大豆耐盐基因GmCIPK2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及大豆耐盐相关基因 GmCIPK2及其应 用。
【背景技术】
[0002] 我国是盐渍土分布较为广泛的国家之一，土地的盐渍化已成为限制我国农业发 展，特别是大豆产业发展的主要障碍因子之一。目前土壤的改良方法中，化学改良和生物 改良是目前研宄的重点。对于化学改良来说，虽然见效快，但容易引入新的离子造成二次污 染，且资金投入和技术要求都很高，对大面积的土地修复实施起来比较困难。而生物改良能 够有效降低成本，是盐渍化土地恢复的最经济有效的措施。
[0003] 生物改良的最终目标也是实现植被的恢复与重建，然而通过常规育种方法术改良 植物的抗旱耐盐性，耗时费力，困难大，已经很难培育出真正的抗性品种。有关植物耐盐碱 基因的分离、提取、克隆已有所研宄，为实现提高大豆的耐盐性提供了可能。了解掌握大豆 的耐盐性并进一步揭示其分子机制，对育成大豆耐盐新品种，扩大大豆的种植范围，减少盐 渍土壤等因素对大豆栽培和产量的影响，稳定我国的大豆生产，保证中国粮食安全和社会 稳定有着重要意义。同时，也是树立我国自有的大豆品牌，增强我国大豆在国际市场上的竞 争力的重要前提和基础。
[0004] 植物的耐盐性状是一个多基因控制的数量性状，而且很多抗耐盐相关的基因未被 发现，这就决定了植物耐盐机制的复杂性。盐胁迫能诱导植物细胞Ca 2+浓度的变化，而Ca2+ 信号是由受体蛋白接受并传导的，这类蛋白叫妈调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-Iike pr〇tein，CBL) ABL为植物抗逆基因调控网络中钙离子通道信号传导的主要调苄基因，目前 已在拟南芥中克隆到10个CBL基因，在其他物种中，如玉米、马铃薯和水稻中也有类似蛋白 发现（GeneBank)。CBLl是CBL蛋白家族中的一员，拟南芥中的CBLl在植物盐胁迫信号传递 通路中起着重要作用。CBLl和CBL9共同作用能够激活CIPK23(CBL-interacting protein kinases，CIPK)，后者通过磷酸化K+转运蛋白AKTl增加胞内的K +浓度，减少Na +的摄入，从 而提高植物的耐盐性。但大豆中的CBL基因及其对植物耐盐性的研宄鲜有报道。
[0005] 本发明中的大豆基因 GmCIPK2属于大豆蛋白激酶，能够通过与大豆耐盐基因 GmCBL3(见发明专利申请201510116210. 1，发明名称：大豆耐盐基因 GmCBL3及其应用，申请 人：山东省农作物种质资源中心，申请日：2015. 3. 17)的蛋白互作来调节大豆GmCBL3的表 达，从而影响植物细胞膜内Ca2+信号的传导，进而改变植物对盐胁迫的适应性，是植物盐胁 迫下钙离子通道信号传导途径中的重要调苄基因。它在拟南芥中的过表达能够明显提高植 株的耐盐性。本发明所报道的大豆基因 GmCIPK2非等同于其亚家族其他成员，具有一定的 特异性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从耐盐、低温敏感型大豆种质371005(山东省沿海地区 种质资源收集编号）中分离得到的耐盐基因一GmCIPK2,将该基因转到模式植物拟南芥中， 得到耐盐性提高的转基因植株。
[0007] 本发明所述的大豆耐盐基因 GmCIPK2,其特征是，它的基因 cDNA的核苷酸序列如 SEQID No. 1 所示。
[0008] 本发明还提供了一种含有上述的大豆耐盐基因 GmCIPK2的植物表达载体 pK2GW7-GmCIPK2〇
[0009] 本发明还公开了上述大豆耐盐基因 GmCIPK2在提高植物耐盐性方面的用途。
[0010] 其中：所述植株是拟南芥；进一步的，所述拟南芥是Col-O野生型。
[0011] 本发明首先利用Clontech的酵母双杂交系统，构建了大豆371005的酵母cDNA 文库；接着在大豆371005植株中克隆到了大豆耐盐基因 GmCBL3(如SEQ ID No. 2所示）， 构建了诱饵蛋白，通过酵母双杂交的方法获得了 GmCBL3蛋白的互作蛋白GmCIPK2 ;然后 利过gateway系统将GmCIPK2基因进行BP反应连接到pD0NR221，通过转化的方法在大肠 杆菌DH5 α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因 GmCIPK2连接到表达载体pK2GW7 上，并在大肠杆菌DH5 α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化 质粒转入农杆菌菌株GV3101中；将转化农杆菌菌株转入拟南芥和大豆中，从而验证表达的 GmCIPK2的功能。
[0012] 本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了大豆 耐盐基因 GmCIPK2并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具 备的提高耐盐性的能力。本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐的植物品种。
【附图说明】
[0013] 图1为LD-PCR检测扩增产物。1、无模板阴性对照；2、1 yg小鼠肝脏阳性对照；3、 LD-PCR扩增产物；M、Marker ;结果显示本实验得到了和阳性对照相当量的cDNA，LD-PCR扩 增成功；
[0014] 图2为载体pGBKT7示意图；
[0015] 图3为载体pD0NR221示意图；
[0016] 图4为植物表达载体pK2GW7示意图；
[0017] 图5为野生型和转GmCIPK2基因的拟南芥转基因阳性植株在NaCl浓度为0. 5%的 1/2MS培养基上正常培养10天的耐盐性功能验证图。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 :大豆371005的酵母cDNA文库构建
[0019] 耐盐大豆种质的采集：本发明的发明人于2009年10月在东营市利津县明集乡齐 家村收集并筛选出一种耐盐、低温敏感型的大豆种质（土壤盐浓度（％。）：1. 5,炜度广： 37.59,经度/° :118.22,海拔/m:10)。根据山东省编号以37开头，第1005份资源，故命名 为371005(山东省沿海地区种质资源收集编号）；其相对盐害指数：18. 00。
[0020] L 1大豆371005植株总RNA的提取：
[0021] (1)大豆371005材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末；
[0022] (2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入 Iml TRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8°C离心10min去沉淀；
[0023] (3)每1ml TRIZOL溶液中加入0. 2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置 5111；[11，120001'/111；[11，2-8。0离心15111；[11;
[0024] (4)取上清，每1ml TRIZOL加入0· 5ml的异丙醇，混勾，室温放置10~20min ;
[0025] (5) 2-8°C 12000r/min 离心 lOmin，弃上清；
[0026] (6)加 Iml 75%乙醇洗绦沉淀2次，4°C不超过7500r/min离心5min，弃上清；
[0027] (7)室温放置晾干后，加入15 μ I DEPC处理的双蒸水溶解RNA。
[0028] 1. 2利用Clontech酵母双杂交文库试剂盒逆转录合成第一链cDNA
[0029] (1)在离心管中混匀以下试剂：
[0030] 1 - 2 μ I RNA 样本
[0031] I. 0 μ 1 引物（5, -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3' SEQ ID No. 3)
[0032] 1 - 2 μ 1去离子水
[0033] 4. 0 μ 1 总体积；
[0034] (2)72。〇，孵育211^11;
[0035] (3)冰上冷却 2min，然后 14000rpm，离心 IOs ;
[0036] (4)混合以下试剂，将混合液加入上述步骤⑶得到的样品中，轻拍混匀；
[0037] 2. 0 μ I 5XFirst_Strand 缓冲液
[0038] Ι.ΟμΙ DTT
[0039] Ι.ΟμΙ dNTP混合物
[0040] I. 0 μ I SMART MMLV 反转录酶
[0041] 9·0μ1 总体积；
[0042] (5)42°C，10min，孵育；
[0043] (6)加入1 μ I SMART Ill-modified oligo(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT TATGGCCGGG-3' SEQ ID No. 4)，混匀，42°C，Ihr 孵育；
[0044] (7) 75°C，10min，终止第一链合成反应；
[0045] (8)室温冷却，加入1 μ I RNA酶H ;
[0046] (9)37°C，20min，孵育；
[0047] (10)继续进行LD-PCR扩增。
[0048] L 3 使用长距离 PCR(LD-PCR)扩增 ds cDNA
[0049] (1)准备：第一链cDNA，预热的PCR仪；
[0050] (2)建立两管IOOul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组：