菌液的准备:将烟草青枯病菌移植到NA—般细菌培养基平板上，NA培养基的成分:牛肉膏3克，蛋白胨10克，琼脂18克，蔗糖10克，水1000ml，30°C培养48小时后，用无菌水将培养基平板上生长的细菌菌落洗涤悬浮，并将此细菌悬浮液转入干净的容器内，用无菌水调配成细菌浓度为2.5X108cfu/ml，作接种用细菌液； 4)离体叶片的采集:用干净剪刀，剪取步骤2)烟草植株上的叶片长度与步骤I)的培养皿直径相近的叶片，用干净的容器装回室内，在自来水下轻轻冲洗干净叶片表面后待用； 5)离体叶片的处置:将步骤I)备好的培养皿倾斜放置，打开皿盖，取步骤4)准备的离体叶片展开放入培养皿内，叶片的顶端置于倾斜培养皿的高处，叶片的基端置于培养皿的最低处，并用一段干净灭菌的短玻璃棒将叶片的基端压住，每培养皿放一片叶片； 6)接种病菌:取步骤3)准备的接种用细菌液注入步骤5)的放有离体叶片的培养皿内，使细菌液浸没叶片基部，盖回培养皿盖； 7)接种后处置:将步骤6)的带有叶片和细菌液的培养皿置于具备正常散射光的普通室内培养，培养温度维持在28~30°C ； 接种结果导致叶片出现非常清楚的叶脉坏死以及脉间组织的坏死症状，一般接种后2天开始表现症状，4~6天后整个叶片全部坏死。
【文档编号】C12N1/20GK103805539SQ201410006436
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】张君成, 谭金乐, 陈江凝, 黄柳 申请人:广西大学