专利名称：采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的一种采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期 的方，尤其涉及一种培育转基因植物的方法。
背景技术：
生育期对作物的种植区域和种植面积有着重要影响，日照长度和自身的光周期反 应特性共同影响作物的生长发育进程，决定生育期长短和适应范围。不同地区、不同温度和 日照条件下，植物光周期反应敏感品种的开花期、成熟期和株高等性状会发生较大的改变， 影响产量潜力的发挥。大豆是光周期反应敏感的短日照植物，其开花时间是重要的数量遗传性状，大豆 在光周期反应的早期研究中被作为重要的模式植物。通过利用分子遗传学的方法已鉴定出 日长反应所必须的大量基因，这些基因在光信号转导、生物钟以及开花多途径的整合过程 发挥各自的功能。因此，利用生物工程技术改变植物光周期反应，进而培育性状优良的新品种成为 一种有效的育种方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，该方法为将GMGBP蛋白的编码基因导入 目的植物获得转基因植物，所述转基因植物的表型至少为下述3种中的一种1)所述转基 因植物的株高大于所述目的植物；2)所述转基因植物的节数大于所述目的植物；3)所述转 基因植物的开花时间早于所述目的植物；所述GMGBP蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。其中，序列2由612个氨基酸构成，含有SKIP/SNW(从氨基端第190-356位)结构 域。所述GMGBP蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1第83-1921位核苷 酸序列。序列1由2223个核苷酸残基构成，其中ORF为从5'端第83-1921位。所述目的植物可以为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物。所述双子叶植物可以为烟草。所述GMGBP蛋白的编码基因通常通过植物表达载体导入所述目的植物。所述植物表达载体含有启动子和连接在所述启动子下游的GMGBP蛋白的编码基 因。所述启动子可以为下述任一启动子花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启 动子，优选为花椰菜花叶病毒35S启动子。所述表达载体可以为pBI 121-GMGBP，所述pBI 121-GMGBP为将所述GMGBP蛋白的编 码基因插入PBI121的多克隆位点得到的重组载体。
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本发明的实验证明转入大豆GMGBP(大豆赤霉素结合蛋白)的转基因植物植株高 大，茎间距增大，早花和早熟。本发明改变植物品种的开花期和成熟期的方法，克服了以往 常规育种中，通过杂交选择早熟品种或晚熟品种，或通过辐射和化学试剂进行诱变等常规 方法进行品种改良所需时间较长，并且不能预计后代中突变的程度或方向的弱点，用这些 基因进行品种改良是一种相对于传统方法而言特别有效并且简单可靠的方法，可应用于培 育和改良植物的新品种。
图1为表达载体pBI121-GMGBP的质粒图谱。图2为长日照下表达GMGBP的转基因植物4周龄苗与野生型植物对照4周龄苗的 比较。图3为长日照(LD)和短日照(SD)下种于土中转基因植物3个月苗与野生型植物 对照3个月苗的比较。图4为GA激素对转基因植物的影响。图5为转基因植物和野生型植物对照在暗条件下培养的对照。图6为将转基因植物和对照子叶展开后移于黑暗下，观察下胚轴和子叶的变化。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1 转GMGBP植物的培育一、植物表达载体pBI 121-GMGBP的构建Trizol试剂提取大豆(Glycine max)(东北农业大学大豆科学研究所)总RNA， 反转录合成cDNA第一条链作为模板，以正义引物CGTCTAGACACAGAATCATGGCCACTCT (下划 线部分为Xba I酶切位点)，反义引物GCGAGCTCCTAATGCCCTCTTTCAAATC (下划线部分为 Sac I酶切位点)，进行PCR反应，PCR条件为94°C 5min ；35个循环94°C 30s, 60°C 30s， 72 °C 2. 5min ；72°C 5min。将PCR产物在0. 8 %琼脂糖凝胶上电泳检测，结果表明PCR产物 为1. 8kb。经测序，该PCR产物具有序列表中的序列1的第74-1921位核苷酸序列。序列表 中的序列1的ORF为第83-1921位核苷酸，编码序列表中序列2所示的蛋白，将该蛋白命名 为 GMGBP。将PCR产物和载体pBI121 (购自CL0NETECH公司)分别使用限制性内切酶Xba I 和Sac I双酶切，回收酶切后约为1. Skb的PCR片段和酶切后约11. 2kb的载体大片段，将 二者连接构建重组表达载体PBI121-GMGBP，该重组表达载体的启动子为CaMV35S，其结构 示意图如图1所示。二、转GMGBP烟草的培育将上述获得的植物表达载体PBI121-GMGBP采用冻融法转化到根瘤农杆菌 LBA4404(Invitrogen 公司，产品编号 18313015)中得到重组菌 LBA4404/pBI 121-GMGBP。采用农杆菌介导法将重组菌LBA4404/pBI121-GMGBP与烟草(品种为 PetiteHavana SR1，购自LEHLE SEEDS，产品编号NT-02，以下称为野生型烟草)叶盘共培
4养3天后，再将侵染的叶盘移到含有100mg/L卡那霉素(Kan)和500mg/L头孢霉素(Cef) 的芽诱导培养基(MS培养基中的大量盐和微量盐，MS培养基中的铁盐，3%蔗糖，0. Img. Γ1 萘乙酸，2!^·!^ 6-苄基腺膘呤，0.7%琼脂，其余为水，PH= 5.8)上培养。培养约一月以 后，丛生芽长至2 3cm，将其切下，移到含有100mg/L卡那霉素(Kan)的生根培养基(MS培 养基中的大量盐和微量盐，MS培养基中的铁盐，3%蔗糖，0.7%琼脂，其余为水，PH = 5. 8) 上，10天左右开始生根，2 3周后得到正常生根的60株TO代转GMGBP烟草。将获得的60株TO代转GMGBP烟草提取DNA后，用正义引物 CGTCTAGACACAGAATCATGGCCACTCT,反义引物GCGAGCTCCTAATGCCCTCTTTCAAATC 进行 PCR 鉴 定，结果显示有20株为阳性(得到1. 8kb PCR产物)，转化率为33%。选取上述PCR鉴定为阳性植株的TO代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20的植 株进行Northern blot分析，以野生型烟草为对照。结果显示，TO代转GMGBP烟草中的编 号为5、15和20植株均有杂交信号，野生型烟草则没有杂交信号，表明外源基因GMGBP已经 整合到TO代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20植株的基因组中，并在转录水平上得到有 效的表达。将TO代转GMGBP烟草中的编号为5、15和20植株所结的种子及该种子所长成的 植株称为Tl代，将Tl代转GMGBP烟草植株所结的种子及该种子所长成的植株称为T2代。实施例2 转GMGBP烟草T2代功能分析1、转基因烟草表型观察将从实施例1获得的T2代转GMGBP烟草的种子灭菌后播种于MS培养基上，16h光 /8h暗(长日照)，250C生长1个月获得30株T2代转GMGBP烟草的4周龄苗，以同样方法 获得30株野生型烟草4周龄苗为对照，取T2代转GMGBP烟草第4株4周龄苗(GMGBP4)、第 15株的4周龄苗(GMGBP15)与野生型烟草4周龄苗(野生型)拍照(如图2所示)，从图 2中可以看出，与野生型相比，GMGBP4和GMGBP15根均变短，叶片变小，节间距大。再分别将20株T2代转GMGBP烟草的4周龄苗移至土中在长日照(16h光/8h暗， LD)和短日照(8h光/16h暗，SD)条件下培养3个月，获得10株LD条件下T2代转GMGBP 烟草的3个月苗和10株SD条件下T2代转GMGBP烟草的3个月苗，以同样的方法获得10 株LD条件下野生型烟草的3个月苗和10株SD条件下野生型烟草的3个月苗为对照，观察 不同条件下T2代转GMGBP烟草的3个月苗与不同条件下野生型烟草的3个月苗的状态植 株的株高、节数开花时间，具体见表1，从表1中可以看出转GMGBP烟草株高在LD和SD条件 下高于CK 4-5cm ；节数增多，开花时间均提前；表1为不同日照条件下野生型烟草和T2代转GMGBP烟草的表型 将LD条件下的T2代转GMGBP烟草的3个月苗(LD GMGBP)和SD条件下的T2代 转GMGBP烟草的3个月苗(SD GMGBP)拍照观察(如图3所示)，从图3中可以看出，以LD 条件下的野生型烟草的3个月苗(LD CK)和SD条件下的野生型烟草的3个月苗(SD CK) 为对照，无论在LD还是SD条件下，T2代转GMGBP烟草的3个月苗比野生型烟草的3个月 苗高大、开花时间提前3-5天，而且LD GMGBP比SD GMGBP明显高大。
2、转GMGBP烟草植株对赤霉素(GA3)的效应将从实施例1获得的T2代转GMGBP烟草的种子灭菌后播种于MS培养基上，16h光 /8h暗，25°C条件下生长，待2周后获得20株T2代转GMGBP烟草，将10株T2代转GMGBP烟 草移于加有1 μ M GA3的MS培养基上，生长3周后获得GA处理3周的Τ2代转GMGBP烟草， 其余另外10株Τ2代转GMGBP烟草继续在MS培养基上生长3周后获得未加GA3的MS培养 基生长3周的Τ2代转GMGBP烟草，以在加GA3的MS培养基生长3周的野生型烟草(CK+GA) 和在未加GA3的MS培养基生长3周的野生型烟草(CK)为对照，拍照观察GA处理3周的Τ2 代转GMGBP烟草(GMGBP+GA)和未加GA生长3周的Τ2代转GMGBP烟草(GMGBP)的表型，如 图4a所示，图4a为长日照下转基因植物与野生型植物对照在添加GA3的MS培养基生长3 周的比较。从图4a中可以看出，以野生型烟草(CK)和经GA处理3周的野生型烟草(CK+GA) 为对照，GMGBP+GA节间距大于CK+GA处理植株。再取上述GMGBP+GA、CK+GA、GMGBP、CK移于土壤中继续生长2个月，分别获得在 土中生长2个月的5株的GMGBP+GA1、CK+GA1、GMGBPU CK1。观察区别，如图4b所示)，图 4b为经GA处理的转GMGBP烟草在土中生长2个月的表型。从图4b中可以看出，以CKl和 CK+GA1 为对照，CK+GA1 比 CKl 高大，GMGBP+GA 1 比 GMGBPl 高大。3、转GMGBP烟草暗培养叶片的形态将5株上述T2代转GMGBP烟草4周龄苗移至土中在16h光/8h暗条件下培养5 个月，获得5株T2代转GMGBP烟草5个月苗(GMGBP-5)，将其中编号为4和15的T2代转 GMGBP烟草5个月苗(即GMGBP4-5和GMGBP15-5)剪取从顶端至底端数第三节位的叶片， 并且放于无菌水中25°C，暗下放置20天，以同样的方法处理野生型烟草获得野生型烟草5 个月苗为对照(野生型_5)，观察区别，如图5所示，从图5中可以看出，与野生型烟草植株 5个月苗相比，T2代转GMGBP烟草第4植株5个月苗(GMGBP4-5)和T2代转GMGBP烟草第 15植株5个月苗(GMGBP15-5)的叶片绿色褪去变黄。将从5株T2代转GMGBP烟草与5株野生型烟草植株获得的子叶展开后移于黑暗 下，观察下胚轴和子叶的变化，如图6所示，从图6中可以看出，A为5株T2代转GMGBP烟 草，B为5株野生型烟草，A中所有T2代转GMGBP烟草的子叶小，下胚轴伸长明显。综上所述，转GMGBP的烟草比野生型烟草的成熟时间早，GMGBP促进了植物的成熟。
权利要求
一种培育转基因植物的方法，为将GMGBP蛋白的编码基因导入目的植物获得转基因植物；所述转基因植物的表型至少为下述3种中的一种1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；2)所述转基因植物的节数大于所述目的植物；3)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；所述GMGBP蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述GMGBP蛋白的编码基因的核苷酸序 列为序列表中的序列1第83-1921位核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者单 子叶植物。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为烟草。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述GMGBP蛋白的编码基因通过 植物表达载体导入所述目的植物。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述植物表达载体含有启动子和 连接在所述启动子下游的GMGBP蛋白的编码基因。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述启动子为下述任一启动子花 椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子，优选为花椰菜花叶病毒355启动子。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为 PBI121-GMGBP，所述pBI121-GMGBP为将所述GMGBP蛋白的编码基因插入pBI121的多克隆 位点得到的重组载体。
全文摘要
本发明公开了一种采用大豆赤霉素结合蛋白基因调节植物光周期的方法。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，为将GMGBP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，所述转基因植物的表型至少为下述3种中的一种1)所述转基因植物的株高大于所述目的植物；2)所述转基因植物的节数大于所述目的植物；3)所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；所述GMGBP蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明转入大豆GMGBP(大豆赤霉素结合蛋白)的转基因植物植株高大，茎间距增大，早花和早熟。
文档编号C12N15/82GK101906426SQ20101018002
公开日2010年12月8日 申请日期2010年5月20日 优先权日2009年6月2日
发明者李文滨, 李永光, 罗秋兰, 赵琳 申请人:李文滨