大豆抗疫病基因RpsQ的分子标记Insert144及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术工程和农作物抗病遗传育种领域，具体涉及一种大豆抗 疫病基因RpsQ的分子标记Insertl44及其应用。
【背景技术】
[0002] 由大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆 生产中的一种毁灭性病害。目前全世界每年因大豆疫病造成的经济损失大约为10亿美元 (Tyler,2007)〇
[0003] 防治大豆疫病最为经济、有效且环境安全的方法是种植抗病品种。大豆对疫病的 抗性表现为质量性状抗性和数量性状抗性。质量性状抗性由单基因控制。目前已经有25 个抗性基因被定位到不同的染色体上。
[0004] 大豆疫霉群体结构复杂，容易产生新的毒力型。大豆疫霉新毒力型的出现，导致单 基因抗性品种的抗性丧失。大量研究表明，大豆抗疫病被克服的速度正在加快。通常单基 因抗性品种的使用年限为8-15年，为了延长抗病品种的使用年限，育种策略是将不同的抗 性基因叠加，因此大力挖掘和鉴定新的抗性基因显得尤为必要。
[0005] 大豆品种齐茶豆1号是山东省农业科学院作物研究所1995年审定通过的品种，原 代号济3045。该品种通过以鲁豆4号为母本，北京小黑豆为父本杂交选育而成，高抗大豆孢 囊线虫1、3号小种，抗病毒病，抗倒伏。前期研究结果表明，齐茶豆1号对大豆疫霉有广谱 的抗性。因此，为能够进一步验证和利用大豆品种齐茶豆1号的抗疫病特性，定位抗疫病基 因对提高育种效率和推进大豆抗疫病工作具有重要意义。
[0006] 分子标记辅助检测，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型 与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高大豆抗疫病 基因的检测效率，可见开发与齐茶豆1号抗疫病基因共分离的分子标记对提高育种效率， 加速抗疫病育种工作进程具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种与大豆抗疫病基因RpsQ共分离的分子标记及其应 用。
[0008] 为达到以上目的，本发明提供了 一种大豆抗疫病基因RpsQ的分子标记 Insertl44,其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[0009] 所述分子标记位于大豆3号染色体的SSR标记BARCS0YSSR_03_0165 (0. 6cM)和 BARCS0YSSR_03_0176(0. 9cM)之间。所述分子标记与大豆抗疫病基因RpsQ的遗传距离为 0cM〇
[0010] 具体地，本发明中与大豆抗疫病基因RpsQ共分离的分子标记Insertl44通过如下 方法获得：
[0011] 利用吉科豆2号X齐茶豆1号杂交组合衍生的F2:3为作图群体，研究齐茶豆1号 对大豆疫病抗性的遗传基础；利用已公布的大豆SSR标记，筛选在亲本和抗、感池上都具有 多态性的分子标记，将具有多态性的SSR标记进行群体验证并构建连锁图谱；利用定位区 间预测的候选基因序列，设计特异引物在吉科豆2号和齐茶豆1号上扩增测序，开发InDel 标记，并进行群体验证，获得与抗疫病基因RpsQ共分离的标记。从而为大豆抗疫病育种提 供辅助选择分子标记，提高育种效率，加速抗疫病育种工作进程。
[0012] 本发明还提供了分子标记InSertl44的PCR引物，其中，上游引物序列如SEQID No. 2所示，下游引物序列如SEQIDNo. 3所示。
[0013] 本发明还提供了一种鉴定大豆抗疫病基因RpsQ的方法，其中，以待测植株样品的 基因组DNA作为模板，用本发明所述的PCR引物进行PCR扩增，能扩增出SEQIDNo. 1所示 片段的植株样品为含有大S抗疫病基因RpsQ的植株。
[0014] 可选的，所述方法包括以下步骤：
[0015] 1)提取待测大?的基因组DNA;
[0016] 2)以待测大豆的基因组DNA为模板，利用所述PCR引物进行PCR扩增反应；
[0017] 其中，PCR扩增反应使用的扩增体系以10μ1计为：0. 5μ1浓度为50ng/μ1的大 豆基因组DNA模板，4μ1的2XPCRMasterMix，浓度为ΙΟμΜ的上、下游引物各0. 2μ1，用 ddH20 补足至 10μ1。
[0018] PCR扩增反应使用的反应条件为：94°C3分钟；94°C30秒，58°C30秒，72°C30秒， 共35个循环；72°C10分钟。
[0019] 3)结果鉴定：能扩增出SEQIDNo. 1所示片段的植株样品为含有大豆抗疫病基因 RpsQ的植株。
[0020] 其中，SEQIDNo. 1所示片段的的长度为581bp，如果能够扩增出581bp的产物，那 么判定待测的大?样品为抗疫病大?品种。
[0021] 本发明还提供了用于PCR检测抗疫病大豆的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求 3所述的PCR引物。
[0022] 可选的，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反应缓冲液和标准阳 性模板中的一种或多种。
[0023] 本发明还提供了所述分子标记Insert144在鉴定抗疫病大豆品种中的应用。
[0024] 本发明还提供了所述分子标记Insertl44在制备转基因植物中的应用，其中，所 述基因为大豆抗疫病基因RpsQ。
[0025] 本发明还提供了所述鉴定大豆抗疫病基因RpsQ的方法在大豆育种改良中的应 用。
[0026] 本发明首次公开了来自大豆品种齐茶豆1号的大豆抗疫病基因RpsQ，该基因位于 大豆3号染色体，该基因在大豆抗疫病育种中具有较高的应用价值。本发明还给出了RpsQ 的分子标记Insertl44,该分子标记与大豆抗疫病基因RpsQ极显著相关，呈共分离标记特 征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可以实现对大豆抗疫病植株的快速鉴定检测。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明实施例1中齐茶S1号和吉科S2号接种大疫霉菌株Ps41_l后 6天生长情况。
[0028] 图2为本发明实施例1中大豆抗疫病基因RpsQ遗传连锁图谱。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0030] 实施例1
[0031] 实施例1用于说明大豆抗疫病基因RpSQ的候选基因及其共分离的分子标记 Insertl44的获得
[0032] 1、齐茶豆1号的抗性遗传分析
[0033] 以抗病品种齐茶豆1号（山东省农业科学院作物研究所1995年审定通过的品种， 原代号济30)为父本，感病品种吉科豆2号（吉林省农业科学院生物技术室皂角DNA导入 吉林30号品种，从后代选出变异株，培育而成）作为母本，杂交产生匕代，Fi代自交产生F2 代，F2代自交产生的210个F2:3家系用作抗性遗传分析、抗病基因鉴定及作图群体。采用下 胚轴创伤接种方法，将每个家系鉴定20-25个植株对大豆疫霉菌株Ps41-1的反应。接种后 在23-25Γ，湿度为100%的条件下，保湿48小时，然后传入温室培养，7天后进行病情调查 (结果如图1所示）。参照Gordon等（2006)方法评价标准，规定植株死亡率小于20%的家 系为纯合抗病家系，死亡率大于80 %的为纯合感病家系，而死亡率为21% -79 %的家系为 抗性分1?家系，调查F2:3家系的抗、分尚、感病家系的分尚比，分析齐茶1号对大S疫病的 抗性遗传规律。
[0034] 吉科豆2号和齐茶豆1号杂交组合衍生的210个F2:3家系对菌株Ps41_l的抗性 鉴定结果表明，纯合抗病家系为49个，纯合感病家系为49个，抗性分离家系为112个。经 X2检验符合期望的1:2:1的分离比例，表明齐茶豆1号对大豆疫病的抗性由一个显性单基 因控制，将该基因命名为RpsQ。
[0035] 2、大豆基因组DNA的提取和抗感池构建
[0036] 采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱）（TIANGENBIOTECH)提取2个亲 本及210个F2:3家系的基因组DNA。每个F2:3家系分别取20个单株叶片样品，等量混合放 入2. 0ml的离心管中。置于液氮中研磨成粉末，向离心管中加入400μ1缓冲液LP1和6μ1 RNaseA(10mg/ml)，旋涡振荡lmin，室温放置lOmin;加入130μ1缓冲液LP2,充分混匀，旋 祸振荡lmin;1