一种中温α-淀粉酶的制作方法
【专利摘要】本发明公布了一种中温α-淀粉酶，该酶酶最适作用温度为65℃，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活；该酶最适反应pH值为5.0，在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活；该酶酶活力为7000-8500U/ml。本发明中的中温α-淀粉酶由枯草芽孢杆菌制得，所述枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304已于2013年11月24日保藏于中中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:M 2013600。
CCTCC NO：M2013600
2013.11.24
【专利说明】一种中温01 -淀粉酶
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂领域，特别涉及一种中温0 -淀粉酶。
【背景技术】
[0002]0 -淀粉酶全称为0 -1, 4-葡聚糖水解酶(￡(: 3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开0-1,4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基碳原子为
构型，故得名为淀粉酶。淀粉酶是最重要的一类酶，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种，占酶制剂市场月25%的份额。
[0003]其中，中温0-淀粉酶是一类最适反应温度处于50-70摄氏度之间的淀粉酶。这类酶的最适反应温度较高，所以其适用范围非常广。目前，中温淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵等行业，也用于饲料、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等各个领域。
[0004]中温淀粉酶在医药行业的应用:
[0005]助消化:用于消化药物，一是在胃中促进淀粉消化、减轻胃部胀感；二是将淀粉水解成糖分，使之易于被机体吸收，使用中温0 ~淀粉酶，降解淀粉，降低粘度，帮助消化。
[0006]抗炎净创类药品的应用:中温淀粉酶是目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。中温淀粉酶和其他酶联合运用能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽，腐肉和碎肩。还能够分解脓液中的核蛋白，使之成为简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性，达到洁净创口、消炎抗肿的目的。
[0007]中温淀粉酶对淀粉原料的处理:
[0008]在发酵行业中一般使用的原料中都含有淀粉，例如生产酒精、酿酒、食醋等，这些淀粉一般都是粗原料，使用淀粉酶和糖化酶对原料预处理，方便微生物发酵。尤其是中文淀粉酶的应用更简化了生产的能耗，下面列举一些应用中温淀粉酶处理淀粉原料的例子:
[0009]葡萄糖生产:葡萄糖是淀粉糖工业中产量最大的一个部门，生产出来的葡萄糖进一步精制可应用到制药行业，生产葡萄糖传统工艺是使用酸水解淀粉，但是必须使用精制淀粉作原料。40年代发展的酶法生产，专一性高，不需要精制淀粉，污染小。目前广泛使用的是双酶法制糖工艺，先用中温0 -淀粉酶进行连续喷射液化，加入糖化酶进行间歇式糖化，这样不但增加能耗，而且成本高，采用中温淀粉酶就解决了这个问题，具有很好的发展前景。
[0010]有机酸生产:柠檬酸、乳酸、衣康酸和苹果酸等有机酸的生产主要通过微生物发酵方法获得，在微生物发酵时都需要使用淀粉作为原料，包括红薯或玉米等，都不适宜在高温下进行，所以使用前都需要使用中温0 ~淀粉酶进行水解处理。
[0011]中温淀粉酶在添加剂中的应用:
[0012]在许多时候还需要报中温0 -淀粉酶作为食品添加剂、饲料添加剂或者辅助添加剂添加到食品、饲料、药品和日化产品中去。在饲料中添加中温淀粉酶其主要作用是补充动物内源酶的不足，提高饲料中淀粉的利用率，尤其是幼龄动物对淀粉的利用率。目前在饲料生产中0-淀粉酶主要和纤维素酶、蛋白酶、植酸酶等酶类混合使用添加到饲料当中，在畜禽的肠道内发挥作用，分解饲料中的淀粉类物质，促进消化，提高利用率。洗涤剂用酶主要添加蛋白酶，其次是淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。其与蛋白酶配合使用，用于洗衣粉，液体洗涤剂。特别在以淀粉为主要食物的地区，在洗涤剂中添加淀粉酶很普遍。对3 ~淀粉酶的要求是低温活性高，与洗涤剂的其他组分，特别是表面活性剂有很好的相容性，有出色的稳定性。目前应用的中温淀粉酶一般在60度上下表现出良好的活性，适合在洗涤剂中使用。
[0013]由此可见，近年来中温淀粉酶已经引起研宄人员的广泛关注，具有广阔的应用前景，但是现有的中温淀粉酶在发酵时的最大酶活都难以令人满意，特别是在需要进行液化糖化的工艺当中存在需要反复调节邱值的缺陷，因此急需研发出发酵时最大酶活较高且使用邱较宽泛的中温3 -淀粉酶的菌株，以满足日益增长的工业化生产需求。
【发明内容】
[0014]本发明的目的是提供一种中温0 -淀粉酶。
[0015]所述的中温的0 -淀粉酶，其酶学性质如下:
[0016](1)该酶温度适应范围较宽，温度在55-751:之间活性较高，最适作用温度为65。。；
[0017]热稳定性:该酶在651:条件下保存2处仍具有80%酶活，701:条件下保存12匕仍具有50%以上酶活。
[0018](2)该酶最适反应邱值为5.0。在邱值4.0-6.0之间均有较高酶活力；
[0019]酸稳定性:在邱4-6下保存1811后仍有80%以上的酶活。
[0020](3)酶活性:菌株304通过发酵制备的酸性中温3 -淀粉酶酶活力为7000-850(^/1111。
[0021]采用常规发酵方法生产上述中温0 -淀粉酶，其发酵罐培养阶段包括如下步骤:
[0022]将种子液以6-10%接种量接入发酵罐，培养温度30-371，搅拌速度200-250^/111111，通风量培养时间60-851！获得。发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温0-淀粉酶。
[0023]所述的酸性中温0 -淀粉酶由枯草芽孢杆菌3048%111118 81^1:1118304生产所得。该菌株已于2013年11月24日保藏于中中国典型培养物保藏中心(简称地址为:中国.武汉.武汉大学)，保藏号为^0:1 2013600。
[0024]所述枯草芽孢杆菌304由一株分离自酸性土壤的产中温0 -淀粉酶的枯草芽孢杆菌出发菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，菌株特点如下:
[0025]所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥褶皱，色暗不透明，边缘整齐，镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形。
[0026]有益效果:
[0027]本发明所提供的酶在55-751:之间均表现较高酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽，其最适作用温度为651。该酶在651:条件下保存2处仍具有80%酶活，701:条件下保存12卜仍具有50%以上酶活，具有较好的热稳定性。在邱4.0-6.0时酶活性较高，且邱达到5.0时呈现最高酶活。且在1)114-6下保存18卜后仍有80%以上的酶活。比现有的中温0 -淀粉酶酶活力高，酶作用最适邱值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
【具体实施方式】
[0028]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0029]实施例1: 一种中温0 -淀粉酶的制备方法
[0030]一种中温0 -淀粉酶的制备方法，包括如下步骤:
[0031](1)菌种活化
[0032]将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，351:培养3(?进行菌种活化，如此活化3次；
[0033]所述斜面培养基组成为:牛肉膏68，氯化钠此，蛋白胨15&葡萄糖5@，琼脂20邑，蒸馆I水 10001111,邱值 6.5，121。。灭菌 20111111 ；
[0034](2)液体种子扩大培养
[0035]①一级种子培养:将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度351:，培养时间1(? ；
[0036]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0037]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度351:，培养时间10匕；
[0038]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为1501的一级种子罐，发酵培养基装量1001，培养温度351，搅拌速度300印111，通风量罐压0.051%，培养时间1511 ；
[0039]所一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0040]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.1%，中草药剂粉1.8%，海藻糖2%，硫酸钙18，氯化镁况，柠檬酸钠况，不足部分纯净水补足，1)?值 6.5，123。。灭菌 401111110
[0041〕 所述种子罐培养基重量组成为:
[0042]麦芽糊精10%，酵母粉0.6%，中草药剂粉1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.3%，玉米浆0.3 %，磷酸氢二钾1.1%，硫酸镁0.08 %，柠檬酸钠0.3 %，不足部分纯净水补足，邱值6.5，123。。灭菌 401111110
[0043]所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0^ 108个加1 ；
[0044](3)发酵罐发酵
[0045]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度351，搅拌速度25017111111，通风量培养时间751！，控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中邱值保持在6.5 ；
[0046]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精1008，玉米粉558，豆饼粉208，中草药剂粉408，海藻糖358，酵母粉68，玉米浆38，硫酸铵28，磷酸氢二钾28，磷酸二氢钾28，柠檬酸钠38，消泡剂0.58，纯净水100001,邱值6.5，121。。灭菌20-；
[0047]所述中草药粉剂的制备方法如下:
[0048]称取黄芪25份；党参15份；柴胡15份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度到331，邱值6.5，按质量比添加0.3%纤维素酶酶解1.5小时，控制温度801:保持8分钟，然后降温至501，邱为6.0，按重量比分别加入0.20%的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解50分钟，冷却到81:保持2小时，升高温度到901:保持15分钟，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至701:保持3.处，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
[0049]所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1.2。
[0050](4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温0 -淀粉酶。
[0051]经上述制备方法得到发酵液经离心取上清所得的中温0 -淀粉粗酶液酶活力为8500口鼠
[0052]实施例2:淀粉酶活性的测定
[0053](1)酶活单位的定义:11111粗酶液，于65、邱5.0条件下，1111111液化丨呢可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以表示。
[0054](2)采用0吧法测定淀粉酶活性。
[0055]实施例3:酶学性质的测定酶学性的测定
[0056](1)温度对酶活性的影响以及酶的热稳定性
[0057]5.0条件下，于40-901:下分别测定实施例1所粗酶液酶活力，结果表明该酶在55-751:之间均表现较高酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽，其最适作用温度为651。
[0058]5.0条件下，将粗酶液于40-901:下保存不同的时间后测定酶活，结果显示，该酶在651:条件下保存2处仍具有80%酶活，701:条件下保存12卜仍具有50%以上酶活。
[0059]⑵邱对酶活性的影响以及酸稳定性研宄
[0060]651:条件下，在邱3-8下分别测该酶酶活，结果表明该酶在邱4.0-6.0时酶活性较高，表明该酶为酸性淀粉酶，且邱达到5.0时呈现最高酶活。
[0061]651:条件下，不同邱值下此酶的稳定性:将酶用不同邱值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释，在251:下保温18卜后再测此酶酶活，结果表明在1)114-6下保存18卜后仍有80%以上的酶活。
【权利要求】
1.一种中温α-淀粉酶，其特征在于，所述中温α-淀粉酶具有以下特性: (1)该酶最适作用温度为65°C，该酶在65°C条件下保存24h仍具有80%酶活，70°C条件下保存12h仍具有50%以上酶活； (2)该酶最适反应pH值为5.0，在pH4-6下保存18h后仍有80%以上的酶活； (3)该酶酶活力为7000-8500U/ml。
2.如权利要求1所述的一种中温α-淀粉酶，其特征在于，该酶由枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304 生产所得，保藏号为 CCTCC NO:M 2013600。
3.如权利要求1或2所述的一种中温α-淀粉酶，其特征在于，由以下方法制得: (1)枯草芽孢杆菌304菌种活化，三级种子培养和种子罐培养； (2)发酵罐发酵 将步骤(I)中一级种子罐将种子液以将种子液以6-10%接种量接入发酵罐，培养温度30-37°C，搅拌速度 200-250r/min，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间 60_85h ； (3)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。
4.如权利要求3所述的一种中温α-淀粉酶，其特征在于，所述种子培养，其培养基重量组成为:酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，中草药剂粉1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸钙lg，氯化镁2g，柠檬酸钠l_3g，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121_123°C灭菌30_40min。
5.如权利要求3所述的一种中温α-淀粉酶，其特征在于，所述种子罐培养，其培养基重量组成为:麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药剂粉1.5-2%，海藻糖1_3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH 值 5.5-6.5，121_123°C灭菌 30_40min。
6.如权利要求3所述的一种中温α-淀粉酶，其特征在于，所述发酵培养，其培养基组成为:麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药剂粉30_50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l-5g，硫酸铵l-3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，柠檬酸钠 l_5g，消泡剂 0.Ι-lg,纯净水 100mL, pH 值 5.5-6.5，121°C灭菌 20min。
7.如权利要求4-6任意一项所述的一种中温α-淀粉酶，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下: 称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度到30-35°C, pH值6-7，按质量比添加0.2-0.35%纤维素酶酶解1-2小时，控制温度70°C?90°C保持5-10分钟，然后降温至45-60°C, pH为5.0-7.0，按重量比分别加入0.12-0.25%的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解40-60分钟，冷却到5-10 °C保持1.5-2小时，升高温度到85-95°C保持10-25分钟，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60°C?78°C保持3?4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂； 所述乙醇和丙醇的质量比例为1:1-1.5。
8.如权利要求1或2所述的一种中温α-淀粉酶在淀粉酶解工业中的应用。
【文档编号】C12N9/28GK104450646SQ201410733563
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】李洪兵, 李海清, 张锦杰, 朱永明, 胡永明, 王小玲 申请人:湖南新鸿鹰生物工程有限公司