一种来自淀粉酶产色链霉菌的l-谷氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷 氨酸氧化酶基因及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] L-谷氨酸氧化酶（LGOX)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)为辅基的黄素蛋白 酶类，能专一地催化谷氨酸氧化成α -酮戊二酸、氨和过氧化氢，通过过氧化氢含量的变化 可以方便地测定谷氨酸的含量，利用L-谷氨酸氧化酶研制出谷氨酸检测试剂盒和生物传 感器，在食品工业和临床生化检测领域有着广泛的应用（李玲等.L-谷氨酸氧化酶的分离 纯化及酶学性质的研宄.中国酿造.2012, 31(1) :140-143)。
[0003] 1983 年，Kusakabe 等从一株链霉菌 X-119-6 (Streptomyces sp. X-119-6)菌株 中分离出底物特异性的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸为底物的Km值仅为0. 2mM，该酶 耐热性较强，除催化L-谷氨酸氧化外，仅对L-天冬氨酸有微弱的催化作用（Kusakabe H et al. Purification and purification of a new enzyme，1-glutamate oxidase，from Streptomycessp. X-119-6grown on wheat bran. Agric Biol Chem. 1983,47 :1323-1328)， 2006年日本Yamasa公司构建了链霉菌X-119-6基因组文库，通过探针筛选获得了 LGOX基 因，该基因长2103bp，编码701个氨基酸，含有14个信号肽序列，成熟的蛋白也是由α、β、 γ三个亚基组成，一般组成二聚体形式，分子量大约为140KDa。他们构建大肠杆菌强启动 子调控LGOX基因表达的载体，转化到大肠杆菌中，实现了 LGOX前体蛋白在大肠杆菌的高效 表达，表达的前体蛋白经过内切蛋白酶处理后可以变成活性蛋白（US patent7109008)。目 前该产品转由Kikkoman公司生产并垄断了市场。
[0004] 由于LGOX生产被国外企业控制，我国在上述领域研宄相对滞后，而至今所筛选到 的L-谷氨酸氧化酶产生菌的产酶能力大多很低，即使经过诱变，产酶能力也不高，因此获 得新型LGOX基因并实现基因工程化生产成为解决该酶来源的根本途径。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧 化酶基因及其制备方法和应用，利用基因合成法制备淀粉酶产色链霉菌L-谷氨酸氧化酶 基因，并对该基因进行表达和酶的底物谱分析，以证明其能特异性催化L-谷氨酸，具有作 为L-谷氨酸含量检测用酶的前景。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 所述的来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No. 2。
[0008] 所述的淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因的获取方法如下：
[0009] 利用含50ppm重铬酸钾的高氏一号培养基（高氏一号培养基：可溶性淀粉20g/L， KN03lg/L，K2HPO4O. 5g/L，MgSO4 · 7Η200· 5g/L，NaClO. 5g/L，FeSO4 · 7Η200· Olg/L，琼脂 20g/L， pH = 7. 4)，从土壤微生物中筛选产L-谷氨酸氧化酶的菌株，菌株在显色液（0.1 M磷酸盐缓 冲液（PH6. 5)，0. 07 %的4-氨基安替吡啉，0. 8 %的L-谷氨酸，0. 1 %的苯酚，2000U/L的辣 根过氧化物酶）中显红色即为产L-谷氨酸氧化酶。
[0010] 将筛选得到的菌落提取总DNA，根据L-谷氨酸氧化酶保守盒子序列设计引物
[0011] Primer A :5' -AGTACGCGGAGGCCGGCGCCAT-3' 和 Primer B :
[0012] 5'-GCTGAACTCCAGCAGCACCTTGGT-3'为扩增引物，以总 DNA 为模板，获得一段 984bp 的PCR片段。以此序列为基础，采用Genome Walking Kit试剂盒（大连宝生物公司）获取 其两侧的未知序列，查找完整的开放阅读框，从而获得该L-谷氨酸氧化酶基因的全序列。
[0013] 所述的碱基序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的L-谷氨酸氧化酶基因可通过化 学合成方法得到。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因的合成（PTDS) (Nucleic Acids Research,2004, 32 ：e98)〇
[0014] 具体合成方法包括以下步骤：
[0015] 引物设计：设计长度大概为60bp左右的覆盖整个L-谷氨酸氧化酶基因的寡核苷 酸的序列49个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。
[0016] PCR扩增：利用PCR进行L-谷氨酸氧化酶基因扩增。以SLG1-SLG12 ;SLG13-SLG24 ; SLG25-SLG36 ;SLG37-SLG48 为引物，利用 PCR 进行扩增 SLG1、SLG2、SLG3、SLG4 片段，在 50 μ 1 反应体系中，其中内侧引物 SLG2-SLG11、SLG14-SLG23、SLG26-SLG35、SLG38-SLG47 引 物的添加量为 2ng，外侧引物 SLG1、SLG12、SLG13、SLG24、SLG25、SLG36、SLG37、SLG48 个引 物添加量为30ng(引物序列见实施例4)，扩增条件为：94°C预热lmm;94°C，30S，50°C，30s， 72°C，lmin。共25个循环。扩增片断通过琼脂糖凝胶回收，然后作为模版进行拼接，扩增小 片段SLG1、SLG2、SLG3、SLG4各1 μ g，以SLGl和SLG49为引物进行PCR扩增，扩增条件为： 94°〇预热111^11;94°〇，3〇8,50°〇，3〇8,72°〇，31^11。共25个循环。转化屮0?结束后，用1% 琼脂糖胶回收片段，取10 μ 1直接与T/A克隆载体相连（大连宝生物公司）。4°C连接过夜， 在DH5a感受态中高效转化，获得长度为1974bp的SEQ ID No. 1序列的阳性克隆，即为本发 明的L-谷氨酸氧化酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0017] 将上述获得的阳性克隆利用BamH I和Sac I进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将 该基因与载体pET-28a (NEB公司）4°C连接2小时，得到重组质粒pET-pGOX，并将其转化大 肠杆菌BL21 (DE3) (Novagen公司），将菌液涂布于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的固体LB培 养基（15g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，磷酸缓冲液pH = 7.0)， 37°C过夜培养。次日，挑取单菌落，接种于50ml液体LB培养基（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵 母提取物，l〇g/L NaCl，磷酸缓冲液pH = 7. 0)中，37°C摇床直到菌液的浓度达到0D_为 0. 6时加入终浓度为0. 5mM的IPTG，25°C诱导12h。9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取 湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于PH6. 5、IOOmM的磷酸-磷酸钠缓冲液中（Ig湿细胞 /IOml缓冲液）得悬浮液，用超声波处理悬浮液（功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99 轮），9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP(Amersham Biosciences公司）对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入千分 之一当量的Factor Xa蛋白酶（New England Biolabs公司）在4°C下处理6h，即得本发明 的具有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明从土壤中筛选获得一株产L-谷氨酸氧化酶的淀 粉酶产色链霉菌，并通过培养、提取总DNA和PCR扩增后，得到了如SEQ ID No.l所示的 L-谷氨酸氧化酶基因。该L-谷氨酸氧化酶底物专一性很强，能特异性地催化L-谷氨酸，可 适用于L-谷氨酸含量检测。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明的L-谷氨酸氧化酶基因的PCR扩增产物电泳图。
[0020] 图2为本发明的L-谷氨酸氧化酶的SDS-PAGE电泳图，其中1为用FactorXa蛋白 酶处理过后的L-谷氨酸氧化酶蛋白，含亚基α、β、γ，2代表用HisTrap HP试剂盒纯化的 在大肠杆菌BL21 (DE3)过量表达的L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，3为蛋白分子量MARKER。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合【具体实施方式】详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的 技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人 员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的 精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0022] 本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich)公司。
[0023] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨 姆布鲁克、E. F弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科学出版社】。
[0024] 实施例1菌种分离
[0025] 称取土壤样品lg，加入0· 9 % (w/v)氯化钠溶液Iml，5000转/分震荡混匀，3000 转/分轻离心，倒掉上清，再加入0. 9% (w/v)氯化钠溶液lml，5000转/分震荡混勾，冰上 IOmin静置，吸取100 μ L溶液涂布于含有50ppm重铬酸钾的高氏一号培养基中，30°C下培养 4天。根据菌落形态和大小挑取菌落分别对应地接入对照与显色两种平皿中（平皿中均为 高氏一号培养基），30°C下培养3天，取显色平皿，将显色液浸过的滤纸置于其菌落上，标记 显色快、红色深的菌落在对照平皿上对应菌落，挑取该菌落在高氏一号培养基上划线分离， 30°C下培养3天，挑取单菌落保藏备用。
[0026] 实施例2总DNA提取及菌种鉴定
[0027] 将分离获得的菌株接种于20mL液体培养基（酵母粉3g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖 l〇g/L，可溶