能改变大豆油的质量和功能的新型基因组合的制作方法

专利名称：能改变大豆油的质量和功能的新型基因组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及能产生大豆种子的新型脂类组成的新型基因组合，以及由所述大豆种子中提取的油类。所述新型大豆基因组合可以作为一种替代方案，代替生产更加昂贵的油类，以及代替对油类进行化学改性以便提供特殊的功能品质和保健作用。
背景技术：
植物脂类具有多种工业和营养用途，并且在植物膜功能和气候适应方面起着重要作用。所述脂类具有多种化学结构，这些结构决定了所述脂类的生理学和工业特性。上述结构中的很多种是由于能改变所述脂类的不饱和度的代谢过程直接或间接产生的。在不同植物中的不同代谢方式产生了上述不同的脂类，并且为了经济地生产大量的所需脂类，需要对外来的植物种进行驯化或对农艺改良的种进行改进。
植物脂类主要以三酰甘油形式用作食用油。食用油的具体特性和保健作用主要是由其脂肪酸的组成决定的。源于商业植物品种的大部分植物油主要是由棕榈酸(16∶0)，硬脂酸(18∶0)，油酸(18∶1)，亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)组成。棕榈酸和硬脂酸分别是长16-和18-C的饱和脂肪酸。油酸、亚油酸和亚麻酸是分别含有一个、两个、和三个双键的18-C的不饱和脂肪酸。油酸被称作单不饱和脂肪酸，而亚油酸和亚麻酸被称作多不饱和脂肪酸。常用的食用植物油中的饱和和不饱和脂肪酸的相对量归纳如下(表1)。
表1在选定油类作物的油中的饱和和不饱和脂肪酸的百分比
最近的很多研究都检查了饱和和不饱和脂肪酸在减轻冠状心脏病的危害方面的作用。在过去，人们相信单不饱和脂肪酸与饱和和多不饱和脂肪酸不同，对血清胆固醇和冠状心脏病的危害没有影响。若干最近的人类临床研究表明，高的单不饱和脂肪和低的饱和脂肪的饮食可以减少“不好的”(低密度脂蛋白)胆固醇，同时保持“好的”(高密度脂蛋白)胆固醇(Mattson等(1985)脂类研究杂志26194-202)。
总的饱和脂肪酸低而单不饱和脂肪酸高的植物油，可以为消费者提供明显的保健好处，同时，能为油类加工者带来经济上的利益。例如，canola油被认为是一种很有保健作用的油。不过，在使用时，canola油中的大量的多不饱和脂肪酸会使得这种油不稳定，容易氧化，并且容易产生另人讨厌的气味和味道(Gailliard(1980)植物生物化学4卷，85-116页，Stumpf,P.K.著，学术出版社，纽约)。通过氢化作用可以降低多不饱和脂肪酸的含量，但该工艺的费用以及营养上成问题的剩余不饱和脂肪酸的反式异构体杂质的产生，降低了氢化油类的总体优点(Mensink等(1990)新英格兰医学杂志N323439-445)。如上面的表1所示，大豆油存在类似的问题，商业大豆油通常含有超过canola油两倍以上的饱和脂肪含量。
突变育种方法业已在改变农业品种的食用油中的多不饱和脂肪酸含量方面取得了某些成功。商业种植品种的例子有高(85％)油酸向日葵和低(2％)亚麻酸亚麻(Knowles(1980)世界脂肪和油类工业加工生物技术大会，Applewhite,T.H著，美国油类化学家协会，35-38页)。用表1所示其他植物进行的类似的商业方法是另人困惑的，这主要是由于该方法的困难性质，以及突变方法对植物硬度、产量潜力以及低多不饱和性状的环境不稳定性的多效影响。总之，由于不能在不同的季节以及不同的地点稳定地生产具有特定组成的油类，使得低多不饱和大豆油的商业生产无法实现。
一种用于决定以定向方式向大豆种子的组成脂类中引入第二个(国际专利公开号WO94/11516)和第三个(国际专利公开号WO93/11245)双键的酶的表达方法的发现，使得人们能够生产具有高的单不饱和脂肪酸，极低的多不饱和脂肪酸含量，特别是极低的亚麻酸含量的大豆。在本发明中披露的以上两种转基因特征的遗传组合，产生了具有低的多不饱和脂肪酸和高的单不饱和脂肪酸和种子脂肪酸的极高度的环境稳定性特征的大豆品系。
业已披露了通过突变育种(Erickson,E.A.等(1994)遗传杂志79465-468；Schnebly,S.R.等(1994)作物科学34829-833；和Fehr,W.R.等(1991)作物科学3188-89)和转基因改良(US5530186)产生的具有较低含量饱和脂肪酸的大豆。由于在本发明的单一大豆品系中证实了以上两种特征的组合，可以生产出具有高的单不饱和脂肪酸、低的饱和脂肪酸油的保健优点的大豆。
尽管从提供保健饮食的角度考虑，具有低的饱和脂肪酸含量的油类是理想的，但在某些食品中需要室温下为固体的脂肪的功能特性。所述用途包括人造奶油和糊状制品的生产，以及在糖果和烘烤中的多种用途。很多动物和乳品脂肪具有必须的物理特性，但它们同时含有胆固醇和生胆固醇的中等链脂肪酸。用作固体脂肪用途的理想的甘油三酯应当含有大量的熔点极高的长链脂肪酸硬脂酸，以及平衡的单不饱和脂肪酸和很少量的多不饱和脂肪。天然植物固体脂肪级份通常具有这样的甘油三酯结构饱和脂肪酸占据该甘油三酯的sn-1和sn-3位置，而不饱和脂肪酸占据sn-2位置。这种总体上的脂肪酸组成和甘油三酯结构，能产生最佳的固体脂肪结晶结构和最大的熔点，具有少量的饱和脂肪酸含量。
这种高熔点植物脂肪的天然脂肪原型是可可脂。可可脂的脂肪酸组成为26％棕榈酸(16∶0)，34％硬脂酸(18∶0)，35％油酸(18∶1)，和3％亚油酸(18∶2)。这种脂肪酸组成使得可可脂的熔点为25-36℃，这要取决于其精确的结晶结构。由于可可脂的高价格，以及供应的不稳定，导致了若干生产可可脂替代品和人造奶油原料的方法，该方法通过分离具有较高18∶0含量的其他油类或对高的多不饱和脂肪酸油进行催化氢化，然后分离该制品而完成。
能够直接生产高的硬脂酸，低的多不饱和脂肪酸油类的油用种子的优点是，可以避免氢化作用的成本，以及氢化作用的不理想的副产品--反式单不饱和脂肪酸。另外，如果所生产的植物脂肪的熔点范围足够高的话，还可以使得上述分离工艺的成本更经济或者可以取消该步骤。
业已对植物中油类的生物合成做过充分的研究(参见Harwood(1989)植物科学重点综述，8(1)卷1-43)。棕榈酸、硬脂酸和油酸的生物合成是在质体中由“ACP”途径上的三种重要的酶相互作用进行的棕榈酰-ACP延伸酶，硬脂酰-ACP脱饱和酶和酰基-ACP硫酯酶。
在以上三种类型的酶中，酰基-ACP硫酯酶起到从载体蛋白(ACP)上除去酰基链的作用，并因此将其从该代谢途径中除去。油酰-ACP硫酯酶以较高的速度催化油酰-ACP硫酯的水解，不过它还能以更低的速度催化棕榈酰-ACP和硬脂酰-ACP的水解。这种多重活性导致了这些酶之间的底物竞争，正是由于酰基-ACP硫酯酶和棕榈酰-ACP延伸酶对同一种底物的竞争以及酰基-ACP硫酯酶和硬脂酰-ACP脱饱和酶对同一种底物的竞争，导致了存在于植物油中的甘油三酯中的棕榈酸和硬脂酸的产生。
脂肪酸一旦从ACP途径中除去，就被外排到细胞质中，在这里将其用于合成脂酰辅酶A。所述脂酰辅酶A是至少三种不同甘油酰化酶(甘油-3-P酰基转移酶，1-酰基-甘油-3-P酰基转移酶和二酰基甘油酰基转移酶)的酰基供体，它能在油类的生物合成过程中将酰基部分结合到三酰甘油上。
所述酰基转移酶表现出明显的结合在饱和脂肪酸的sn-1和sn-3位置和单不饱和脂肪酸的甘油三酯的sn-2位置的倾向，但不是绝对的。因此，改变酰基来源的脂肪酸组成，会导致相关油类的脂肪酸组成的相应改变。另外，有实验证据表明，正是因为这种专一性，使得植物能够产生可可脂替代物或其他特殊脂肪，如果在酰基转移酶的底物库中有正确的脂肪酸组成存在的话[Bafor等(1990)JAOCS67217-225]。
根据以上说明，改变植物油中棕榈酸、硬脂酸和油酸含量的一种方法是改变其在细胞质脂酰辅酶A库中用于油类生物合成的含量。
业已披露了对硬脂酸含量的控制(Knutzon,D.S.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(7)2624-2628)。通过用种子专一性启动子区进行编码芸苔硬脂酰-ACP脱饱和酶(这种酶负责将第一个双键导入植物中的18C的脂肪酸中)的cDNA的反义表达，生产芸苔和欧洲油菜植物的种子。与来自相同物种的未改良的植物的种子相比，上述种子能产生硬脂酸含量高的油类，同时，还含有较高含量的亚麻酸(18∶3)。在大豆中通过硬脂酰-ACP脱饱和酶的类似的低水平表达(US5443674)，以及在canola中进行酰基-ACP硫脂酶的超量表达(US5530186)获得了较高含量的硬脂酸。突变育种业已产生了在其种子油中具有较高含量硬脂酸的大豆品系(Graef,G.L.等(1985),JAOCS62773-775；Hammond,E.G.和W.R.Fehr(1983)作物科学23192-193)。
多不饱和脂肪酸形成了液体植物油的低熔点。在高饱和油类中其存在是有害的，因为它能降低熔点，并因此需要更大量的不理想的饱和脂肪酸来获得在室温下的塑性脂肪。另外，在用于烘烤和糖果业时，大量的多不饱和脂肪酸会导致上文所述的液体油的氧化不稳定性。因此，为了具有最大的利用价值，在大豆中产生的高不饱和脂肪应当含有饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和尽量少的多不饱和脂肪酸。本发明所发现的基因组合，使大豆具有符合上述标准的新型脂肪酸特征。
发明概述本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量大于21％，C18∶1的含量大于60％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于7％。
在第二种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0的含量大于10％，C16∶0和18∶0的组合含量大于30％，C18∶1的含量大于55％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于7％。
在第三种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量大于42％，其中，所述植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，其中，所述第一亲本的C18∶0的含量占总的种子脂肪酸的至少10％，并且第一亲本还含有至少一个编码油酰-ACP硫酯酶的核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有决定较高的种子硬脂酸含量的fasa等位基因；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
在第四种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量低于7％，C18∶1的含量大于87％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于6％。
在第五种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量低于12％，C18∶1的含量大于84％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于5％。
在第六种实施方案中，本发明涉及用由本发明的上述大豆植物生产的高硬脂酸、或高硬脂酸和高油酸油生产人造奶油和/或糊状制品。另外，通过对所述油类进行氢化、分离、酯交换反应或水解所生产的制品可用于以混合或非混合形式生产人造奶油和/或糊状制品。
在第七种实施方案中，本发明涉及用由本发明所披露的大豆植物生产的高硬脂酸、或高硬脂酸和高油酸油与其他油类混合生产人造奶油和/或糊状制品。另外，通过对所述油类进行氢化、分离、酯交换反应或水解所生产的制品，可用于以混合或非混合形式生产人造奶油和/或糊状制品。
生物学保藏物以下大豆种子业已交由美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801Boulevard大学，Manassas,VA20110-2209)保藏，并拥有以下名称、保藏号和保藏日期。大豆 保藏号 保藏日期大豆T1S ATCC203033 1998年5月14日大豆L9216116-109ATCCXXXXXX 1999年4月？？附图简述和序列说明通过下面的详细说明可以更全面地理解本发明，对四幅附图的说明以及序列说明构成了本申请的一部分。


图1表示高硬脂酸和四种不同的高硬脂酸和高油酸大豆油与软管植物油糊状制品的固体脂肪含量(SFC)曲线。只有22％的高硬脂酸和高油酸(HS/HO A)的特性与糊状制品一样。其余的油的SFC曲线表明这些油的特性与糊状制品不一样。
图2表示若干种非混合的和混合的油类的相对氧化稳定性(OSI)。为了获得高的氧化稳定性，高的油酸含量和低的多不饱和脂肪酸含量是必需的。诸如大豆油(SO)与棕榈酸(PO)，或高硬脂酸(HS)油与棕榈油混合油或全氢化油的性能与人造奶油或糊状制品的SFC特征一样好。
图3表示将高硬脂酸和高油酸油(HS/HO C和HS/HO D)与诸如棕榈油或全氢化大豆油的硬浆混合，改善其SFC特征，以便与植物油糊状制品的特征一致。
图4表示极高含量硬脂酸油的SFC特征与黄油和硬浆油的特征一致。
序列说明归纳了后面所附的序列表。序列表包括核苷酸序列符号的单字母密码和氨基酸序列的三字母密码，如在披露于核酸研究133021-3030(1985)和生物化学杂志219(No.2)345-373(1984)中所披露的IUPAC-IUB标准所规定的，而用于所有核苷酸和氨基酸序列资料的符号和格式进一步与在37C.SR.§1.821-1.825和WIPO标准St.25中所规定的专利申请的有关核苷酸和/或氨基酸序列公布的规定一致。核苷酸序列从5’到3’阅读。
序列1表示源于欧洲油菜的酰基-ACP硫脂酶的1412bp的cDNA。
序列2表示欧洲油菜种子酰基-ACP硫脂酶的前体蛋白的氨基酸序列(序列1的编码序列)。
序列3表示源于欧洲油菜的第二种酰基-ACP硫脂酶cDNA的核苷酸序列，相当于GenBank保藏号U17098。
序列4表示第二种欧洲油菜种子酰基-ACP硫脂酶的前体蛋白的氨基酸序列(序列3的编码序列)。
发明详述通过筛选天然变异、突变育种和遗传工程，发现了能改变油的品质的多种新的大豆基因。含有上述新型基因的某些大豆品系或组合被用于本文中，并在表2中的“基因组合或品系名称”一栏中涉及。
表2具有不同的脂肪酸修饰基因的大豆的典型的脂肪酸特征基因组合或品系各种脂肪酸含量(总的种子脂肪酸含量的参考文献名称1％)16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3野生型12 4 25 51 7T1S 16 10 19 47 7 本申请的例11D2T 73 85 1 3 WO94/11516D3A 10 5 32 49 3 WO93/11245fan 11 3 45 36 4 US5,534,425fap1 84 28 52 8 US5,585,535fap2 16 4 19 53 8 US5,850,029fap3 73 26 53 11US5,585,535fap1xfap3 43 22 63 8 US5,585,535fasa 823 26 35 7 US5,557,037L9216116-109 922 15 48 5 本申请的例3N85-2176 11 3 42 40 4 Kuhr等，1987年3月26日，USDA农业研究机构HST1 928 15 43 5 本申请的例3HO2 11 3 45 37 4 本申请的例3HO4 11 3 45 37 4 本申请的例3T2T 32 17 65 12WO9606936，本申请的例13用于该表中的基因代码的含义如下T1S是指油酰AP硫脂酶表达结构，它呈有义取向，并且能表达一种有功能的酶。D2T是指Δ-12脱饱和酶结构，它呈有义取向，该结构的整合会导致活性的降低。D3A是指Δ-15脱饱和酶结构，它呈反义取向，该结构的整合会导致活性的降低。fan是指能决定较低的种子亚麻酸含量的基因。fap1是指决定较低的种子棕榈酸含量的基因。fap2是指决定较高的种子棕榈酸含量的基因。fap3是指决定较低的种子棕榈酸含量的基因。fasa是指决定较高的种子硬脂酸含量的基因。L9216116-109是指源于系谱(HST1*(HO2*HO4))*野生型的、具有高的硬脂酸含量的品系。HST1是指源于N85-2176的高硬脂酸突变型品系。HO2是指源于N85-2176的高油酸突变型品系。HO4是指源于A5的高油酸突变型品系。T2T是指棕榈酰-ACP硫脂酶结构，它呈有义取向，该结构的整合会导致活性的降低。
在本说明书中，将使用到多种术语。“基因”是指能表达一种特定蛋白的核酸片段，包括位于编码序列前面(5’非编码序列)和后面(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指天然存在的具有其自身的调控序列的基因。“嵌合基因”是指所有的非天然基因，包括在天然状态下不同时存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者调控序列和编码序列源于相同来源，但其排列方式不同于天然状态。“转基因”是通过转化方法导入基因组的基因。
本文所使用的“遗传学基因座”是指基因在染色体或染色体组上的位置。本文所使用的术语“等位基因”是指一种遗传学基因座的所有替代形式。本文所使用的术语“表达”是指产生有功能的最终产物。基因的表达或超量表达涉及基因的转录以及将mRNA翻译成前体蛋白或成熟蛋白。“反义抑制”是指产生能够抑制所述靶蛋白表达的反义RNA转录物。超量表达是指在转基因生物中基因产物的产量超过了在正常或非转化生物中的产量。“共抑制”是指与内源基因具有明显同源性的转基因的表达导致了异位基因和内源基因表达的抑制。
“改变了的表达”是指在转基因生物中，基因产物的产生量或比例明显不同于在野生型生物的相应组织(器官和发育类型)中的活性。
本文所使用的术语“环境稳定的”或“环境稳定性”被用于描述一种表现型，该表现型无论植物生长的环境条件如何都比较稳定。
“转化”是指将一种核酸片段转移到宿主生物的基因组中，产生遗传学上稳定的遗传。含有所述转化的核酸片段的宿主生物被称作“转基因”生物。植物转化方法的例子包括农杆菌属介导的转化(De Blaere等(1987)酶学方法153277)和粒子加速或“基因枪”转化技术(Klein等(1987)自然(伦敦)32770-73；US49450505)。
本文所使用的“大豆”是指大豆(Glycine max)、野大豆(Glycinesoja)，或任何能与大豆(Glycine max)进行有性杂交的品种。“品系”是指具有相似亲本的一类植物，这些植物在不同的个体之间至少在一种性状上具有很小的遗传变异或没有遗传变异。所述品系可以通过一代或几代自花授粉和选择形成，或者由单一亲本无性繁殖，包括组织或细胞培养技术。“农艺上的优良品系”或“优良品系”是指具有理想的可以或不可以进行商业应用的农艺特性的品系。“品种”、“栽培品种”、“优良品种“、或”优良栽培品种“是指农艺上突出的优良品系，业已对该品系做过充分的实验，并且正被用于或已经被用于商业大豆生产。“突变”是指不是由分离或遗传重组导致的可检测的、并且可遗传的遗传学改变(自主型或诱导型)。“突变体”是指具有突变的个体或个体谱系。在本文中，“F1群体”是指由一个品系与另一个品系异花授粉所产生的后代。本文用于说明所述异花授粉的格式是“母本*父本”。“F2群体”是指F1植物的自花授粉后代。“F2衍生的品系”或“F2品系”是由单个的F2植株自花授粉所得到的品系。F2衍生的品系可以通过重复的自花授粉并积累来自所述F2衍生品系的种子由后续世代(F3、F4、F5等)繁殖。“分离群体”是指由杂交所得到的植物群体，该群体处于F2自交阶段或更后一些的阶段。
本文所使用的术语“成熟种子”是指已经不再是绿色的大豆，其水分含量低于20％，优选低于12％。
本文所使用的的术语“脂肪产物”是指植物油，它呈天然(非氢化和非化学改性)形式，或氢化和/或化学改性形式，或由它所产生的天然(非氢化和非化学改性的)形式或氢化和/或化学改性形式的级份。
用于本发明的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且更详细地披露于Sambrook,J.Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆实验室手册；冷泉港实验室出版社冷泉港，1989(以下被称为“Maniatis”)中。
本发明涉及具有新型氨基酸组成的大豆品系。
在第一种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量大于21％，C18∶1的含量大于60％，C18∶2和C18∶3的组合含量低于7％。
具有上述氨基酸特征的大豆植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有能产生较高的种子硬脂酸含量的合适的转基因，或诸如fasa等位基因的突变；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
同样感兴趣的是由所述植物获得的种子，由所述种子获得的油，通过对所述油进行氢化、分离、酯交换反应或水解所制备的产品以及在生产这种油时所产生的副产品。另外，本发明还涉及用所述油和用由所述油的氢化、分离、酯交换反应或水解所制成的产品以混合的或非混合的形式制成人造奶油或糊状制品。
在第二种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0的含量大于10％，C16∶0和C18∶0的组合含量大于30％，C18∶1的含量大于55％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于7％。
具有上述氨基酸特征的大豆植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有能增加种子中棕榈酸和硬脂酸含量的嵌合转基因，或者第二亲本含有决定较高种子硬脂酸含量的诸如fasa的突变和决定较高种子棕榈酸含量的fap2突变；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
同样感兴趣的是由所述植物获得的种子，由所述种子获得的油，通过对所述油进行氢化、分离、酯交换反应或水解所制备的产品以及在生产这种油时所产生的副产品。另外，本发明还涉及用所述油和用由所述油的氢化、分离、酯交换反应或水解所制成的产品以混合的或非混合的形式制成人造奶油或糊状制品。
在第三种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量大于42％，其中，所述植物是由以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，其中，所述第一亲本的C18∶0的含量占总的种子脂肪酸的至少10％，并且第一亲本还含有至少一个编码油酰-ACP硫酯酶的核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有合适的转基因或能产生较高种子硬脂酸含量的诸如fasa等位基因的突变；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
同样感兴趣的是由所述植物获得的种子，由所述种子获得的油，通过对所述油进行氢化、分离、酯交换反应或水解所制备的产品以及在生产这种油时所产生的副产品。另外，本发明还涉及所述油，由所述油制成的制品，或由所述油制成的混合制品的用途，可将其用于生产人造奶油或糊状制品。
在第四种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量低于7％，C18∶1的含量大于87％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于6％。
具有这种脂肪酸特征的大豆植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本(ⅰ)含有决定较低的种子棕榈酸含量的fap1等位基因和决定较低的种子棕榈酸含量的fap3等位基因，(ⅱ)含有编码至少一个决定较低种子棕榈酸含量的植物酰基-ACP硫脂酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，其中，所述硫脂酶对棕榈酰-ACP的优势至少超过硬脂酰-ACP或油酰-ACP的两倍；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
同样感兴趣的是由所述植物获得的种子，由所述种子获得的油，通过对所述油进行氢化、分离、酯交换反应或水解所制备的产品以及在生产这种油时所产生的副产品。
在第五种实施方案中，本发明涉及一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量低于12％，C18∶1的含量大于84％，而C18∶2和C18∶3的组合含量低于5％。
具有这种脂肪酸特征的大豆植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，其中，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本包括决定较低的种子亚麻酸含量的诸如fan等位基因的突变，或者至少一个编码Δ-15脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，另外，其中C18∶3的含量不足总的种子脂肪酸含量的4％；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
同样感兴趣的是由所述植物获得的种子，由所述种子获得的油，通过对所述油进行氢化、分离、酯交换反应或水解所制备的产品以及在生产这种油时所产生的副产品。
用于组建决定本发明所述新型种子脂肪酸特征的特定基因型的一般方法如下1)通过人工方法将来自一种亲本植物的花上的花粉，转移到第二种亲本植物的、去过雄的花上，对根据其种子脂肪酸特征选择的亲本系进行异花授粉。
2)种植来自异花授粉的花的成熟种子，产生F1植株，让该植株自花授粉产生含有不同剂量的参与产生以上两种亲本的种子脂肪酸表型的基因的种子的F2群体。
3)从不和胚轴直接接触的子叶部分取出成熟种子的一个小的切片。通过披露于WO93/11245中的气相液体层析法测定构成种子脂类的5种主要脂肪酸的相对含量，种植根据分析过的切片的脂肪酸特征选择的种子的其余部分。让选择的F2植株自交，并产生F3种子。用来自该世代的单一种子重复上述分析过程，并用来自该世代的混合种子集团重复上述分析过程。
另外，可以在没有预先选择的情况下种植F2种子群体，并进行自花授粉，对来自所产生的F2植株的单一植株的混合的种子进行分析，以便根据单植株混合种子脂肪酸分析选择F2∶3家族。
一旦鉴定到具有理想的脂肪酸特征的品系，就可以进一步作为自花授粉的群体，以便保持并检验所述种子脂肪酸特征。
为了生产同时具有高含量的油酸和低含量的多不饱和脂肪酸的品系，选择WO97/40698中所披露的Δ-12脱饱和酶下调转基因品系作为一个亲本。为了生产多不饱和脂肪酸含量低，但饱和脂肪酸含量高的大豆品系，选择含有会产生高含量硬脂酸的突变的大豆品系作为第二个亲本。所述品系的一种例子披露于US5557037中，该专利的内容被收作本文参考。上述专利披露的大豆品系A6携带位于被命名为fasa基因座的基因座上的突变。
为了生产同时具有高含量的油酸和极低含量饱和脂肪酸的品系，选择Δ-12脱饱和酶下调转基因品系作为一个亲本，并选择具有极低含量的棕榈酸的品系作为第二个亲本。一种方法是使用含有基因组合的第二亲本，所述品系披露于US5585535中，该专利的内容被收作本文参考。另一种方法是使用披露于WO96/06936中的品系作为第二亲本，其中，所披露的棕榈酰-ACP硫脂酶结构呈有义取向，该结构的整合会导致活性降低。
为了进一步降低多不饱和脂肪酸--亚麻酸的含量并提高低的多不饱和脂肪酸表型的环境稳定性，选择Δ-12脱饱和酶下调转基因品系作为一个亲本，并选择具有下调的Δ-15脱饱和酶表达的转基因品系或具有类似的亚麻酸表型的突变品系作为第二亲本。具有类似由Δ-15脱饱和酶下调所产生的亚麻酸表型的突变品系的例子披露于US5534425中，该专利的内容被收作本文参考。
通过能产生高含量硬脂酸的种子的突变品系与携带编码种子专一性超量表达的植物的酰基-ACP硫脂酶的嵌合基因的转基因品系的组合生产了极高含量饱和脂肪酸的大豆种子。
用于提取并加工大豆种子以便生产大豆油和大豆粉的方法在大豆加工行业中是众所周知的。一般，大豆油是用一系列步骤生产的，该方法实现了从含有油的种子中提取并纯化可食用油类制品的目的。大豆油和大豆副产品是用下面的示意图中所示的一般化步骤生产的。
工艺去除的杂质/获得的副产品 对大豆种子进行清洗、加热、去皮并压碎，这能提高油提取的效率。油提取通常是用溶剂(己烷)提取完成的，但也可以通过机械加压和/或溶剂提取组合完成。所得到的油被称为粗油。可以通过水合磷脂和其他极性和中性脂类复合物对所述粗油进行脱胶，这有利于它们与非水合甘油三酯部分(大豆油)分离。所得到的卵磷脂胶可以做进一步加工，以便制成具有重要商业价值的卵磷脂制品，该制品可用于多种食品和工业制品中，如乳化剂和分离(抗粘着)剂。可以对脱过胶的油做进一步的精炼，以便除去杂质；主要是除去游离脂肪酸、色素、和残余胶质。精炼是通过添加苛性剂实现的，所述苛性剂与游离脂肪酸反应生成皂，并且水合所述粗油中的磷脂和蛋白。用水洗去在精炼期间形成的皂。所述皂类副产品可直接用于动物饲料或者酸化以便回收游离脂肪酸。通过用漂白土吸附除去色素，这种土能除去大部分叶绿素和类胡萝卜素化合物。精炼过的油可以进行氢化，以便得到具有各种熔化特征和质地的脂肪。防冻处理(分离)可用于从氢化的油中除去硬脂酸甘油酯，这一目的是通过在仔细控制的冷却条件下结晶而实现的。脱臭处理主要是在真空条件下进行蒸汽蒸馏完成的，它是最后一个步骤，并且被设计用于除去产生油的臭味或香味的化合物。其他有价值的副产品，如生育酚和固醇也可以在脱臭加工期间除去。含有上述副产品的脱臭馏出物可以出售，用于生产天然维生素E和其他高价值的药用制品。精炼、漂白(氢化、分离)和脱臭的油和脂肪可以包装并直接销售或者进一步加工成更特殊的制品。有关大豆种子加工，大豆油生产和副产品利用的更详细的资料可以参见Erickson,1995，大豆加工和利用实践手册，美国油类化学家协会和联合大豆董事会。
氢化是一种化学反应，其中，在诸如镍的催化剂的帮助下将氢添加到不饱和脂肪酸的双键上。高油酸大豆油含有不饱和油酸、亚油酸、和亚麻酸脂肪酸，它们中的每一种都可以被氢化。氢化具有两种主要作用。首先，由于降低了不饱和脂肪酸的含量而提高了油的氧化稳定性，其次，由于脂肪酸的改性而改变了这种油的物理特性，提高其熔点，得到在室温下呈半液体或固体状态的脂肪。
存在多种影响氢化反应的因素，该反应反过来又会改变最终产品的组成。操作条件包括压力、温度、催化剂类型和浓度，搅拌和反应器设计，这些是可以控制的比较重要的参数。相对较低不饱和脂肪酸而言，选择性氢化条件用于氢化更高不饱和的脂肪酸更为有利。通常采用极轻度或轻度的氢化作用以便提高液态油的稳定性。进一步的氢化能将液态油转化成物理上的固体脂肪。氢化的程度取决于所需要的性能和为特定最终产品设计的熔点特征。通过氢化获得的多种可能的油和脂肪制品包括用于生产烘烤食品、固体脂肪的液体起酥剂和用于商业煎炸和烘烤作业的起酥剂，以及用于人造奶油生产的基础原料。有关氢化和氢化产品的更详细的说明可以参见Patterson,H.B.W.,1994，脂肪和油的氢化理论和实践，美国油类化学家协会。
由于氢化过程所产生的反式脂肪酸异构体的存在，使得氢化油也成问题。大量摄入反式异构体会产生损害健康的作用，其中包括提高血浆中低密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比例，并增加发生冠状心脏病的危险。用不含反式脂肪酸的形式的氢化油生产食品是有利的。本文所说的“基本上不含游离的反式脂肪酸”是指对健康没有危害量的反式脂肪酸。例如，所述数量可以为0.1％(即，用现有的测定反式脂肪酸含量的方法不能可靠地检测)至不会造成健康危害的上限。在不久的将来，联邦政府预计会制订出食品中可以存在的反式脂肪酸异构体含量的上限，并称之为“不含反式脂肪酸”。我们相信，本发明的所有油、人造奶油和糊状制品预计都能符合由政府机构提出的规定。
油类中可以检测出的脂肪酸的反式异构体的极限大约为0.1％。(用于检测油中反式脂肪酸的气相层析方法披露于AOCS CelC-89中)。通过改进氢化方法产生的“低反式异构体油”的报导可以达到5-20％(w/w)的水平，但通常会牺牲高饱和脂肪酸的含量(Allen,D.A.(1998)脂类技术，10(2),29-33)。我们相信，本发明的完全或部分非氢化的和非化学改性的脂肪制品、混合的脂肪制品基本上不含反式脂肪酸，即，反式脂肪酸的浓度会低于油的20％(w/w)，优选低于10％，更优选低于5％，更优选低于3％，更优选低于1％，最优选低于0.5％。
酯交换反应是指酯和酸之间(酸解)，酯和醇之间(醇解)或酯和酯之间(转酯)脂肪酰基部分的交换。酯交换反应是用化学或酶促方法实现的。随机或定向转酯过程会改变脂肪酸在甘油三酯分子上的位置，而不改变脂肪酸的组成。修饰过的甘油三酯结构有可能产生具有改变了的物理特性的脂肪。由脂肪酶进行的定向酯交换反应正日益得到更多的关注，因为该反应可用于生产诸如可可黄油替代品的高价值特殊制品。用酯交换反应商业化生产的制品，包括但不限于含有中等链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的起酥剂、人造奶油、可可黄油替代品和结构性脂类。酯交换反应进一步披露于Hui,Y.H.,1996,Bailey’s工业油类和脂肪制品，4卷，John Wiley&Sons。
脂肪酸和脂肪酸甲酯是源于植物油的两种比较重要的油类化合物。脂肪酸被用于生产多种制品，如皂、中等链甘油三酯，多羟基酯，链烷醇酰胺等。植物油可以水解或裂解成相应的脂肪酸和甘油。由各种脂肪裂解工艺产生的脂肪酸可以作为粗制品使用，或者更常见的是通过蒸馏和分离纯化成级份或单一的脂肪酸。纯化的脂肪酸及其级份可以转化成多种油类化合物，如二聚和三聚酸，二酸，醇，胺，酰胺和酯。脂肪酸甲酯正越来越多的代替脂肪酸作为多种油类化合物的原始材料，如脂肪醇、链烷醇酰胺，a-磺酸甲酯，柴油成分等。使用裂解或水解植物油的方法，通过裂解甘油三酯也可以获得甘油。有关脂肪酸和油类化合物的商业用途的更详细的资料可以参考Erickson,D.R.,1995，大豆加工和利用实践手册，美国油类化学家协会，联合大豆董事会；Pryde,E.H.,1979，脂肪酸，美国油类化学家协会；和Hui,Y.H.,1996,Bailey’s工业硫类和脂肪制品，4卷，JohnWiley&Sons。
本领域技术人员可以理解的是，本发明通过对油进行氢化、分离、酯交换反应或水解获得的制品可用于生产人造奶油或糊状制品。另外，可以按下文所述方法，用分离的或未分离的本发明的油，以其天然状态或通过氢化、分离、酯交换反应和/或水解进行改性的形式制成混合制品，与其他成分组合生产人造奶油或糊状制品。
人造奶油是一种有香味的食品，通常被用作餐桌上的奶油替代品或者用于烹饪目的，如煎炸、烘烤等。人造奶油的组成中通常含有80％的脂肪，是通过混合选择的脂肪和油类及其他成分而制成的，并用维生素A强化。用于生产混合脂肪的成分的例子包括但不限于选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，部分氢化大豆油，部分氢化棉籽油，部分氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物。
混合方法以及最终产品可以根据不同用途而改变。脂肪含量低于80％的所有制品都要标明为“糊状制品”。在本文中，术语“糊状制品”或“涂抹制品”可以交换使用。人造奶油或糊状制品可以含有一种或几种水相成分，以及具有特殊功能的其他选择性成分。目前有超过10种的不同人造奶油和糊状制品，包括常规、搅打、软管、液体、饮食、糊状制品、无脂肪、餐馆、面包师、和特殊类型，均作为不同的制品包装。
在1950年代初期，几乎所有的消费人造奶油都是棒状类型的。在1957年，人造奶油的销售和总的消费量上升并超过了黄油的消费量，销售的上升刺激了新技术的发展和新产品的开发。为了满足消费者的方便需要和营养观念，以及对体重的关心，开发出了可涂抹的人造奶油，多不饱和人造奶油，和低脂肪食品。
过去的第一次大的变革是引入包装在管中，并可以从冰箱中涂抹的软的人造奶油。到1973年这种软的全脂制品占人造奶油市场的1/4。近些年来，棒状餐桌用糊状制品几乎占到了总的餐桌用糊状制品市场的1/2。最突出的新趋势是从人造奶油(80％)脂肪向含有较低脂肪含量的糊状制品转化。最初引入了60％的脂肪，从1980年开始，在市场上出现了含有75％到低于5％的脂肪的糊状制品。所述食品以棒状、液体和软的搅打形式出售。含有40-75％脂肪的低卡路里、软的和棒状的糊状制品，通常是用与分别用来生产软的和棒状人造奶油的相同的油类混合物制成的。有关人造奶油和糊状制品生产实践以及产品特征的详细说明，可以参考Bailey’s工业油和脂肪制品，第5版，3卷，Y.H.Hui著，John Wiley&Sons公司，纽约，1996,65-114页；和Bailey’s工业油和脂肪制品，第5版，4卷，Y.H.Hui著，John Wiley&Sons公司，纽约，1996,491-568页。
消费用人造奶油，是通过混合两种或两种以上具有不同硬度的油类原料制成的。这使得人造奶油可以直接从冰箱中涂抹出来，并在室温下保持固体稠度。性能良好的人造奶油的特性，可以通过测定该脂肪混合物的固体脂肪含量(SFC，见下文)而确定。这一特征随后可用于预测其他油类混合物作为人造奶油食品的性能。有关人造奶油制备的详细说明可以参考脂肪和油，应用制备和加工，R.D.O’Brien著，技术出版公司，Lancaster,PA,1998,437-457页。
脂肪的熔点特征和塑性可以通过工业标准技术测定。最常用的方法是固体脂肪指数(SFI,AOCS Cd10-57-93)和固体脂肪含量(SFC,AOCSCd16B-93(97))。SFI测定是根据膨胀计量进行的，该方法根据当脂肪熔化成液体状态时体积的变化测定脂肪中固体或液体的量。这种技术正逐渐被SFC所取代。该方法基于脉冲、低解析核磁共振(NMR)，根据在样品受到脉冲之后在固相和液相中质子速度的差别测定该样品中固体和液体的相对量。将SFI转化成SFC数值并不总是可靠的。对于特定样品来说，通常在10-40℃温度范围内测定固体的百分比。为了了解有关脂肪在不同温度下的特性，需要完整的SFC曲线。脂肪的功能取决于固体含量和位于临界温度处的SFC曲线的斜率，例如，在室温和体温之间的温度合适。这样，所述脂肪的塑性可以预测对性能重要的温度。
对于人造奶油或常规油和脂肪来说，SFC是用直接的、系列的、非稳定方法测定的。SFC NMR直接方法测定并比较来自固相和液相的信号。SFC被定义为由固相中氢核获得的NMR反应与由样品的固相和液相中的核获得的反应的百分比。所述系列非稳定方法使用单一一组样品，通过熔化将该样品加热，并在100℃下保存15分钟，在60℃下保持5分钟，并在0℃下保持1小时。然后将该样品在每一个记录温度下保持30分钟，并在测定SFC之后马上转移到相邻的较高温度下。据信，这里所出现的高硬脂酸和高油酸以及具有类似组成的油类能够生产SFC特征为25℃下低于20的脂肪制品，优选25℃下低于15，更优选在25℃下低于10，最优选在25℃下低于5，并且在10℃下高于20，优选在10℃下为20-50，更优选10℃下为20-35。
脂肪的熔点也是一个重要指标。由于脂肪是由具有不同熔点的甘油三酯的混合物组成，通常不可能进行精确测定。本行业有若干种测定熔点的常用方法，包括毛细熔点(AOCS Cc1-25-93)，Wiley熔点(AOCS Cc2-38-91)，滑动点(AOCS Cc3-25-93)，和滴落点(AOCSCc13-80-95)。
在表3中给出了美国人造奶油的典型固体脂肪指数值。数字代表商业制品。不过，对于特定类型的人造奶油来说，生产商的说明有明显的不同，这要取决于1)希望的感官特征，2)满足营养成分要求的组成要求或营养方面的其他信息，3)该制品是否使用非制冷形式陈列销售，和4)现有的包装设备类型。固体值是成品在冰箱温度下(10℃)的可分散性，在室温下(21.1℃)对油分离的抗性，和在口腔质量(33.3℃)中的熔化的指标。
表3美国餐桌用糊状制品的典型固体脂肪指数固体脂肪指数10°21.1°26.7°33.3°37.7°棒 28 16 10 2 0软棒20 13 92.50软管11 7 52 0.5液体3 2.52.5 2 1.5黄油32 7 72 0一种人造奶油制品的物理和功能特征主要取决于其油相特征。在成品人造奶油的脂肪固体含量和结构、稠度、和塑性方面存在直接关系。人造奶油稠度、香味和乳化稳定性取决于结晶的脂肪。在美国，氢化是用于改变人造奶油原料的固体/液体关系的优选方法。不过，由于在氢化过程中产生的反式脂肪酸异构体的存在使得氢化油也有问题。大量摄入反式异构体对健康有损害作用，包括提高血浆中低密度脂蛋白与高密度脂蛋白的比例，并增加冠状心脏病的危险。从环保角度考虑，在氢化过程中使用金属催化剂产生了有关有毒金属废品的回收和处理问题。公众对氢化作用的不利影响的日益关注，有可能导致人造奶油配方的明显改变，以便减少或消除工业改性油的存在。
有多种用于测定氧化稳定性的方法为本领域技术人员所公知。现在被常用于评估商用烹饪油的稳定性的一种标准方法是氧化稳定性指数(OSI)，该指数是用由Ominion公司(Rockland,MA，美国)生产的机器自动测定的。
OSI机器通过在加热到110℃的油中吹气泡进行工作。随着油被氧化，形成挥发性有机酸，主要是甲酸，可以在容器中以蒸馏水形式收集这种酸。该机器稳定测定蒸馏水的导电性，并测定感应周期，即该导电性开始迅速升高所需要的时间。据信，本发明以非混合形式和混合形式提供的高硬脂酸和高油酸油以及具有相似组成的油所生产的脂肪酸制品的OSI(110)可以大于15，优选大于25，最优选大于35。
实施例下面的实施例是用于说明本发明的，并不构成对本发明的限定。所给出的所有温度是摄氏度，除非另有说明。在这些实施例中所提供的固体脂肪含量(SFC)特征，表示在指定温度下，在固相中测定的总脂肪组分的百分比。
例1用大豆制备油，并分析脂肪酸组成用于这些实施例中的所有的油都是按照下面的实验室规模的方法制备的。在微波炉中将收获的大豆加热到180°F，冷却到室温，并用Roskamp TRC650-6粉碎辊粉碎。用Kice吸气机除去大豆皮，并将剩余的实质部分加热到180℃，并在Roskamp TRC912压片辊中压片。粗制油在玻璃水夹套提取容器中加热到60℃保持45分钟进行提取，溶剂与固体的比例大约为4∶1。收集己烷/油的混合物，并重复提取。用旋转真空仪对该混合物进行脱溶剂化，留下粗制油。
将体积相当于粗制油的0.1％(v/v)的85％的磷酸溶液加入，并将该溶液加热到65-70℃，保持10分钟，同时搅拌。将热的(60℃)氢氧化钠(8％水溶液)滴加到所述油中，中和游离脂肪酸和磷酸，另外添加0.2％wt/wt的富裕量。在样品被加热到90℃时，通过加入热水到20％(v/v)，同时快速搅拌对所述油进行水洗。让所述油和水在室温下冷却10分钟，然后通过离心分离。通过在85-95℃、在真空条件下快速搅拌对所述油进行脱水30分钟或者直到所述的水份(气泡、冷凝物)被除去。然后用氮气解除所述真空。通过添加2％(wt/wt)活化漂白土(AOCS#Z1077)对所述油进行漂白，并将该溶液在真空条件下在85-95℃下混合30分钟，然后冷却到80℃。用氮气解除所述真空，并添加1％(wt/wt)的硅藻土，并通过制备的硅藻土床过滤该混合物。
以大约50ppm的浓度添加柠檬酸，并在玻璃脱臭仪中在240℃下用蒸汽(4毫升水/100克油)对所述油进行脱臭大约1小时。将精炼过的、漂白过的、并且脱臭过的油在氮气中冷冻保藏。
这些实施例中所披露的所有脂肪酸组成的分析基本上是通过披露于AOCS Celc-89中的方法测定的。按以上方法制备脂肪酸甲酯。将10微升油或液化脂肪与1毫升己烷和0.25毫升3％的甲醇钠溶液混合30分钟。添加乙酸(0.1毫升10％的溶液)，混合该样品，并通过离心分层。在己烷层中提取的所产生的脂肪酸甲酯通过气相层析(GC)分析。使用配有SP2340柱(60米，0.25毫米ID,0.20微米薄膜厚度)(Supelco,Bellefonte,PA)的Hewlett,Packard5890EC(Wilmington,DE)。在加样时柱的温度为150℃，并且用40分钟时间，以2℃/分钟的速度将温度从150℃提高到200℃。注射器和检测器的温度分别为215℃和230℃。所提供的所有组成数值是由通过GC检测仪测定的整体面积计算的相对值。
所有SFC测定大体上是按照披露于AOCS Cd16b-93中的方法进行的。
所有氧化稳定性测定是通过披露于AOCS Cd12b-92(93)中的方法通过OSI确定的。
例2商业人造奶油的固体脂肪含量分析具有不同固态程度的商业人造奶油样品的SFC。通过在100℃下熔化所述制品并去掉含水层制备样品。作为温度的函数分析所得到脂肪级份的SFC，其结果在表4中给出。该表表示可用于根据脂肪塑性和所需要的产品形式(例如，软管，棒条，低脂肪糊状制品)生产不同类型的人造奶油和糊状制品。
表4商业人造奶油在不同温度下的固体脂肪含量功能 产品形式 10 15 20 25 30 354068％的植物油糊状制品棒 24.2 23.5 16.28.54.10.9 0.540％的植物油糊状制品棒 22.2 21.7 15 8 3.61.1 0.070％的玉米油糊状制品棒 31.0 25.8 17.610.9 5 0.7 0.140％的植物油糊状制品软管 16.4 11.9 7.2 4.11.70.6 0.324％的植物油糊状制品软管 18.5 13.9 9.4 5.83.31.3 0.670％的植物油糊状制品棒 40.3 32.1 22.712.6 5.11.3 0.1玉米油人造奶油 棒 35.7 nd 22.113.8 6.71 nd大豆油人造奶油 棒 36.5 nd 23 15.4 8.93 nd软人造奶油 软管 19.1 nd 9 4.41.5-0.1 nd黄油棒 47.3 34.9 20 11.8 5.11.2 0.0
例3高硬脂酸大豆油的固体脂肪含量来自被称为L9216116-109的高硬脂酸大豆，是由杜邦公司用谱系(HST1*(HO2*HO4))*A2506育成的(它表示来自HO2和HO4杂交的后代与HST1杂交，并将所得到的后代与野生型品系A2506杂交产生L9216116-109)。所产生的种子与常规大豆相比，具有较高的硬脂酸含量和较低的亚麻酸含量。亲本HST1,HO2和HO4(见表2)是通过披露于US5710365中的诱变方法筛选的，所不同的是，将不同的大豆品系用作原始材料进行诱变，并且筛选是基于脂肪酸含量的变化，而不是碳水化合物含量。HST1是N85-2176的突变体，该品系是高油酸低亚麻酸品系，由J.W.Burton在美国北卡罗来那州育成(Kuhr等，1987年3月26日N85-2124,N85-2131和N85-2176的销售公告。USDA农业研究机构)。HST1与其亲本N85-2176的差别在于，它具有异常的高硬脂酸含量(HST1=高硬脂酸)，同时又保留了N85-2176的较低的亚麻酸含量。HST1中的高硬脂酸突变抑制了存在于来自N85-2176的遗传背景中的高油酸基因(是后者的上位基因)。HST1与N85-2176不同，它不是高油酸的。HST1中的硬脂酸突变与品系A6(来自依阿华州的W.Fehr)的fasa(见表2)等位，并且在杂交到与fasa相似的背景中之后产生相似的表型。N85-2176和A5(来自依阿华州的W.Fehr)之间的杂交，证实了N85-2176含有存在于A5中的fan基因(见表2)的等位基因，它能产生类似的低亚麻酸表型。因此，HST1同时含有高硬脂酸突变(与fasa等位)和低亚麻酸突变(与fan等位)。
HO2是选自品系N85-2176的诱变的杜邦公司拥有专利权的突变品系。诱变方法基本上与US5710365中披露的方法相同，所不同的是将N85-2176用作诱变的原始材料，并且选择是基于脂肪酸含量的变化而不是基于碳水化合物的含量。HO2与N85-2176(fan)的不同在于它具有略微较高的油酸含量(HO=高油酸)，但保留了N85-2176的低亚麻酸含量。因此，HO2含有一种尚未命名的突变，该突变除了fan基因之外还能产生高于N85-2176的较高的油酸含量。
HO4是选自品系A5的诱变的杜邦公司拥有专利权的突变品系。诱变方法基本上与US5710365中披露的方法相同，所不同的是将A5用作诱变的原始材料，并且选择是基于脂肪酸含量的变化而不是基于碳水化合物的含量。HO4与A5(fan)的不同在于，它具有略微较高的油酸含量(HO=高油酸)，但保留了A5的低亚麻酸含量。因此，HO4含有一种尚未命名的突变，该突变除了fan基因之外，还能产生高于A5的较高的油酸含量。
我们相信，A6(fasa)的衍生物或能产生具有包括类似于本发明所披露的高硬脂酸和低亚麻酸表型的油的组成的种子的类似植物，可用于本文所披露的方法。
按例5所披露的方法育成了高硬脂酸和高油酸大豆。
所有的大豆油都是按照披露于例1中的方法制备的，并在多种温度下分析脂肪酸组成和固体脂肪含量。
表5和6表示硬脂酸含量为15-22％的高硬脂酸大豆油的组成和功能特征。另外，所述油类中的四种具有较高含量的油酸。含有22％硬脂酸和正常油酸含量的油，不具有足够的硬度以便满足软管人造奶油的要求(参见图1)。不过，22％硬脂酸，高油酸组合的SFC特征适合公开的商业软管人造奶油的范围。据信，高硬脂酸与本发明所提供的高油酸油的组合以及具有类似组成的油能够产生这样一种脂肪制品，其SFC特征在25℃下低于20，优选在25℃下低于15，更优选在25℃下低于10，最优选在25℃下低于5，并且在10℃下高于20，优选在10℃下为20-50，更优选10℃下为20-35。
硬脂酸含量低于22％的油不具备与人造奶油和糊状制品一致的SFC特征。因此，可以从具有高油酸浓度和硬脂酸浓度至少为22％的非混合油获得与人造奶油和糊状制品一致的SFC特征。
表5脂肪酸组成链长不饱和 16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 20∶0高硬脂酸 8.8 22.2 14.6 48.1 4.9 1.5高硬脂酸/高油酸油A 5.9 21.9 62.8 2.6 3.6 1.8高硬脂酸/高油酸油B 6.0 18.6 66.8 2.3 3.6 1.5高硬脂酸/高油酸油C 5.5 17.6 67.6 3.4 3.7 1.4高硬脂酸/高油酸油D 5.9 15.1 69.2 2.6 3.6 1.2
表6作为温度的函数的SFC百分数温度10° 15°20°25°30°35°40°高硬脂酸13.9 6.8 4.6 0.1 0.4 0 0高硬脂酸/高油酸油A 21.2 16.47.1 4.5 0 0 0高硬脂酸/高油酸油B 29.9 19.84.3 3.1 0.3 0.6 0.5高硬脂酸/高油酸油C 28.4 17.62.9 1.4 0.5 0 0.3高硬脂酸/高油酸油D 23.6 11.51.0 0.7 0.2 0.4 0.3例4用于生产缺少反式脂肪酸异构体的基础油混合物将高硬脂酸油与棕榈油或全氢化大豆饼(Dlitex PST氢化大豆饼，AC SUMKO,525W.1st Avenue,Corumbus,OH)混合，以便生产能满足人造奶油对SFC的要求并且不含反式脂肪酸异构体的脂质。分析所得到的混合物的脂肪酸组成，在各种温度下的固体脂肪含量，以及氧化稳定性。表7表示上述混合物中每一种的脂肪酸组成和OSI值。图2表示曲线示意图。由高硬脂酸/高油酸制成的混合物和表现出的氧化稳定性值比由高硬脂酸油与正常油酸含量的制成的混合物高4-7倍。据信，本发明所提供的非混合和混合形式的高硬脂酸和高油酸油以及具有类似组成的油能够生产这样的脂肪制品，其OSI(110)大于15，优选大于25，更优选大于35。表8表示上述混合物中每一种的固体脂肪含量。如图3所示，混合形式的高硬脂酸/高油酸表现出高的氧化稳定性(HSHO C+棕榈油，和HSHO D+氢化大豆油)，还改善了其SFC特征，现在与人造奶油的曲线吻合。根信，本发明本发明所提供的非混合和混合形式的高硬脂酸和高油酸油以及具有类似组成的油能够生产这样的脂肪制品，其OSI特征为在25℃下低于20，优选在25℃下低于15，更优选在25℃下低于10，最优选在25℃下低于5，在10℃下大于20，优选在10℃下为20-50，最优选在10℃下为20-35。
表7混合油的脂肪酸组成(％)14∶0 16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 20∶0 OSI(110)高硬脂酸/高油酸油C Nd5.5 17.667.63.4 3.7 1.4 41.2高硬脂酸/高油酸油D 5.9 15.169.22.6 3.6 1.2 nd棕榈油 1.2 44.74.5 39.08.6 0.1 0.4 25.5全氢化大豆油(FHS ) 1.3 55.241.20.3 0.1 0 0.5 nd普通大豆油 0.1 10.94.0 24.651.46.7 0.3 6.1HSHO油C+棕榈油(50％)的混合物 0.6 24.011.053.86.5 1.9 0.9 35.7高硬脂酸+棕榈油(40％)的混合物 0.4 22.215.124.632.42.6 1.0 8.5HSHO油D+FHS(3％)的混合物 nd7.3 15.868.22.8 3.4 1.1 43.3高硬脂酸+FHS(3％)的混合物 0.1 10.322.414.245.64.0 1.4 5.8普通大豆油+棕榈油(35％)0.4 22.14.1 30.136.74.5 0.3 7.4表8作为温度函数的SFC温度 10°20°25°30°35°高硬脂酸/高油酸油C 28.42.9 1.4 0.5 0高硬脂酸/高油酸油D 24.21.8 0.6 0 0棕榈油 57.231.619.710.95.0HSHO油C+棕榈油(50％)的混合物25.810.46.1 3.7 1.7高硬脂酸+棕榈油(40％)的混合物 22.77.4 4.8 2.5 0.7HSHO油D+FHS(3％)的混合物24.44.6 3.5 2.0 0.9高硬脂酸+FHS(3％)的混合物 17.38.2 3.6 2.3 1.2普通大豆油+棕榈油(35％) 12.86.3 4.2 3.3 1.5例5具有高硬脂酸和高油酸含量的大豆在其种子脂肪酸中具有较高油酸含量的大豆品系与其种子脂肪酸中具有较高硬脂酸含量的大豆之间进行杂交。所述高油酸品系含有一个转基因拷贝的大豆脂肪酸脱饱和酶基因gmFAD2-1(Heppard,E.P.等(1996)植物生理学110311-319)，它会导致共抑制，并因此下调gmFAD2-1信号水平，有关内容披露于WO97/40698中。FAD2-1表达的减弱，导致Δ-12脱饱和酶活性的降低，以及多不饱和脂肪酸积累的减少。所述高油品系被命名为D2T，其种子脂类的典型脂肪酸特征在表2中示出。高硬脂酸亲本是从诱变的大豆种子群体中分离的脂肪酸合成突变体(US5557037)，被命名为A6，并且含有脂肪酸突变型fasa等位基因。其典型的种子脂类脂肪酸特征在表2中示出。
种植由上述杂交获得的F1种子，以便获得F1植物。然后让F1植物自花授粉，以便获得F2种子，该种子会发生影响种子脂肪酸特征的基因座的分离。种植F2种子，并且让其植物按上一世代的方式自花授粉，通过披露于WO94/11516中的气相液体层析法，测定从单个F2植株获得的混合种子样品中的五种主要脂肪酸的相对含量。选择来自F2植物的含有最大硬脂酸和油酸含量的其余种子，播种并进行自花授粉，以便获得F3∶4种子。然后对来自每一个F3植物的F4种子的样品(F3∶4种子)进行GC分析，以便确定单株的F3∶4表型。然后对追溯至共同的F2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便获得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)，在表9中示出了油酸和硬脂酸含量最高的单株和家族平均值。以种子脂肪酸中硬脂酸的下降顺序提供单株品系以及家族平均值。
表9来自由高油酸亲本D2T和高硬脂酸亲本fasa杂交产生的单株和F2∶4家族平均的种子脂肪酸特征品系ID各种脂肪酸含量(总种子脂肪酸的％)世代和类型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶37SO-2334-1 7 26 61 1 3 F3∶4单株7SO-2293-2 6 26 61 2 3 F3∶4单株7SO-2293-1 6 25 62 2 3 F3∶4单株7SO-2303-5 6 24 66 0 2 F3∶4单株7SO-2339-1 6 24 64 1 3 F3∶4单株7SO-2295-1 6 24 64 1 3 F3∶4单株7SO-2331-3 7 24 63 1 3 F3∶4单株7SO-5097-3 6 20 67 2 3 F3∶4单株7SO-5097-1 6 20 66 2 3 F3∶4单株7SO-2356-1 6 18 72 0 3 F3∶4单株7SO-2306-2 6 18 71 2 3 F3∶4单株7SO-2305-3 6 18 70 2 2 F3∶4单株7SO-2310-3 6 18 70 2 3 F3∶4单株7SO-2293 6 24 63 2 3 9个植株的F2∶4家族平均值7SO-2334 6 23 65 1 3 8个植株的F2∶4家族平均值7SO-2339 6 23 65 1 3 7个植株的F2∶4家族平均值7SO-2379 6 19 70 1 2 3个植株的F2∶4家族平均值7SO-2305 6 18 71 2 3 10个植株的F2∶4家族平均值在由上述杂交选择的后代中，保留了来自D2T亲本的极低的多不饱和脂肪酸表型和来自含有fasa亲本的极高的硬脂酸含量。在来自所述杂交的选择的后代中，硬脂酸含量相对D2T亲本的提高导致了油酸含量的降低。
例6具有高油酸和高棕榈酸和高硬脂酸含量的大豆在含有D2T基因(编码高油酸含量)的大豆品系和含有fap2等位基因(编码高棕榈酸含量)和fasa等位基因(编码高硬脂酸含量)的大豆品系之间进行杂交，获得F1后代。然后在下一个世代中让F1后代自花授粉，以便获得F2种子和F2∶3家族。选择含有最大棕榈酸+硬脂酸+油酸含量的F2∶3家族，并种植进行自花授粉，以便获得F3∶4种子。然后对来自每一个植株的F4种子的样品(F3∶4种子)进行GC分析，以便可以测定单一的F3∶4表型。将追溯至共同F2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便获得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)。在表10中示出了棕榈酸+硬脂酸+油酸含量最高的单株和家族平均值，以总的种子饱和脂肪酸降低的顺序排列。
表10具有高油酸和高棕榈酸和高硬脂酸含量组合的单株和家族平均表型(D2T+fap2+fasa基因)品系ID 各种脂肪酸含量(总种子脂肪酸的％) 世代和类型16∶018∶0 18∶118∶218∶37HSO-5076-5 12 215833F3∶4单株7HSO-2201-2 12 196223F3∶4单株7HSO-2229-1 12 186513F3∶4单株7HSO-2201-1 11 196223F3∶4单株7HSO-2227-5 11 186613F3∶4单株7HSO-2207-5 11 186513F3∶4单株7HSO-5074-3 11 176313F3∶4单株7HSO-2201-0 11 1863233个植株的F2∶4家族平均值7HSO-2208-0 11 1668133个植株的F2∶4家族平均值7HSO-2208-0 11 1668134个植株的F2∶4家族平均值7HSO-2207-0 11 1568136个植株的F2∶4家族平均值例7具有高油酸和低棕榈酸含量的大豆在含有D2T基因(编码高油酸含量)的大豆品系和含有fap1等位基因和fap3等位基因(编码低棕榈酸含量)的大豆品系之间进行杂交，获得F1后代。然后在下一个世代中让F1后代自花授粉，以便获得F2种子和F2∶3家族。选择含有最低棕榈酸和最高油酸含量的F2∶3家族，并种植进行自花授粉，以便获得F3∶4种子。然后对来自每一个F3植株的F4种子的样品进行GC分析，以便可以测定单一的F3∶4表型。将追溯至共同F2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便获得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)。在表11中示出了具有最低的棕榈酸含量和最高的油酸含量的单株和家族平均值，以总种子脂肪酸中棕榈酸增加的顺序排列。由于低棕榈酸含量的选择要求精确到一个百分点的1/10，表11中所示的棕榈酸值是所述精确水平，而其他脂肪酸的值被四舍五入成最接近的整数百分比。
表11具有高油酸和低棕榈酸含量的单株和F2∶4家族平均表型(D2T+fap1+fap3基因)品系ID各种脂肪酸含量(总种子脂肪酸的％) 世代和类型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶37AO-2079-12 2.7 3 89 1 3 F3∶4单株7AO-2083-12.8 3 90 1 2 F3∶4单株7AO-2072-42.9 3 89 1 2 F3∶4单株7AO-2065-12.9 3 89 1 3 F3∶4单株7AO-2083-33.0 3 89 1 2 F3∶4单株7AO-2075-33.0 3 89 1 3 F3∶4单株7AO-2079-13.0 3 88 2 3 F3∶4单株7AO-2072-13.1 3 88 1 3 F3∶4单株7AO-2085-53.2 3 89 1 2 F3∶4单株7AO-2084-13.2 3 88 2 2 F3∶4单株7AO-2072-63.2 3 88 1 3 F3∶4单株7AO-2081-63.3 3 90 1 2 F3∶4单株7AO-2074-73.3 3 89 1 3 F3∶4单株7AO-2081-33.4 3 89 1 2 F3∶4单株7AO-2087-13.4 3 88 3 3 F3∶4单株7AO-2072-03.0 3 89 1 3 6个植株的F2∶4家族平均值7AO-2083-03.5 3 89 1 2 4个植株的F2∶4家族平均值7AO-2074-03.5 3 88 1 3 7个植株的F2∶4家族平均值7AO-2080-03.6 3 88 1 3 5个植株的F2∶4家族平均值7AO-2065-03.6 3 88 1 3 3个植株的F2∶4家族平均值7AO-2082-03.6 3 88 2 3 5个植株的F2∶4家族平均值7AO-2068-03.6 3 88 1 3 4个植株的F2∶4家族平均值7AO-2079-03.6 3 88 1 3 12个植株的F2∶4家族平均值例8具有高油酸和低亚麻酸含量的大豆在含有编码高油酸含量的D2T基因的大豆品系和含有编码低亚麻酸含量的fan等位基因或D3A基因的大豆品系之间进行杂交，以便获得F1后代。然后在下一个世代中让F1后代自花授粉，以便获得F2种子和F2∶3家族。然后选择含有最低亚麻酸和最高油酸含量的F2∶3家族，并种植，让其自花授粉以便获得F3∶4种子。然后对来自每一个F3植株的F4种子的样品(F3∶4种子)进行GC分析，以便可以测定单一的F3∶4表型。将追溯至共同的F2植物祖先的F3∶4植物表型加以平均，以便获得F2衍生的家族的平均表型(F2∶4家族平均值)。在表12中示出了亚麻酸含量最低和油酸含量最高的单株和家族平均值，以亚麻酸增加的顺序排列。由于筛选低亚麻酸含量需要精确到一个百分点的1/10，表12中所示的亚麻酸值是所述精确水平，而其他脂肪酸的值被四舍五入成最接近的整数百分比。
表12具有高油酸和低亚麻酸含量组合的单株和F2∶4家族平均表型品系ID 各种脂肪酸含量(总种子脂肪酸的％) 世代和类型16∶018∶018∶118∶218∶37OL-2703-653872 1.7F3∶4单株7OL-2708-174851 1.7F3∶4单株7OL-2073-763871 1.8F3∶4单株7OL-2706-664861 1.8F3∶4单株7OL-2703-553881 1.9F3∶4单株7OL-2073-263871 1.9F3∶4单株7OL-5180-763872 1.9F3∶4单株7OL-5181-763862 1.9F3∶4单株7OL-2706-764861 1.9F3∶4单株7OL-2707-564861 1.9F3∶4单株7OL-2705-10 74851 1.9F3∶4单株7OL-2711-474852 1.9F3∶4单株7OL-2712-574842 1.9F3∶4单株7OL-2708-075841 1.84个植株的F2∶4家族平均值7OL-2703-063871 1.97个植株的F2∶4家族平均值7OL-2707-0 64861 2.15个植株的F2∶4家族平均7OL-2705-064851 2.112个植株的F2∶4家族平均值7OL-2710-074852 2.29个植株的F2∶4家族平均值7OL-2711-074842 2.25个植株的F2∶4家族平均值7OL-2712-075823 2.311个植株的F2∶4家族平均值7OL-2713-064852 2.411个植株的F2∶4家族平均值7OL-2709-074832 2.511个植株的F2∶4家族平均值例9从欧洲油菜中分离编码酰基-ACP硫酯酶的cDNA用从欧洲油菜的发育中的种子中分离的mRNA制备cDNA文库，所述欧洲油菜是在授粉之后20-26天从花盆中收获的。提取总的RNA，并通过寡聚dT层析纯化mRNA。该文库是用Ray和Ray披露的方法(1991，核酸研究194559)，用从Pharmacia购买的试剂进行制备的，作了某些改进。按照生产商的说明将所得到的cDNA克隆到λZAP载体(Stratagene,La Jolla,CA)上。一级文库含有大约1×106个个体，并进行一次扩增。
使用Sambrook等披露的克隆技术[(1989)分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港试验室出版社]。通过感染铺平板在总共六个平板上的大肠杆菌得到了扩增文库的约3×105个噬斑，从每一个培育过的平板上提取复制的硝酸纤维素膜。用32p标记过的(随机引物标记试剂盒，Life技术，Gaithersburg,MD)源于芸苔属基因组克隆的序列(WO92/11373中的序列20)探测复制的硝酸纤维素膜，并在63℃下在杂交缓冲液(6×SSC
，5×Denhardts’s溶液[0.5克Ficoll(400型，Pharmacia)，0.5克聚乙烯吡咯烷酮，0.5克牛血清白蛋白(级份V,Sigma)，1mMDETA,1％SDS和100微克变性鲑精DNA/毫升(Sigma))中退火。让所述纤维素膜退火18小时，然后在63℃下用0.2×SSC洗涤，然后放在照相胶片上。统计到了与所述探针杂交的16个噬斑，对其中的7个进行纯化，并按照在λZAP克隆指导试剂盒手册(Stratagene)中的说明进行剪切，用所得到的噬菌粒感染大肠杆菌XL-1Blue细胞，所得到的双链质粒含有选择的cDNA插入片段。通过对纯化的质粒进行限制性分析发现了两种类型的克隆。一种类型是被称为p5C的克隆。通过双脱氧测序测定p5C中的插入片段的序列，并证实它编码欧洲油菜油酰-ACP硫酯酶。该cDNA的序列如序列1所示。其所编码蛋白的序列如序列2所示。预测的翻译产物与由Jones等(1995，植物细胞7359-371)报导的另一种cDNA编码的蛋白具有98.6％的相同性，并交由GenBenk保藏，保藏号为U17098。所述第二种硫酯酶克隆的序列及其蛋白分别示于序列3和4中。
例10在大豆种子中表达源于欧洲油菜的油酰-ACP硫酯酶以XmnI片段形式将p5C上的完整的cDNA插入片段从pBluscript上切除，并克隆到大豆种子表达载体上，用于优良大豆栽培品种A2396的biolistic转化。
构建一种质粒，其中源于欧洲油菜cDNA序列的酰基-ACP(油酰-ACP)硫酯酶受大豆β-conglycinin启动子的控制(Beachy R.N.等(1985)，EMBO杂志43047-3053)。该载体的构建是用披露于WO94/11516中的质粒pCW109实现的。载体pCW109含有830个碱基的DNA片段，它包括大豆种子储存蛋白β-conglycinin的α亚基的启动子序列，一个具有多个限制位点的区域，和源于菜豆种子储存蛋白--菜豆蛋白的1080个碱基的3’调控序列。对载体pCW109进行修饰，以便在所述多克隆区含有SamⅠ位点。通过用XmnⅠ消化除去p5C上的cDNA插入片段，分离，并连接到用SamⅠ消化修饰过的pCW109上，选择沿有义方向插入的来自p5C的cDNA插入片段的事件，并命名为pST14。
构建被命名为pKS18HH的质粒，赋予用该质粒转化过的植物或细菌对潮霉素B的抗性。所述质粒是用以下遗传因子构建的1)质粒载体pSP72(Promega,Madison,WI)，通过除去β-内酰胺编码区对该质粒进行过修饰，2)一种植物选择标记框，包括源于花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV)，它连接于潮霉素B磷酸转移酶(HPT)和源于根癌农杆菌的胭脂氨酸合酶3’调控序列上，和3)一种细菌选择标记框，它包括源于噬菌体T7的启动子，位于HPT编码区上游的SD序列，以及T7转录终止序列。
潮霉素B磷酸转移酶基因可以从含有克雷伯杆菌属衍生的质粒的大肠杆菌菌株W677中获得(pJR225,Gritz,L.和Davies,J.(1983)基因25179-188)。用于在诸如NovaBlue(Novagen,Madison,WI)的大肠杆菌的某些菌株中表达HPT酶的T7启动子HPTT7终止子框是从pEP载体的衍生物获得的。用于在植物表达HPT的35SHPT胭脂氨酸合酶的3’末端框的起点，详细披露于WO94/11516中。
本领域技术人员可以用分子克隆的常用方法将以上因子克隆到一个质粒上。
为了能够将该载体用于Christou等披露的转化方法中(1990，生物技术趋势8145)，通过限制性内切酶消化从35SHPT胭脂氨酸合酶框上去掉HPT编码序列，并代之以正确取向的细菌3-葡糖醛酸苷酶基因的编码区(Jefferson等(1987)EMBO杂志63901-3907)。所得到的质粒被命名为pKS18。
通过HindⅢ的部分消化除去pST14上的β-conglycininp5C菜豆蛋白-3’表达框，分离，并连接到同样用HindⅢ消化过的pKS18上，得到的最终转化载体被命名为pRB19。
该转化技术所产生的植物所结的种子会发生所述导入的转基因的分离。由所述植物获得的混合种子在所述转基因上也可以是嵌合型的。
从上述转化得到三个可育的植株，并通过部分种子分析技术分析其脂肪酸表型。用剃须刀片从所述种子上取得一小片远离胚轴的子叶。在含有1％乙醇钠的甲醇中消化所述切片，并将所得到的脂肪酸甲酯提取到己烷中，然后分离并通过气相液体层析进行定量。由此鉴定具有改变了的脂肪酸特征的种子，随后用于发芽和生长。
在用含有芸苔属酰基-ACP硫酯酶的种子表达载体转化过的上述三个大豆植株中，有一个植株的种子脂肪酸表型没有改变(分析了32粒种子，平均为3.9％的硬脂酸，观察到的范围为3.2％-4.6％)。其余的两个植株在其种子中具有较高的硬脂酸含量。对第二个植株的29粒种子进行了分析，测定其平均硬脂酸含量为5.4％，所观察到的范围为3.8％-7.5％，对来自第三个植株的40粒种子进行了分析，并且测定其平均脂肪酸含量为4.85％，所观察到的范围为3.5％-6.7％。
在根据较高的16∶0和18∶0含量从最初的转化体中筛选的种子中，在随后的世代中筛选同样具有较高含量饱和脂肪酸硬脂酸和棕榈酸的后代。与典型的非转化优良品系相比，硬脂酸的含量提高大约2-3倍，而棕榈酸含量提高大约25-40％。由该转化获得的稳定品系被命名为T1S。该品系业已交给美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)保藏。
例11具有由硬脂酰-ACP脱饱和酶和油酰-ACP硫酯酶的组合改变产生的较高的硬脂酸含量的大豆在含有fasa等位基因的大豆品系和含有T1S基因(增加油酰ACP硫酯酶)的大豆品系之间进行杂交，以便获得F1后代。其目的是积累硬脂酰-ACP，这种物质随后被硫酯酶裂解导致在组织中积累硬脂酸。在随后的世代中让F1后代自交，以便获得F2种子和F2∶3家族。然后选择含有较高含量棕榈酸和硬脂酸的F2∶3家族，种植并进行自花授粉，以便获得F3∶4后代。然后对来自F3植株的F4种子的样品(F3∶4种子)进行GC分析，以便可以测定单一的F3∶4表型。在表13中示出单株的脂肪酸特征，以总的种子饱和脂肪酸增加的顺序排列。
表13由于增加了油酰-ACP硫酯酶和减少了硬脂酰-ACP脱饱和酶而具有高的饱和脂肪酸含量的单株的脂肪酸特征品系ID 各种脂肪酸含量(总种子脂肪酸的％) 世代和类型16∶0 18∶0 18∶1 18∶2 18∶37S-2244-616 36 7 33 7F3∶4单株7S-2244-715 35 8 34 7F3∶4单株7S-2244-315 35 7 34 7F3∶4单株7S-2236-413 35 15 30 6F3∶4单株7S-2236-214 33 9 37 7F3∶4单株7S-2236-613 34 9 36 6F3∶4单株7S-2236-713 34 9 36 6F3∶4单株7S-2244-114 32 9 37 7F3∶4单株7S-2244-414 32 9 37 7F3∶4单株7S-2244-514 32 9 37 7F3∶4单株7S-2236-315 30 11 37 6F3∶4单株7S-2240-312 33 13 35 6F3∶4单株7S-2240-212 32 11 37 6F3∶4单株7S-2240-412 31 13 37 6F3∶4单株7S-2240-512 31 11 38 6F3∶4单株7S-2240-112 29 13 39 6F3∶4单株7S-2236-113 25 11 42 7F3∶4单株例12极高硬脂酸大豆油的固体脂肪含量极高硬脂酸大豆是从例11所述植物上获得的。按例1所述方法用这些种子制备油，并在多种温度下分析脂肪酸组成和固体脂肪含量。
表14和15表示极高硬脂酸大豆油的组成和功能特征，硬脂酸的含量范围为33％-38％。所有这些油都满足人造奶油的固态性要求(为了进行比较参见图1的曲线)。这种高硬脂酸油的SFC特征与棒状人造奶油或黄油的特征一致(参见图4)。据信，源于例11的油以及具有类似组成的油能够生产出这样的脂肪制品，其SFC特征在25℃下低于20，优选在25℃下低于15，更优选在25℃下低于10，最优选在25℃下低于5，在10℃下大于20，优选在10℃下为20-50，最优选在10℃下为35-50。因此，这种油可用于生产基本上不含反式脂肪酸的棒状人造奶油，或者作为硬脂肪添加剂用于混合物中生产人造奶油或油基糊状制品。
表14脂肪酸组成16∶018∶018∶118∶2 18∶320∶0极高硬脂酸A14.4 35.4 8.8 33.25.0 1.7极高硬脂酸B14.0 33.6 9.1 34.85.4 1.6极高硬脂酸C13.5 38.2 8.3 30.95.5 1.9表15作为温度函数的SFCSFC％温度 10° 15° 20° 25° 30° 35° 40°极高硬脂酸A 44.7 31.5 20.4 8.9 0 0.30极高硬脂酸B 36.3 23.9 15.6 4.2 0 0.1 0极高硬脂酸C 48.2 36.8 26.6 13.8 0.5 0.2 0例13生产高油酸和低饱和脂肪酸大豆的其他方法用披露于WO9606936中的启动子棕榈酰-ACP硫酯酶编码区植物转化载体转化能产生大豆体细胞胚胎的培养物，同样用详细披露于WO9606936中的方法获得转化的可育大豆植株。测定从长在转基因植物上的成熟的种子子叶上取出的种子切片的脂肪酸特征。所述植株中的小部分具有在极低饱和脂肪酸性状上似乎发生了分离的种子。鉴定了三个这样的植株；所有三种转基因现象的低饱和酸类型平均具有组合的16+18∶0含量为总的脂肪酸的5.6％，而正常饱和脂肪酸类型平均为14.9％。
在表16中给出了组合来自最佳过程的三个植株的低饱和脂肪酸类型种子的228个种子切片的平均总的脂肪酸特征。
表16在生产高油酸和低饱和脂肪酸大豆时被用作亲本之一的三个棕榈酰-ACP硫酯酶共抑制大豆植株的脂肪酸特征
为了用上述植物作为低饱和脂肪酸亲本，产生高油酸、低饱和脂肪酸种子表型，播种来自所述种子切片分析的剩余的种子，并生长到开花。在棕榈酰-ACP硫酯酶共抑制植株和脂肪酸Δ-12脱饱和酶共抑制植株之间进行正反交。由于在种植时，所述低饱和脂肪酸种子可以来自在转基因上纯合的种子或者转基因杂合的种子，所述亲本植株上的其余的花自花授粉。确定所述自花授粉所产生的分离模式，以便鉴定在低饱和脂肪酸转基因上纯合的植物，其特征是缺少正常的饱和脂肪酸种子。播种来自杂交的能使植株在低饱和脂肪酸转基因上纯化的种子。让花进行自花授粉并结实，通过种子切片法分析高油酸和低饱和脂肪酸表型的分离。种植其种子切片表现出理想表型的剩余的种子，并让植株自花授粉，并对来自单株的混合种子进行分析，证实所述理想表型。
序列表<110>纳幕尔杜邦公司<120>能改变大豆油的质量和功能的新型基因组合<130>BB-1156-A<140>
<141>
<150>60/085,030<151>MAY 11,1998<160>4<170>MICROSOFT OFFICE 97<210>1<211>1412<212>DNA<213>欧洲油菜<220>
<221>CDS<222>(36)..(1124)<220>
<221>mat_peptide<222>(210)..(1124)<400>1cggcacgaga cattttcttc ttcgatcccg aaaag atg ttg aag ctc tcg tgt 53Met Leu Lys Leu Ser Cys-55aat gcg act gat aag tta cag acc ctc ttc tcg cat tct cat caa ccg 101Asn Ala Thr Asp Lys Leu Gln Thr Leu Phe Ser His Ser His Gln Pro-50-45 -40gat ccg gca cac cgg aga acc gtc tcc tcc gtg tcg tgc tct cat ctg 149Asp Pro Ala His Arg Arg Thr Val Ser Ser Val Ser Cys Ser His Leu-35 -30 -25agg aaa ccg gtt ctc gat cct ttg cga gcg atc gta tct gct gat caa 197Arg Lys Pro Val Leu Asp Pro Leu Arg Ala Ile Val Ser Ala Asp Gln-20 -15 -10 -5gga agt gtg att cga gca gaa caa ggt ttg ggc tca ctc gcg gat cag 245Gly Ser Val Ile Arg Ala Glu Gln Gly Leu Gly Ser Leu Ala Asp Gln-1 1 5 10ctc cga ttg ggt agc ttg acg gag gat ggt ttg tcg tat aag gag aag 293Leu Arg Leu Gly Ser Leu Thr Glu Asp Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Lys15 20 25ttc atc gtc aga tcc tac gag gtt ggg agt aac aag acc gcc act gtc 341Phe Ile Val Arg Ser Tyr Glu Val Gly Ser Asn Lys Thr Ala Thr Val30 35 40gaa acc gtc gct aat ctt ttg 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1．一种大豆植物，在它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量大于21％，C18∶1的含量大于60％，C18∶2和C18∶3的组合含量低于7％。
2．如权利要求1的大豆植物，其中，所述植物是通过下列步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有决定较高种子硬脂酸含量的fasa等位基因；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
3．由权利要求1的植物所获得的种子。
4．由权利要求1的植物的种子所获得的油。
5．如权利要求4的油，其中，所述油的OSI(110)大于15。
6．如权利要求4的油，其中，所述油的SFC在10℃下大于20，而在25℃下低于20。
7．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求4、5或6的油。
8．如权利要求7的人造奶油或糊状制品，其中，所述人造奶油基本上不含反式脂肪酸。
9．一种适用于生产含有权利要求4、5或6的油的人造奶油或糊状制品的混合脂肪制品。
10．如权利要求9的混合脂肪制品，其中，所述混合脂肪制品的OSI(110)大于15。
11．如权利要求9的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，部分氢化大豆油，部分氢化棉籽油，部分氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物。
12．如权利要求10的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，部分氢化大豆油，部分氢化棉籽油，部分氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物。
13．如权利要求9的混合脂肪制品，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
14．如权利要求10的混合脂肪制品，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
15．如权利要求9的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
16．如权利要求10的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
17．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求9的混合脂肪制品。
18．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求10的混合脂肪制品。
19．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求11的混合脂肪制品。
20．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求12的混合脂肪制品。
21．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求13的混合脂肪制品。
22．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求14的混合脂肪制品。
23．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求15的混合脂肪制品。
24．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求16的混合脂肪制品。
25．通过对权利要求4、5或6的油进行氢化、分离、酯交换反应或水解生产的制品。
26．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求25的制品。
27．一种适于生产含有权利要求25的制品的人造奶油或糊状制品的混合脂肪制品。
28．如权利要求27的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，部分氢化大豆油，部分氢化棉籽油，部分氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物。
29．在生产权利要求4、5或6的油时所产生的副产品。
30．一种大豆植物，在它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0的含量大于10％ ，C16∶0和C18∶0的组合含量大于30％，C18∶1的含量大于55％，C18∶2和C18∶3的组合含量低于7％。
31．如权利要求30的大豆植物，其中，所述植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有决定较高种子硬脂酸含量的fasa等位基因和决定较高种子棕榈酸含量的fap2等位基因；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
32．由权利要求30的植物所获得的种子。
33．由权利要求30的植物的种子所获得的油。
34．通过对权利要求33的油进行氢化、分离、酯交换反应或水解生产的制品。
35．在生产权利要求33的油时所产生的副产品。
36．一种大豆植物，它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量大于42％，其中，所述植物是通过以下步骤生产(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，其中，所述第一亲本的C18∶0的含量占总的种子脂肪酸的至少10％，并且第一亲本还含有至少一个编码油酰-ACP硫酯酶的核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有决定较高种子硬脂酸含量的fasa等位基因；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
37．由权利要求36的植物所获得的种子。
38．由权利要求36的植物的种子所获得的油。
39．如权利要求38的油，其中，所述油的SFC在10℃下大于20，而在25℃下低于20。
40．一种含有权利要求38的油的人造奶油或糊状制品。
41．如权利要求40的人造奶油或糊状制品，它基本上不含反式脂肪酸。
42．一种适用于生产含有权利要求38或39的油的人造奶油或糊状制品的混合脂肪制品。
43．如权利要求42的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，部分氢化大豆油，部分氢化棉籽油，部分氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物。
44．如权利要求42的混合脂肪制品，其中，所述脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
45．如权利要求44的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物，其中，所述混合脂肪制品基本上不含反式脂肪酸。
46．一种含有混入其中的权利要求42的混合脂肪制品的人造奶油或糊状制品。
47．一种含有混入其中的权利要求43的混合脂肪制品的人造奶油或糊状制品。
48．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求44的混合脂肪制品。
49．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求45的混合脂肪制品。
50．通过对权利要求38或39的油进行氢化、分离、酯交换反应或水解生产的制品。
51．一种人造奶油或糊状制品，它含有权利要求50的制品。
52．一种适用于生产含有权利要求50的制品的人造奶油或糊状制品的混合脂肪制品。
53．如权利要求52的混合脂肪制品，它还含有选自下列一组的至少一种成分全氢化大豆油，全氢化棉籽油，全氢化棕榈油，部分氢化大豆油，部分氢化棉籽油，部分氢化棕榈油，大豆油，玉米油，棕榈油，canola油，向日葵油，花生油、红花油或其混合物。
54．在生产权利要求38或39的油时所产生的副产品。
55．一种大豆植物，在它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量低于7％，C18∶1的含量大于87％，C18∶2和C18∶3的组合含量低于6％。
56．如权利要求55的大豆植物，其中，所述植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，所述第一亲本的C18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本含有决定较低的种子棕榈酸含量的fapl等位基因和决定较低的种子棕榈酸含量的fap3等位基因，或者含有编码至少一个决定较低种子棕榈酸含量的植物酰基-ACP硫脂酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，其中，所述硫脂酶对棕榈酰-ACP的优势至少超过硬脂酰-ACP或油酰-ACP的两倍；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
57．由权利要求55的植物所获得的种子。
58．由权利要求55的植物的种子所获得的油。
59．通过对权利要求58的油进行氢化、分离、酯交换反应或水解生产的制品。
60．在生产权利要求58的油时所产生的副产品。
61．一种大豆植物，在它所产生的成熟种子中总的种子脂肪酸特征包括C16∶0和C18∶0的组合含量低于12％，C18∶1的含量大于84％，C18∶2和C18∶3的组合含量低于5％，其中，所述植物是通过以下步骤生产的(a)让第一亲本大豆植物与第二亲本杂交，其中，所述第一亲本的18∶1的含量至少占总的种子脂肪酸的80％，并且第一亲本还含有至少一个编码Δ-12脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，所述第二亲本包括决定较低的种子亚麻酸含量的fan等位基因，或者至少一个编码Δ-15脱饱和酶的大豆核酸片段的转基因拷贝，另外，其中C18∶3的含量不足总的种子脂肪酸含量的4％；(b)从所述杂交步骤(a)获得杂交种子，让所述种子萌发，生长，并通过一个或多个自花授粉周期产生分离的大豆植物群体；和(c)从步骤(b)的分离群体中筛选能产生具有所述脂肪酸特征的种子的植物。
62．由权利要求61的植物所获得的种子。
63．由权利要求61的植物的种子所获得的油。
64．通过对权利要求63的油进行氢化、分离、酯交换反应或水解生产的制品。
65．在生产权利要求63的油时所产生的副产品。
全文摘要
披露了能在大豆种子中产生新型脂类特征的新型基因组合,以及从所述种子中提取的油类。还披露了用于生产所述组合的方法。另外,披露了本发明的油类可用于生产人造奶油和糊状制品。
文档编号C11B1/10GK1300322SQ99806008
公开日2001年6月20日 申请日期1999年5月6日 优先权日1998年5月11日
发明者小·J·R·波斯, R·M·布洛格利, W·D·希茨, A·J·金尼, S·诺尔顿, S·A·塞巴斯迪安 申请人:纳幕尔杜邦公司