大豆生物钟基因GmFKF2及其编码蛋白与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种大豆GmFKF2蛋白，其为：1）由SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2）在SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。本发明同时提供了编码上述蛋白的基因GmFKF2，过表达所述基因可明显促进植物开花，延长生育期。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题，光周期敏感性问题和引种问题。
【专利说明】大豆生物钟基因GmFKF2及其编码蛋白与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一个大豆生物钟基因，及其编码蛋白，以及他们在植物光周期和开花时间调节中的应用。
【背景技术】
[0002]大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种，生育期也受环境光周期的制约。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破光周期对大豆开花的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品种。
[0003]对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的(Mouradov等，2002 ;Turck等，2008 )。其中重要的一个调控途径是生物钟调控系统。拟南芥生物钟系统的中央振荡器主要有三个重要组分:即CCAl(Circadian Clock Associatedl),LHY (Late Elongated Hypocotyl)和 TOCl (Timing Of CAB Expressionl)。 CCAl 和 LHY各编码MYB相关的转录因子,TOCl是一个伪反应调节因子(Pseudo-response regulator)。凌晨时，CCAl和LHY的转录达到高峰，其蛋白结合在TOCl启动子的夜晚元件(Eveningelement, EE)上协同促进TOCl的转录。而在暗中，TOCl表达逐渐升高并在深夜达到高峰，高表达的TOCl通过一种未知的机制促进CCAl和LHY的表达并使其在凌晨达到高峰，三者形成一个反馈促进环(Feedback loop),并有节律的振荡(Gould等，2006 ；Barak等，1998 ；Alabadi 等，2002 ；Mizoguchi 等，2002 ；Staiger 等，2002)。
[0004]三个相关的光受体F-BOX 蛋白，ZTL (ZEITLUPE), LKP2 (L0V KELCH PR0TEIN2)以及 FKFl (FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-B0X1)调控蛋白 TOCl 和 PRR5 (PSEUD0RESPONSE RE⑶LAT0RS5)的稳定性，进而协调生物钟中央振荡器的步调与稳固性(Baudryet al.，2010)。GI蛋白通过直接与这些F-BOX蛋白结合，对生物钟中央振荡器的调控也起到一定的作用(Kim et al., 2007; Sawa et al.，2007)。FKFl和GI在拟南芥光周期开花途径中起促进作用，而且主要是通过FKFl-G1-⑶Fl⑶-FT这条途径实现的。FKFl和GI的转录受生物钟调控,在光照起始后8~12小时表达(Fowler et al., 1999; Park etal., 1999; Nelson et al.，2000)，此时长日下的植物处于光照时期，而短日下的植物处于黑暗时期。光照下，FKFl和GI (GIGANTEA)的协同表达有利于FKFl-GI复合体的形成(Sawaet al., 2007 ；Fornara et al., 2009)。这种光依赖的相互作用是通过FKFl的LOV结构域实现的。FKFl是生物钟调控元件，它作为F-BOX家族的一员，是一种泛素连接酶，调节靶蛋白泛素化，通过26S蛋白酶体降解靶蛋白。FKFl的靶蛋白包括两个转录因子⑶FKCYCLINGDOF FACT0R1)和 CDF2，它们是 CO (C0NSTANS)的转录抑制子(Imaizumi et al., 2005 ；Fornara et al.，2009)。ZTL和LKP2在调控CDF降解方面与FKFl存在功能冗余现象。总之，长日下，GI稳定FKFl和相关蛋白，导致CO抑制子降解，从而使CO的转录被激活。长日条件下稳定的CO蛋白激活FT (FLOWERING LO⑶S T)的表达，促进开花。
[0005]大豆是典型的短日植物，又是古四倍体，因此，研究大豆生物钟调控基因FKFlJfl明其功能，对揭示大豆光周期调节及植物生物钟系统的进化和多样性具有重要意义，对于解决大豆光周期广适应性问题、扩大大豆的种植生态区和提高产量至关重要。截止目前为止，通过调节大豆生物钟调控基因FKFl来改变植物对光周期的敏感性和开花时间尚未见报道。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种大豆生物钟基因GmFKF2及其编码蛋白与应用。
[0007]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种大豆GmFKF2蛋白，其为由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0008]应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。
[0009]因此，本发明的大豆GmFKF2蛋白还包括SEQ ID N0.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有大豆GmFKF2蛋白同等活性的由大豆GmFKF2蛋白衍生得到的蛋白质。如大豆GmFKFl蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.8 所示。
[0010]本发明还提供了编码所述蛋白的大豆GmFKF2基因。
[0011]进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0013]本发明还提供了含有所述基因的载体。
[0014]作为优选，所述载体为植物表达载体P35S-GW。
[0015]本发明还提供了含有所述基因的工程菌。
[0016]本发明所述的大豆GmFKF2蛋白，其氨基酸序列与拟南芥FKFl (AtFKFl)蛋白的氨基酸序列之间的相似性为81.4%，在保守功能域(MYB DNA-binding domain)更与AtFKFl蛋白高度相似。因此推测大豆GmFKF2基因与拟南芥FKFl基因功能类似，大豆GmFKF2基因也具有促进开花的功能。大ii GmFKF2基因王要在大ii的叶片中表达，在开花期的弟二复叶中
表达量最闻。
[0017]本发明将大豆GmFKF2基因构建到表达载体p35S-GW上，并在大肠杆菌DH5a中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将P35S-GW携带的GmFKF2基因转入模式植物拟南芥中，获得拟南芥转化植株。结果表明，GmFKF2基因具有降低植物对光周期的敏感性并促进拟南芥开花的作用。
[0018]本发明还提供了用于扩增大豆GmFKF2基因的引物对，包括正向引5’-ATGGCCATGCCAAAAGAGAAA-3’ 和反向引物 5’-TTCACAGGTCAGAGTCATGTCGA-3’ ；
[0019]以及用于扩增大豆GmFKFl基因的引物对，包括正向引物5’ -ATGGCTGTGACAAAAGAGAAAGAGGAT-3’ 和反向引物 5’ -TCACAGGTCAGAGTCCTGTCGAC-3’。
[0020]本发明还提供了所述大豆GmFKF2基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。
[0021]进一步地，所述的应用是在植物体内过量表达大豆GmFKF2基因，促进植物开花，延长植物生育期。
[0022] 本发明的有益效果在于:
[0023](I)提供了大豆GmFKF2基因及其编码蛋白GmFKF2 ；
[0024](2)通过在植物中过表达GmFKF2基因延长植物生育期，促进植物开花。
[0025]因此，大豆GmFKF2基因及其编码的蛋白可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥FKFl基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。
[0027]图2为克隆中间载体pGWCm的结构示意图。
[0028]图3A为长日条件下大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2在大豆中不同组织器官的表达水平。
[0029]图3B为短日条件下大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2在大豆中不同组织器官的表达水平。
[0030]图3 中:
[0031]单叶期的组织器官:R—根；HH—下胚轴出H—上胚轴；C—子叶；U—单叶；SAM—茎顶端；
[0032]开花期的组织器官:R—根；St —茎；U —单叶；T1_T5 —第一复叶、第二复叶、第三复叶、第四复叶、第五复叶；Pt —叶柄；F—花。ACTll为内参基因。
[0033]图4A为长日条件下大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2在大豆中不同发育时期的表达水平。
[0034]图4B为短日条件下大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2在大豆中不同发育时期的表达水平。
[0035]图 4 中:
[0036]U:单叶期；T1_T4:第一复叶期、第二复叶期、第三复叶期、第四复叶期；F:开花期；Un1:单叶；lstT:第一复叶；2ndT:第二复叶；3rdT:第三复叶；4thT:第四复叶；5thT --第五复叶；A:地上部。ACTll为内参基因。
[0037]图5为大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2的昼夜节律表达模式。
[0038]图6为植物表达载体p35S-GW的结构示意图。
[0039]图7为大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2在转基因植物细胞核中的定位。
[0040]图8为大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2编码蛋白互作。
[0041]图9为大豆生物钟调控基因GmFKFl和GmFKF2转化拟南芥，导致拟南芥早开花。
【具体实施方式】[0042]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0043]实施例1大豆生物钟基因GmFKFl和GmFKF2的克隆
[0044]利用正向引5’-ATGGCTGTGACAAAAGAGAAAGAGGAT-3’ 和反向引物5’ -TCACAGGTCAGAGTCCTGTCGAC-3’ 通过 RT-PCR 的方法从大豆垦农 18 (Glycine maxL.Kennongl8)中扩增 GmFKFl 基因。
[0045]利用正向引物5’-ATGGCCATGCCAAAAGAGAAA-3’和反向引物5’ -1TCACAGGTCAGAGTCATGTCGA-3’ 通过 RT-PCR 的方法从大豆垦农 18 (Glycine maxL.Kennongl8)中扩增 GmFKF2 基因。
[0046]PCR反应程序为:95 V预变性5min，95 V变性30S，50°C退火35S，72 V延伸lmin50S，30 个循环，后 72°C延伸 IOmin0
[0047]GmFKFl和GmFKF2克隆载体的获得:将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图2所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16°C进行12小时连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a，并在其中扩增，筛选阳性克隆，并测序。
[0048]获得的GmFKFl基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。获得的GmFKF2基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
[0049]实施例2大豆生物钟基因GmFKFl和GmFKF2编码蛋白的氨基酸序列分析
[0050]大豆生物钟基因GmFKFl和GmFKF2编码的GmFKFl和GmFKF2蛋白序列与拟南芥FKFl (AtFKFl)蛋白之间的相似性很高:GmFKFl和GmFKF2与AtFKFl的相似程度为83.5%和 81.4%, GmFKFl 和 GmFKF2 的`同源性为 95.5%,且在保守功能域(MYBDAN-binding domain)高度相似，如图1所示。因此推测GmFKFl和GmFKF2与拟南芥FKFl的功能类似，具有促进植物开花的活性。
[0051]实施例3大豆生物钟基因GmFKFl和GmFKF2在大豆中不同组织器官及不同发育时期的表达水平
[0052]利用实时定量突光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆生物钟基因GmFKFl和GmFKF2在大豆中的表达。实时荧光定量PCR采用ABI StepOne进行，用SYBRGreen I检测突光信号。
[0053]FKFl 上游引物:5’ -GCATAAAACCAGACCCTCTTCTCTC-3’ ；
[0054]FKFl 下游引物:5’ -CAATCATGTAATAGTGGCTCATATAC-3’ ；
[0055]FKF2 上游引物:5’ -AAAGATTTTGGGTGGGTTTCC-3?；
[0056]FKF2 下游引物:5 ’ -GTGTAATAGACGGTGGAGGAG-3，。
[0057]反应体系为:
[0058]
【权利要求】
1.一种大豆GmFKF2蛋白，其为: 1)由SEQID N0.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或 2)在SEQID N0.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的大豆GmFKF2基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.根据权利要求4所述的载体,其特征在于，所述载体为植物表达载体p35S-GW。
6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
7.用于扩增大豆GmFKF2基因的引物对，其特征在于，正向引物5’ -ATGGCCATGCCAAAAGAGAAA-3’ 和反向引物 5’ -TTCACAGGTCAGAGTCATGTCGA-3’。
8.权利要求2或3所述的基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是在植物体内过量表达大豆GmFKF2基因，促进植物开花，延长`植物生育期。
【文档编号】C12N15/29GK103497239SQ201310359816
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】傅永福, 张晓玫, 李芳
申请人:中国农业科学院作物科学研究所