一种烟草青枯病分子检测引物、检测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草青枯病分子检测引物、检测方法及应用，烟草青枯病分子检测引物由上下游内引物、上下游外引物和环引物组成，检测方法是以提取的疑似感病烟草总DNA为模板，利用权利要求1所述的分子检测引物进行环式等温扩增，反应结束后，根据反应产物的颜色判定结果，所述的分子检测引物用于制备烟草青枯病病原菌检测用试剂盒，可以快速准确地完成烟草青枯菌的检测。
【专利说明】一种烟草青枯病分子检测引物、检测方法及应用【技术领域】
[0001]本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治领域，具体涉及一种烟草青枯病病菌分子检测引物、检测方法及应用。
【背景技术】
[0002]烟草青枯病的病原为爺科劳尔氏菌Ofe/siofliaso/aaacea/--入杆状,无荚膜,革兰氏染色阴性。这种病原菌寄主范围超过200个种，包括了许多重要的经济作物，如番茄、马铃薯、烟草。因此，快速的早期诊断对于控制青枯病的发生蔓延以及重大损失的发生具有
重要意义。
[0003]随着基因组测序技术的发展和生物信息学数据的积累，多个Ralstoniasolanacearum菌株的基因组学列已经被公布，其中GMI1000菌株的测序结果公布最早，且注释信息最详细，已经成为其他菌株基因组研究的参考。在Tfe/siofliasoJaflaceara?基因组编码的众多蛋白中，/7ic基因编码鞭毛亚基蛋白(I)，N-端和C-非常保守，但是中间区域变异明显，可以被用来作为不同菌种和不同菌株鉴定的依据。正因如此，flic基因常被作为高特异性、高灵敏性PCR检测的目标基因(2)。
[0004]环介导的扩增首先由Notomi报道，这是一种极具前景的新方法，可以广泛应用于病原微生物的快速检测。这种方法需要一组引物，这组引物共6条，经过特殊设计，可是识别6个不同模板并能在Bst聚合酶大亚基作用下完成链取代式的DNA合成，原理核心LAMP的原理核心是针对靶基因6个区域设计的6条特殊引物和具有链置换活性的Bst(Bacillus stearothermophilus) DNA 聚合酶。在 Bst DNA 聚合酶最适温度 60~65°C恒温条件下，利用可以产生环状结构的引物和Bst DNA聚合酶链置换合成的活性，在靶序列两端引物结合处循环不断地产 生环状单链结构，使得引物在等温条件下引发新链合成，从而使靶基因高效扩增。反应产物既可以通过传统的琼脂糖凝胶电泳检测，也可以直接加入SYBR green染色剂，通过颜色变化肉眼识别。
[0005]目前烟草青枯病病原菌的检测主要用的PCR检测法，对专业仪器依赖重，并且检测时间较长的确定，而本发明利用环式等温扩增原理，为烟草青枯病病原菌的检测设计了一套分子检测引物，利用这套引物，通过环式等温扩增反应，可以快速准确的完成烟草青枯菌的检测。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是现有技术中烟草青枯病病原菌的检测主要用的PCR检测法，对专业仪器依赖重，并且检测时间较长，本发明提供一种基于环式等温扩增原理的烟草青枯病分子检测引物、检测方法及应用，利用环式等温扩增原理，为烟草青枯病病原菌的检测设计了一套分子检测引物，利用这套引物，通过环式等温扩增反应，可以快速准确地完成烟草青枯菌的检测。
[0007]本发明采用的技术方案:本发明烟草青枯病病原菌分子检测引物，由上下游内引物、上下游外引物 和环引物组成，所述分子检测引物的DNA序列为:
上游外引物(F3 ): 5 ’ -AGCCGGAACAAGTATTCATC-3 ’
下游外引物(B3):5，-TGGCGTTCTGAATACCTTG-3，
上游内引物(FIP):
5，-ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC-3，
下游内引物(BIP):
5，-GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC-3，
环引物 F (Loop F):5，-CGTTTGCAGGGACGAGAT-3，
环引物 B (Loop B):5’ -CGGTCTGCGTGTGAACAG-3’。
[0008]本发明烟草青枯病病原菌分子的检测方法，包括以下步骤:以提取的疑似感
病烟草总DNA为模板，利用上述的分子检测引物进行环式等温扩增，反应结束后，根据反应产物的颜色判定结果，反应产物为绿色的，即为烟草青枯病病原菌检出。
[0009]更进一步，烟草青枯病病原菌分子的检测方法，在25ul体系中，上游内引物 和下游内引物浓度为1.6uM，上游外引物和下游外引物浓度为0.2uM，环引物B浓度
0.4uM, dNTP 浓度 400uM,甜菜碱 1.0M, Tris-HCl 的 pH 为 8.8，浓度 20mM ；KC1 浓度 IOmM,(NH4)2SO4 浓度 10mM，MgSO 4 浓度 6mM，l%Triton X_100，8 个单位的 BstDNA 聚合酶大亚基，20ul矿物油，最后整个反应体系61°C孵育45分钟。
[0010]本发明烟草青枯病病原菌分子检测引物可以应用于制备烟草青枯病病 原菌检测用试剂盒。
[0011]本发明达到的有益效果:本发明根据烟草青枯病病原菌flic基因序列设计引物，该引物可用于烟草青枯病病原菌的环式等温扩增检测。而且本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，以方便使用。本发明检测方法能够在45分钟准确判断是否存在烟草青枯病病原菌，为病害的早期诊断提供了保证。具体表现为
1、特异性强
2、实用性好
3、操作简便快捷。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]附图1:烟草青枯病病原菌单菌落特异性检测结果，从左至右分别以青枯病病原菌作为模板的反应产物，对照反应产物，绿色代表青枯病病原菌被检出；附图1的右边电泳图是对应反应产物的电泳结果，病原菌被环式等温扩增法检出后，电泳结果呈现梯状条带分布，没有检出的则是空白泳道；
附图2:是带病烟叶特异性检测结果，左侧为带病烟叶DNA作为模板的反应产物，右侧为健康烟叶DNA作为模板的反应产物；绿色代表青枯病病原菌被检出；附图2的右边电泳图是对应反应产物的电泳结果，病原菌被环式等温扩增法检出后，电泳结果呈现梯状条带分布，没有检出的则是空白泳道。
【具体实施方式】[0013]实施例1: 一、菌落DNA的快速提取
用灭菌牙签挑取一个单菌落在IOOul裂解缓冲液(20nMTr1-Hcl，pH8.0 ；2nM EDTA,
1.2% Triton-100)中悬起，沸水浴10分钟，冰上冷却，粗裂解液直接作为LAMP模板
二、烟叶基因唔DNA的提取
采用天根生化的植物基因组DNA提取试剂盒(DP320)提取烟叶基因组DNA，包括如下步
骤:
(1)取0.1g烟草叶片，以液氮研磨值粉末；加入400ul缓冲液LPl和6ul RNaseAC IOmg/ml)，涡旋振荡I分钟，室温放置10分钟；
(2)加入130ul缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡I分钟；之后12000rpm离心5分钟，将上清液移至新的离心管中；
(3)加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15秒，将所得溶液加入一个吸附柱内；将吸附柱12000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；
(4)再向吸附柱加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，弃掉废液后，吸附柱放入收集管中，再重复一遍上述操作；
(5)弃掉废液，吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，再次弃掉废液，吸附柱在室温条件下放置数分钟，已彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液；
(6)将吸附柱放入一个干净的离心管，向吸附膜中间部位悬空滴加50-200ul洗脱液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；
(7)提取的基因组DNA浓度和质量使用Nanodrop分析仪检测。
[0014]三、引物的设计与合成
以国内外多家研究机构发布的W1S toniasolanacearum基因组测序结果比对发现，/7iC基因有多段核酸序列保守区域，适合设计环式等温扩增的引物。根据目标区的序列特点及相关设计原则设计引物，获得烟草青枯病病原菌环式等温扩增检测引物序列。所述烟草青枯病病原菌分子检测引物DNA序列为:
上游外引物(F3 ):AGCCGGAACAAGTATTCATC 下游外引物(B3 ): TGGCGTTCTGAATACCTTG 上游内引物(FIP):
ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC
下游内引物(BIP):
GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC
环引物 F (Loop F):CGTTTGCAGGGACGAGAT
环引物 B (Loop B):CGGTCTGCGTGTGAACAG
四、环式等温扩增检测的方法建立
所述等温扩增体系为25ul，体系中引物FIP和BIP浓度为1.6uM，引物F3和B3浓度为
0.2uM, 10pB 引物浓度 0.4uM，dNTP 浓度 400uM，甜菜碱 1.0M, Tris-HCl (pH8.8)浓度 20mM，KCl 浓度 IOmM, (NH4)2SO4 浓度 IOmM, MgSO4 浓度 6mM, l%Triton X-100，另外加入模板 DNA,然后加入8个单位的fciDNA聚合酶大亚基，然后立即混匀，加入20ul矿物油，混匀后离心10s，最后整个反应体系61°C孵育45min，以SYBR green染色；阳性结果反应产物将变成绿色，阴性结果反应产物为橙色。
[0015]实施例2
对烟草青枯病病原菌单菌落环式等温扩增方法的特异性检测:
用牙签取烟草青枯病病菌单菌落，同时挑取无菌落的培养基做为对照，按照实施例1方法提取菌落DNA作为模板，然后进行环式等温扩增。通过反应产物颜色判断检测结果。结果显示，青枯病单菌落对应的反应产物为绿色，而对照对应的反应产物仍为橙色。检测结果如图标示。表明建立的环式等温扩增检测方法具有良好的特异性，可以用于烟草青枯病病原菌单菌落的快速检测。
[0016]实施例3
对带有烟草青枯病病原菌的烟叶环式等温扩增方法的特异性检测:
分别取感有烟草青枯病的鲜烟叶健康鲜烟叶，按照实施例1方法提取烟草叶片基因组DNA，进行环式等温扩增。通过反应产物颜色 判断检测结果。结果显示，感病烟叶对应的反应产物为绿色，健康叶片对应的反应产物仍为橙色。检测结果如图标示。表明建立的环式等温扩增检测方法具有良好的特异性，可以用于烟草青枯病病原菌的快速检测。
【权利要求】
1.一种烟草青枯病病原菌分子检测引物，其特征在于:由上下游内引物、上下游外引物和环引物组成，所述分子检测引物的DNA序列为: 上游外引物:5’ -AGCCGGAACAAGTATTCATC-3’ 下游外引物:5，-TGGCGTTCTGAATACCTTG-3， 上游内引物:5’ -ACTGCGATTGCGACAGGGCCTCAGCCTCAATACCAAC-3’ 下游内引物:5’ -GCTCTGCAAAAGTCGCTGCGTAGGCCGCAGAATCATC-3’ 环引物 F:5’ -CGITTGCAGGGACGAGAT-3’
环引物 B: 5 ’ -CGGTCTGCGTGTGAACAG-3，。
2.一种烟草青枯病病原菌分子的检测方法，其特征在于:包括以下步骤:以提取的疑似感病烟草总DNA为模板，利用权利要求1所述的分子检测引物进行环式等温扩增，反应结束后，根据反应产物的颜色判定结果，反应产物为绿色的，即为烟草青枯病病原菌检出。
3.如权利要求2所述的烟草青枯病病原菌分子的检测方法，其特征在于: 在25ul体系中，上游内弓丨物和下游内弓丨物浓度为1.6uM，上游外引物和下游外引物浓度为0.2uM,环引物B浓度0.4uM, dNTP浓度400uM,甜菜碱1.0M, Tris-HCl的pH为8.8，浓度 20mM ；KC1 浓度 IOmM, (NH4)2SO4 浓度 IOmM, MgSO4 浓度 6mM, l%Triton X_100，8 个单位的BstDNA聚合酶大亚基，20ul矿物油，最后整个反应体系61°C孵育45分钟。
4.一种如权利要求1所述的烟草青枯病病原菌分子检测引物的应用，其特征在于:所述烟草青枯病病原菌分子 检测引物用于制备烟草青枯病病原菌检测用试剂盒。
【文档编号】C12N15/11GK103468794SQ201310297162
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】贾蒙骜, 陈兴江, 曹毅, 陆宁, 商胜华 申请人:贵州省烟草科学研究院