人微小rna启动子甲基化扩增及测序引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及应用。一种人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物，为Hsa-microRNA-145-5p启动子区域存在高甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化测序的特异引物；所述的扩增引物包括3对，所述的甲基化测序检测的特异引物包括miR-145-S2、miR-145-S5、miR-145-S4。本发明对喉鳞癌或者其他人类恶性肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测具有重要的医学价值及临床意义。
【专利说明】人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物及其应用
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种人属微小RNA,具体涉及Hsa-microRNA-145_5p (Hsa-miR-145_5p)启动子区域甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化水平测序的特异性引物，这些引物在肿瘤或其他疾病研究中的应用。【背景技术】
头颈鳞癌为全世界第六位高发肿瘤，位居欧洲男性高发肿瘤的第4位，而喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)源于喉黏膜上皮，发病率居头颈鳞癌的第2位。据统计，目前全世界范围内喉鳞癌发病略有上升，且年轻化趋势逐渐显现。
[0002]喉解剖结构局限且黏膜下淋巴管丰富，因此喉鳞癌具有局部侵袭及颈淋巴结转移的恶性生物学特性，成为患者治疗后复发及预后不良的重要风险因素，这也是近30年来喉鳞癌5年生存率并未有明显提升的一个重要因素。在喉鳞癌侵袭转移的过程中势必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的异常表达，如抑癌基因的下调表达，癌基因的上调表达。因此探索这些与喉鳞癌侵袭转移相关的基因表达紊乱的分子生物学机制着重要的临床意义。
[0003]microR NAs (miRNAs)是目前新发现的一类长度约为22nt的内源性非蛋白编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，它能够与其相应靶基因信使RNA (mRNA)的3’端非翻译区(3’ -UTR区)结合，从而降解mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNAs与肿瘤关系密切，充当癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤细胞生长、增殖、分化、凋亡、恶性间质转化、干细胞分化等方面发挥重要作用。
[0004]甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。DNA甲基化则是最常见的甲基化修饰方式之一，可引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。其是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下，以s_腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5’ -CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG是指由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的一个2个核苷酸的链，当中的P是C和G之间的磷酸，在哺乳动物中CpG以两种形式存在:一种是分散于DNA序列中；另一种呈现高度聚集状态，人们称之为CpG岛(CpG island)，其是由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重复序列，常位于CATbox附近，可以调控转录的效率。人类基因组中大小为IOO-1OOObp左右，富含CpG 二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关，因此DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。
[0005]由于DNA甲基化与人类肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题。以往研究表明大量抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测、诊断、分级以及预后评估。因此抑癌基因转录区CpG岛的甲基化状态研究已经成为肿瘤领域中表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。
[0006]发明人通过microRNA 芯片(Agilent human 8*15k mi RNA V12.0)检测了喉鳞癌患者及同患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍(P〈0.05);而Hsa-miR-145-5p表达水平与喉鳞癌患者不良临床参数成负相关，且表达水平越低，喉鳞癌患者的预后越差。因此发明人结合Hsa-miR-145-5p启动子甲基化的思路，探索喉鳞癌中Hsa-miR-145-5p转录抑制的分子生物学机制。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供Hsa-microRNA-145-5p(Hsa-miR-145-5p)启动子区域甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化水平测序的特异性引物。本发明的思路是:发明人基于microRNA芯片(Agilent human 8*15k miRNA V12.0)检测了喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍(P〈0.05);而Hsa-miR-145-5p表达水平与喉鳞癌患者不良临床参数成负相关，且表达水平越低，喉鳞癌低表达患者的预后不良越差。因此Hsa-miR-145-5p作为抑癌基因在喉鳞癌中发挥重要生物学作用。为此，本发明在于明确Hsa-miR-145-5p为何在喉鳞癌组织及细胞株H印-2、TU-177中表达减低，进一步结合DNA甲基化的思路，调取了 Hsa-miR-145-5p启动子1425个碱基序列，并进行甲基化生物信息学预测，瞄定了 336个碱基中可能有11个高甲基化位点(CpG site)，根据这些碱基，设计了 3段PCR扩增引物，及相应的经亚硫酸盐修饰后的焦磷酸定量测序引物，以明确这11个位点的甲基化水平，从而试图阐明Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌中转录抑制的表观遗传学机制。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的:
一种人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物，其中所述的引物为Hsa-microRNA-145-5p启动子区域存在高甲基化位点碱基序列的PCR扩增引物及焦磷酸定量甲基化测序特异引物；所述的PCR扩增引物包括3对，分别为miR-145-Fl:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, miR-145-Rl:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ；m i R -1 4 5 - F I:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, m i R -1 4 5 - R I:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ;miR-145_F2:GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT,miR-145-R2:Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA ;所述的焦磷酸定量甲基化测序特异引物包括 miR-145-S2:AGTTTTGGGGGTGGG ;miR-145_S5:TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA ;miR-145_S4:TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
[0009]上述人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物在制备用于喉鳞癌筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测试剂盒中的用途，尤其应用于喉鳞癌离体组织或喉鳞癌细胞系ifep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p启动子甲基化水平检测。
[0010]本发明所述焦磷酸定量甲基化测序技术是指PyroMark CpG Assays技术，由QIAGEN公司研发,其是基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)研发的CpG位点甲基化定量分析检测体系。PyroMark CpG Assays基于引物延伸的Pyrosequencing技术,通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程，通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对 目标位点的甲基化程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。[0011]与现有技术相比，其可以完全克服BSP法大量挑取单克隆测序的繁琐及较高假阳性率，以及MSP法不能获得定量分析结果的缺点。其具有检测全面、检测准确、检测快速并能将甲基化水平定量化的优点。
[0012]本发明突出的实质特点和显著的技术效果是:基于焦磷酸定量甲基化测序技术，利用甲基化生物信息学预测手段，针对Hsa-miR-145-5p启动子区域1467碱基中可能存在11个高甲基化点的336个碱基区域。为此，本发明提供了三段特异性PCR引物及焦磷酸测序引物，有效检测出这11个位点的甲基化定量水平，明确了喉鳞癌细胞系H印-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p表达下调的表观遗传学机制。这无疑对喉鳞癌或者其他人类恶性肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测具有重要的医学价值及临床意义。[0013]【专利附图】
【附图说明】
图1:qRT-PCR 检测 Hsa-miR-145-5p 在 Hep-2, TU-177 及对照株 HOK 中的表达；A:miR-145-5p在HOK中相对表达量为6.79 ± 1.29，分别高于其在H印-2中的相对表达量1.00(P=0.001)及在 TU-177 中的相对表达量 1.17±0.53 (P=0.002)；
图2:Hsa-mir-145-5p启动子甲基化位点预测结果I (通过MethPrimer -DNA甲基化CpG岛预测及引物设计在线软件预测)；
图3:Hsa-mir-145_5p启动子甲基化位点预测结果2 (通过CpG Island Searcher预
测)；
图4:H印-2、TU-177及HOK三个细胞株11个位点的甲基化测序定量显示图。
[0014]图5:H印-2、TU_177及HOK 11个位点甲基化水平曲线图，灰色框所示为高甲基化的2-7位点；
图6:H印-2、TU-177及HOK中11个位点甲基化平均水平柱状图；
图7: Hep-2, TU-177及HOK中2_7位点甲基化平均水平柱状图；
图8:实施例PCR反应条件。
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0016]一、实验所需主要试剂、耗材及仪器
【权利要求】
1.一种人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物，其特征在于，所述的引物为Hsa-miCiORNA-145-5p启动子区域存在高甲基化位点碱基序列的扩增引物及焦磷酸定量甲基化测序的特异引物；所述的扩增引物为3对，包括miR-145-Fl:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, miR-145-Rl:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ；m i R -1 4 5 - F I:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, m i R -1 4 5 - R I:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ;miR-145_F2:GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT,miR-145-R2:Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA ;所述的焦磷酸定量甲基化测序特异引物包括 miR-145-S2:AGTTTTGGGGGTGGG, miR-145_S5:TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA, miR-145_S4:TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
2.权利要求1所述的人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物在制备用于喉鳞癌筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的人微小RNA启动子甲基化扩增及测序引物应用于喉鳞癌离体组织或喉鳞癌细胞系ifep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p启动子甲基化水平检测。
【文档编号】C12N15/11GK103571830SQ201310359969
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】高伟, 王斌全, 张春明, 陈钢钢, 皇甫辉, 温树信, 张海利, 冯彦 申请人:山西医科大学第一医院