大豆开花基因FL1(PRR-like)及其编码蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大豆开花基因FLl(PRR-like)及其编码蛋白。
【背景技术】
[0002] 大豆为人类提供重要的植物蛋白质和油份。在世界范围内，北至高炜度的北欧瑞 典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等广泛区域内均有大豆栽培，但单个品种或种质资源 一般适宜种植的炜度跨度较小，这种区域适应性与大豆的生育期基因密切相关。迄今已发 现了 10个主要影响大豆开花期和成熟期（生育期）基因位点E1-E9和J。但大豆的开花期 是一个数量性状，受多个基因同时控制，发掘与大豆生育期有关的数量性状遗传位点，从而 找到该遗传距离之间起作用的基因，有利于进一步丰富大豆生育期调控网络和深化大豆生 育期机制的研宄有重要意义。
[0003] 在大豆中，PRR家族基因是生物钟的重要组成部分，且该家族基因在不同物种中具 有高度保守的特征。在大豆中，还没有关于PRR家族基因的报道，因此对PRR家族基因的研 宄对于研宄大豆的生物钟规律具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供大豆开花基因FL1 (PRR-like)及其编码蛋白。
[0005] 本发明的大豆开花基因FL1 (PRR-like)的基因序列如序列表Seq IDNo:1所示。
[0006] 本发明的大豆开花基因FL1 (PRR-like)的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No: 2所示。
[0007] 本发明的有益效果：
[0008] 本发明是在遗传数量性状研宄的基础上，利用分子手段首次成功地克隆出生育期 基因FL1 (PRR-like)。
[0009]本发明利用大豆品种TK780和H4杂交后代所产生E1背景下的60个重组自交系 个体，通过两种不同的遗传定位方法（MQM和MCIM)都检测到在11号染色体的Satt519附 近有一个关于大豆开花期的QTL。把Satt519附近的基因与拟南芥开花期基因进行比对， 发现在此区间，只有一个大豆基因与拟南芥的开花基因同源，即FL1 (PRR-like)基因，并对 此基因进行了克隆。本发明获得的FL1 (PRR-like)基因编码区全长序列（SeqIDNo:1)与 phytozome(http://www.phytozome.net)中公布的GlymaU034500. 1 (大豆基因组Glymal. 0 版本的基因诠释）相对应，但是其序列并不一致，本发明获得的FL1 (PRR-like)基因翻译的 蛋白质具有836个氨基酸（SeqIDNo:2)。通过转基因，验证了FL1 (PRR-like)基因具有 强烈抑制大豆开花的生理功能。
[0010] 同时，通过同源比对，发现FL1 (PRR-like)基因与拟南芥PRR家族具有很高的同源 性。通过对FL1 (PRR-like)蛋白的研宄，表明该基因含有一个CCT模块和一个未知功能的 PRR结构域。
【附图说明】
[0011] 图1为PTF10I-FL1 (PRR-like)质粒过表达载体结构示意图；
[0012] 图 2 为Williams82 转入FL1 (PRR-like)基因和未转入FL1 (PRR-like)基因大豆 的开花时间图；其中，W82为Williams82未转入FL1 (PRR-like)基因的大豆，35S:FL1为 Williams82转入FL1 (PRR-like)基因后的大豆。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0013] 一：本实施方式的大豆开花基因FL1 (PRR-like)的基因序列如序列 表SeqlDNo:1 所示。
[0014] 本实施方式对TK780和H4杂交后代的重组自交系进行研宄，并确定了 FL1 (PRR-like)基因，其与大豆开花期关系密切。
[0015] 本实施方式通过大豆遗传转化手段，将FL1 (PRR-like)基因在大豆中表达，验证 了本发明的FL1 (PRR-like)基因能够显著的抑制大豆开花。
【具体实施方式】 [0016] 二：本实施方式的大豆开花基因FL1 (PRR-like)的编码蛋白的氨基 酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
[0017] 通过以下试验验证本发明的效果：
[0018] (1)大豆开花期FL1 (PRR-like)基因的获得
[0019] 一、在2010年，将TK780和H4杂交后代产生的96个重组自交种植在中国科学院 东北地理与农业生态研宄所哈尔滨园区院内，并检测花期；
[0020] 二、利用已经构建的遗传图谱，结合检测的花期数据，进行遗传数量性状定位，初 步遗传定位只发现一个主效QTL，即E1;
[0021] 三、为了排除E1的效应，我们将96个重组自交系分成两个亚群体：E1背景下的60 个个体和elnl背景下的36个个体；
[0022] 四、利用E1背景下的60个个体进行QTL检测时，我们在Satt519发现了一个与大 豆开花期密切相关的QTL;
[0023] 五、将此标记附近的大豆基因提取出来，与拟南芥的开花期基因聚类分析比较，发 现唯一一个与拟南芥开花有关的基因，即FL1 (PRR-like)基因；
[0024] 六、以大豆品种H4的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的 操作手册提取叶片总RNA;
[0025] 七、采用DNaseI处理步骤六提取的总RNA;
[0026] 八、取1yg步骤七处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买 自BD Biosciences Clontech公司的BD SMART?RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的 使用手册进行，获得cDNA;
[0027] 九、以获得的cDNA为模板通过F1与R1引物扩增FL1 (PRR-like)基因，PCR反应 条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min30s，共35循环， 再72°C延伸5min，将PCR产物在ABI3130测序仪（ABI公司）上进行测序；
[0028] 其中，引物F1的序列为5' TTTTCAGTGC GGTTGATATA 3'；引物R1的序列为 5, GAACGGAATC AGTCAAATAA 3,。
[0029]测序结果表明大豆开花基因FL1 (PRR-like)具有序列表中SeqIDNo:1的核苷酸 序列，序列表中的Seq ID No :1由2511个核苷酸组成，并编码具有序列表中Seq ID No :2的氨基酸序列的蛋白质。
[0030] (2)大豆开花基因FLl(PRR-like)的功能验证
[0031] -、以大豆品种H4的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的 操作手册提取叶片总RNA ;
[0032] 二、采用DNase I处理步骤一提取的总RNA ;
[0033] 三、取1 yg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买 自BD Biosciences Clontech公司的BD SMART?RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的 使用手册进行，获得cDNA;
[0034] 四、分别以FLl(PRR-like)基因F2与R2为引物，对步骤三获得的cDNA通过PCR 进行5'与3'扩增，PCR反应条件：94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延 伸3min，共35循环，再72°C延伸5min，获得含有Xbal-SacI双酶酶切位点的大豆开花基因 FLl(PRR-like)；
[0035] 五、将获得的含有酶切位点的大豆开花基因FLl(PRR-like)克隆到pTFlOl质粒 中，获得pTFlOl-FLl(PRR-like)质粒，以Willimas 82为材料，利用农杆菌介导法进行遗传 转化，获得转FLl(PRR-like)基因大豆，将转FLl(PRR-like)基因大豆和Willimas 82在16 小时光照和8小时黑暗条件下种植，观察它们的开花状态；
[0036]其中，引物F2的序列为5'GCTCTAGAGA TGAACAATAA TGITGGGAA 3'；引物R2的序 列为5'CGAGCTCGTT ATTGAGGAAT GTCGATAG 3'。
[0037] 步骤五获得的pTF101-FLl (PRR-like)质粒过表达载体结构示意图如图1所示；
[0038] Williams 82转入FL1 (PRR-like)基因和未转入FL1 (PRR-like)基因大豆的开花 时间图如图2所示；其中，W82为Williams 82未转入FL1 (PRR-like)基因的大豆，35S:FL1 为Williams 82转入FL1 (PRR-like)基因后的大豆；从图2可以看出，W82的开花时间为 50天，FL1 :35S的开花时间为55天，表明转入FL1 (PRR-like)基因后的大豆开花时间比 Willimas 82的开花时间晚5天，从而说明FL1 (PRR-like)基因具有抑制大豆开花的功能。
【主权项】
1. 大豆开花基因FL1 (PRR-like)，其特征在于大豆开花基因FL1 (PRR-like)的基因序 列如序列表Seq ID No :1所示。
2. 如权利要求1所述的大豆开花基因FL1 (PRR-like)的编码蛋白，其特征在于大豆开 花基因FL1 (PRR-like)的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。
【专利摘要】大豆开花基因FL1(PRR-like)及其编码蛋白，它涉及大豆开花基因FL1(PRR-like)及其编码蛋白。本发明的目的是提供大豆开花基因FL1(PRR-like)及其编码蛋白。本发明的大豆开花基因FL1(PRR-like)的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。本发明大豆开花基因FL1(PRR-like)的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。本发明通过大豆遗传转化验证，表明FL1(PRR-like)基因抑制大豆开花的生理功能。本发明应用于大豆基因工程领域。
【IPC分类】C12N15-29, C07K14-415
【公开号】CN104593382
【申请号】CN201510001534
【发明人】孔凡江, 刘宝辉, 芦思佳, 曹东, 王家麟
【申请人】中国科学院东北地理与农业生态研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月4日