克隆禽α-干扰素的通用引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于克隆禽α-干扰素的通用引物及其应用。本发明根据10种已知禽IFN-α基因的序列分析出三段相对较为保守的核苷酸序列，以这三段序列为依据设计并合成克隆禽IFN-α基因的三条简并引物。其中一条上游简并引物AIF-TY1a的核苷酸序列为：5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，另一条上游简并引物POAU的核苷酸序列为：5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，其共同的下游简并引物AIF-TY2b的核苷酸序列为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，B=C/G/T。本发明应用范围广，适用于未知禽类α-干扰素的克隆，克服了现有技术中物种差距远不能克隆出来的缺点，且操作步骤简单易行。
【专利说明】克隆禽α-干扰素的通用引物及其应用【技术领域】
[0001]本发明涉及禽α-干扰素的克隆，尤其是涉及未知的禽α-干扰素的克隆的通用引物及其应用。属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]α干扰素也称为白细胞干扰素，它具有较强抗病毒、抗肿瘤、抗增殖作用等功能。自发现干扰素以来，由于其广谱抗病毒、抗肿瘤以及强大的免疫调节作用而成为免疫学、病毒学、细胞生物学、分子生物学、临床医学、肿瘤学等相关领域的研究热点。自1957年干扰素被发现以来，直到1994年鸡α-干扰素才刚刚被克隆。干扰素的研究在禽类起步较晚，现阶段已被克隆出来的α-干扰素的全序列的鸟类只有鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鹧鸪、鹦鹉、火鸡等。对于干扰素基因的克隆，现在主要有以下两种方法，尚不存在禽类α-干扰素的通用引物的使用。
[0003]方法一:目前对于干扰素的克隆，引物的设计大多数是参考与之亲缘关系相近的已知序列(如:鹅α-干扰素基因的克隆引物是参考鸭α-干扰素基因序列设计的)，该方法的优点是有可能一次性克隆出干扰素的全序列，但是其缺点是对于参考的物种有一定的局限性，若参考的物种与要克隆的物种亲缘关系不能在同一目下，很难克隆出来。
[0004]方法二:除技术一中所提及的，对于未知干扰素的克隆通常还会用到5’端cDNA快速扩增(5，-RACE)和 3’ 端 cDNA 快速扩增(3，-RACE), RACE (rapid-amplification ofcDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端的方法。另外除上述方法，当下基因组步移技术(如反 向PCR、载体PCR、接头PCR、热不对称交错PCR、高通量染色体步移等)也是获取侧翼序列的常用方法。而上述方法缺点是需建立在一段已知序列的基础上，而如果对于完全未知的序列该方法则无法有效使用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一在于提供一种用于克隆禽IFN-α基因的通用引物，以解决禽类未知的a -干扰素克隆起步困难的问题；同时该引物亦可以作为禽IFN-a基因的通用引物，用于禽类IFN-a基因的鉴定和筛选工作。本发明不涉及物种选取的局限性，对禽类都适用，而且也无需建立在一段已知序列的基础上，因此本发明的提出将更有利于对未知禽IFN-a基因的克隆以及为后续克隆提供理论和事实依据。
[0006]为了达到上目的，本发明采用了以下技术方案:
[0007]本发明根据10种已知禽IFN-a基因的序列分析出三段相对较为保守的核苷酸序列，以这三段序列为依据设计并合成克隆禽IFN-a基因的三条简并引物。其中一条上游简并引物AIF-TYla的核苷酸序列为:
[0008]5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’ (SEQ ID N0.1 所示)，另一条上游简并引物POAU的核苷酸序列为:5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’ (SEQ ID N0.2所示)，其共同的下游简并引物 AIF-TY2b 的核苷酸序列为:5’-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’ (SEQ ID N0.3 所示)。其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, B=C/G/T, N=A/C/G/T)。
[0009]AIF-TYla, AIF_TY2b和POAU，AIF_TY2b两对简并引物分别从鸡行目(Galliformes)中的家鸡(序列的登录号:HQ008781 )、雁形目(Anseriformes)中的鸭(序列的登录号:HQ008783)和鹅(序列的登录号:HQ115583)的基因组DNA中PCR扩增出IFN-a基因。由此证明对于已克隆出的禽IFN-a基因的物种，该对简并引物能够克隆出IFN-a基因，为这对引物的有效性提供了实例。与此同时，该对引物也能从鹤形目(Gruiformes)中的丹顶鹤和鸡行目(Galliformes)中的孔雀这两种野生动物的基因组DNA中克隆出IFN-a基因，证明在未被克隆出来的干扰素的物种中该对引物也是有效的。综上所述，该两对引物是能够从多数禽类基因组DNA中扩增出IFN-a基因，扩增长度分别大约为167bp，480bp。因此，本发明人提出了本发明。
[0010]本发明的一种用于克隆禽类IFN-a基因的简并引物，由一条上游简并引物和一条下游简并引物组成，其特征在于，所述的上游简并引物的核苷酸序列为:5’ -CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’(AIF-TYla)，所述的下游简并引物的核苷酸序列为:5，-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’(AIF_TY2b)，其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G,B=C/G/T。
[0011]在本发明中，优选的，所述的禽类包括鸡、鸭、鹅、孔雀以及丹顶鹤。
[0012]作为并列方案，本发明的一种用于克隆禽类IFN-α基因的简并引物，由一条上游简并引物和一条下游简并引物组成，其特征在于，所述的上游简并引物的核苷酸序列为:5 ’ -CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3 ’ (POAU )，所述的下游简并引物的核苷酸序列为:5，-AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’(AIF_TY2b)，其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G,N=A/C/G/T。
[0013]在本发明 中，优选的，所述的禽类包括鸡、鸭、鹅、孔雀以及丹顶鹤。
[0014]本发明的目的之二在于提供一种用于克隆禽类IFN-a基因的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0015](I)按照禽类血液基因组DNA的简单快速提取方法，分别从家禽的血液中提取基因组DNA ；
[0016](2)分别以提取得到基因组DNA为模版，以以上任一项所述的简并引物为引物，PCR扩增IFN-a基因；
[0017](3)回收目的片段，将胶回收产物连入载体，转化到大肠杆菌DH5 a感受态细胞中
培养；
[0018](3)挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定阳性后进行测序；
[0019](4)根据测序结果，通过常规的基因组步移的方法获得禽类IFN-a的全长基因序列。
[0020]在本发明所述的方法中，当使用AIF-TYla以及AIF_TY2b组成的简并引物为引物，PCR扩增IFN-α基因时，优选的，其反应条件为:94°C预变性8min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C终延伸lOmin，4°C终止反应；当使用POAU以及AIF_TY2b组成的简并引物为引物，PCR扩增IFN-a基因时，其反应条件为:94°C预变性8min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C终延伸lOmin，4°C终止反应。[0021]在本发明所述的方法中，优选的，所述的禽类包括鸡、鸭、鹅、孔雀以及丹顶鹤。
[0022]本发明的目的之三在于提供了所述的用于克隆禽类IFN-α基因的简并引物在禽类IFN-a基因克隆、鉴定和筛选中的应用。
[0023]在克隆禽IFN-a基因的过程中，目前还没有通用引物的应用。本发明是首次设计出该对引物并验证其在禽基因组DNA中的实用性。现有的克隆未知的IFN-a基因，引物通常是选择与物种亲缘关系最近的IFN-a基因设计能克隆出全长的IFN-a的引物，这种引物通常具有一定的局限性，只能克隆出亲缘关系近的物种的IFN-a基因，物种差距稍远的就不适用，本发明应用范围更广，克服物种差距远不能克隆出来的缺点。该发明应用起来简单易行，只需进行PCR扩增即可得到。干扰素全长约600bp-700bp，本发明并不能克隆得到全长基因，但是本发明的提出为后续克隆工作提供了基础。通过本发明的方法能够得到部分的IFN-a基因序列，本领域工作人员根据所得到的序列，通过常规的5’端cDNA快速扩增和3’端cDNA快速扩增的方法或基因组步移技术(如反向PCR、载体PCR、接头PCR、热不对称交错PCR、高通量染色体步移等)即可获得禽类IFN-a的全长基因序列，而无需做出任何创造性的劳动。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为三段相对保守的核苷酸序列；
[0025]IiAIF-TYla设计位点；2:AIF_TY2b设计位点；3 =POAU设计位点；
[0026]图2为引物AIF-TYla，AIF_TY2b PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；
[0027]1:阴性对照;2:鸭 ；3:鹅；4:鸡；5:孔雀；6:丹顶鹤；M =Marker ；
[0028]图3为引物POAU，AIF-TY2b PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0029]1:鸡；2:鸭；3:鹅；4:孔雀；5:丹顶鹤；M =Marker0
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0031]实施例1引物设计
[0032]本发明根据10种已知禽IFN-α基因的序列分析出三段相对较为保守的核苷酸序列(如图1所示)，以这三段序列为依据设计并合成克隆禽IFN-a基因的三条简并引物。其中一条上游简并引物AIF-TYla的核苷酸序列为:5’-CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’ (SEQID N0.1所示)，另一条上游简并引物POAU的核苷酸序列为:5’-CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’(SEQ ID N0.2所示)，其共同的下游简并引物AIF-TY2b的核苷酸序列为:5’ -AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’ (SEQ ID N0.3 所示)。其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C,K=G/T, S=C/G, B=C/G/T, N=A/C/G/T。
[0033]引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。利用该对引物，通过PCR技术扩增IFN-α基因。
[0034]引物设计所参考的序列及序列号:[0035]
物种名称序列号
Anser anser rubriroslrisEU029159
Anser cygnoides orienlcdisEU022750
Anser anser (domestic goose)HQ115583
Coliirnix japonicaAB154298
Francolinus pin ladeaimsH M196761
Columba Ην?αAB618534
Gallus gallmHQ008781
Meleagris gallopavoMGU28140
Anas platyrhynchosHQ008783
Cacalua goffiniH M007804
[0036]实施例2引物AIF-TYla和AIF_TY2b在扩增IFN- α基因中应用
[0037]利用该对引物，分别从鸡、鸭、鹅三种家禽的基因组DNA中扩增出IFN-α基因，片段长度为167bp.[0038]操作流程:`[0039]1、按照禽类血液基因组DNA的简单快速提取方法(吴慧英，刘铀，贾汝敏和刘艳芬等.鹅血液基因组DNA的简单快速提取方法研究[J].广东畜牧.兽医科技，2010,4(35):29-31)，分别从鸡、鸭、鹅三种家禽的血液中提取基因组DNA ；
[0040]2、分别以鸡、鸭、鹅的基因组DNA为模版，AIF-TYla和AIF_TY2b为引物，PCR扩增IFN-α基因，反应体系和反应条件如下所示:
[0041]PCR反应体系:
[0042]
基因组 DNA1.0t.1L
]0xpfu Buffer5.0jlL
dNTP (2.5mM)4.0pL
AIF-TYla ( ]0μΜ )4.0μΙ.AIF-TY2b ( ΙΟμΜ )2.5μΙ
[0043]
pfu(5U/pL)0.5 μΕ
ddH20up to 50μL
[0044]反应条件:94°C预变性8min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C终延伸10min，4°C终止反应。
[0045]3、回收目的片段，将胶回收产物连入平端载体pEASY-Blunt-Simple载体，室温连接5min后，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，37°培养12h。
[0046]4、挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定阳性后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
[0047]5、测序结果显示测序得到的序列分别与鸡的IFN-a基因(序列的登录号:HQ008781)、鸭的IFN-a基因(序列的登录号:HQ008783)、鹅的IFN-a基因(序列的登录号:HQ115583)所对应的序列完全相同。由此证明:在已知IFN-a基因的物种中，该对引物AIF-TYla和AIF-TY2b在鸡鸭鹅三种物种中是适用的。
[0048]实施例3引物AIF-TYla和AIF_TY2b在扩增IFN- α基因中的应用
[0049]实施例2中选取的是干扰素基因已知的物种，本实例采用的物种是丹顶鹤和孔雀，这两种物种目前还没有被克隆。按照实例中的操作过程PCR扩增，测序结果显示:该两种物种经AIF-TYla和AIF_TY2b扩增产物与IFN-α具有高度的同源性，初步认为IFN-a克隆成功，该对引物在未知的IFN-a的物种中也是同样适用的。PCR扩增结果如图2所示。
[0050]实施例4引物POAU和AIF_TY2b在扩增IFN- a基因中的应用
[0051 ] 利用引物POAU和AIF_TY2b，分别从鸡、鸭、鹅、孔雀、丹顶鹤的基因组DNA中扩增出IFN-a基因，片段长度480bp。
[0052]操作流程:
[0053]1、按照禽类血液基因组DNA的简单快速提取方法，分别从鸡、鸭、鹅、孔雀、丹顶鹤的血液中提取基因组DNA;
[0054]2、分别以上述基因·组DNA为模版，POAU和AIF_TY2b为引物，PCR扩增IFN- a基因，反应体系和反应条件如下所示:
[0055]PCR反应体系:
[0056]
基因组DNA1.0pL
IQx PCR Buffer5 ?μ?
[0057]
dNTP ( 2.5mM )4 Ομ?
POAU ( ΙΟμΜ )5.0μΙ>
AIF-TY2b ( ΙΟμΜ )2.5μ?
rTaq(5U々iL)0.5 μ?
CidH2Oup to 50μ?
[0058]反应条件:94°C预变性8min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C终延伸10min，4°C终止反应。
[0059]3、回收目的片段，将胶回收产物连入平端载体pMD18_T Vetor载体，室温连接5min后，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，37°培养12h。
[0060]4、挑取单克隆菌落，两次菌液PCR鉴定(一次引物用:P0AU和AIF_TY2b，另一次引物用AIF-TYla，AIF-TY2b)，两次结果均为阳性后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。[0061]5、测序结果显示测序得到的序列分别与鸡的IFN-α基因(序列的登录号:即008781)、鸭的正^0基因(序列的登录号:即008783)、鹅的正^0基因(序列的登录号:HQ115583)所对应的序列完全相同。丹顶鹤和孔雀，这两种物种的扩增产物与禽类IFN-a基因有较高的同源性， 说明引物应用成功。PCR扩增结果如图3所示。
【权利要求】
1.用于克隆禽类IFN-α基因的简并引物，由一条上游简并引物和一条下游简并引物组成，其特征在于，所述的上游简并引物的核苷酸序列为:5’ -CASCRSYACRBCCASCASCTCSAGC-3’，所述的下游简并引物的核苷酸序列为:5’ -AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3’，其中 R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, B=C/G/T。
2.如权利要求1所述的用于克隆禽IFN-α基因的简并引物，其特征在于，所述的禽类包括鸡、鸭、鹅、孔雀以及丹顶鹤。
3.用于克隆禽类IFN-a基因的简并引物，由一条上游简并引物和一条下游简并引物组成，其特征在于，所述的上游简并引物的核苷酸序列为:5’ -CYRSYSCTCNYGCTCCTYCT-3’，所述的下游简并引物的核苷酸序列为:5 ’ -AGGMGGACGRGKTCCCASGCGCAG-3 ’，其中R=A/G，Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, N=A/C/G/T。
4.如权利要求1所述的用于克隆禽IFN-a基因的简并引物，其特征在于，所述的禽类包括鸡、鸭、鹅、孔雀以及丹顶鹤。
5.一种用于克隆禽类IFN-a基因的方法，其特征在于包括以下步骤: (O按照禽类血液基因组DNA的简单快速提取方法，分别从家禽的血液中提取基因组DNA ； (2)分别以提取得到基因组DNA为模版，以权利要求1或权利要求3所述的简并引物为引物，PCR扩增IFN-a基因； (3)回收目的片段，将胶回收产物连入载体，转化到感受态细胞中培养； (3)挑取单克隆菌 落，经菌液PCR鉴定阳性后进行测序； (4)根据测序结果，通过常规的基因组步移的方法获得禽类IFN-a的全长基因序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于当使用权利要求1所述的简并引物为引物，PCR扩增IFN-a基因时，其反应条件为:94°C预变性8min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C终延伸lOmin，4°C终止反应；当使用权利要求3所述的简并弓丨物为引物，PCR扩增IFN-a基因时，其反应条件为:94°C预变性8min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C终延伸lOmin，4°C终止反应。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的禽类包括鸡、鸭、鹅、孔雀以及丹顶鹤。
8.权利要求1或2所述的用于克隆禽类IFN-a基因的简并引物在禽类IFN-a基因克隆、鉴定和筛选中的应用。
9.权利要求3或4所述的用于克隆禽类IFN-a基因的简并引物在禽类IFN-a基因克隆、鉴定和筛选中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103789302SQ201310652400
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】邢明伟, 田荔, 高明春, 赵盼盼, 刘世杰 申请人:东北林业大学