专利名称：一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及采用基因工程手段构建芽孢杆菌高效分泌表达载体，属于微生物、基 因工程技术领域。
背景技术：
芽孢杆菌是一类格兰仕阳性细菌，其很多菌株如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌等被用作淀粉酶、蛋白酶等酶制剂的生产，许多产品如中温α-淀粉酶、1398 蛋白酶等被长期用于食品加工。芽孢杆菌还具有严格好氧生长的特点，因此一般不具有致 病性，是一类比较安全的微生物。除具有较高的安全性外，芽孢杆菌还具有向细胞外大量分 泌蛋白质的能力，因此也是一类表达外源蛋白的理想宿主菌。中温α _淀粉酶的工业生产菌株主要为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens),目前我国酶制剂工业所采用的生产菌株是60年代中温 α -淀粉酶生产菌株BF7658基础上获得的，为我国酶制剂工业所特有，这一菌株是在野 生型解淀粉芽孢杆菌基础上经反复物理化学诱变产生的淀粉酶高产菌株[无锡酶制剂 厂.枯草杆菌BF-7658CI-淀粉酶高产菌株209的选育和投产.遗传学报，1976，9 (3) 216-223.]。在这一淀粉酶高产菌株中，其控制淀粉酶表达的启动子是用于构建芽孢杆菌 表达载体的理想材料。本发明所使用的中温α-淀粉酶生产菌株由江南大学中国高校工 业微生物资源与信息中心(http://WWW. cicim-cu. Jiangnan. edu. cn)提供，其收藏编号为 B. amyloliquefaciens CICIM B4311。
发明内容
本发明要解决的技术问题是通过基因重组的方法，利用中温α-淀粉酶生产菌 株细胞内α-淀粉酶基因的强启动子和信号肽编码区构建一种能控制外源蛋白在芽孢杆 菌宿主中高效分泌表达的载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供一种高效分泌 表达载体。本发明的技术方案一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为PCHA03，其核苷酸 序列为SEQ ID Ν0:2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏 在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC Μ2010199。所述表达载体pCHA03的构建方法(1)制备中温α -淀粉酶表达控制元件Pamy 以生产菌CICIM Β4311中温α -淀 粉酶基因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌 CICIM B4311中温α _淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列 为SEQ ID NO. 1，与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列[Palva I. Molecular cloning of alpha-amylase gene fromBacillus amyloliquefaciens and its expression in B. subtilis (J). Gene, 1982，19 (1) :81_87.]相比，序列 SEQ ID NO 1 在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T ；
(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PCH02 它含有芽孢杆菌复制元件 ori-pama，大肠杆菌复制元件pMBl ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基 因 tet ；该大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PCH02的构建步骤如下第一步以大肠杆菌质粒pBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMBl ori ；第二步以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PHY300PLK [Ishiwa H andShibahara—Sone H. New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis. IV. The nucleotide sequence of pHY300PLK and some properties in relation totransformation (J). Jpn J Genet，61 :515_528 (1986).]为模板，利用 PCR 方 法获得该质粒中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet ；将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02 ；(3)步骤⑴中获得的中温α _淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤⑵中获得的大 肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03。所述的芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的应用，芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03用 于转化不同类型的芽孢杆菌枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，及地衣芽孢杆菌，利用中温 α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区控制外源蛋白的表达。材料和方法普通分子生物学方法除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989 分子克隆实验手册)，芽孢杆菌的转化按照芽孢杆菌分子生物学操作的经典方法进行 (Harwood, C，R.和Cutting, S. Μ. (eds)芽孢杆菌的分子生物方法)。除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等 1989分子克隆实验手册)。DNA操作所使用的酶根据供应商的说明等使用。引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。大肠杆菌JM109，枯草芽孢杆菌标准株168，地衣芽孢杆菌标准株14580均由中国 高校工业微生物资源与信息中心(http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。DNA操作使用的酶除非另外提及，所有的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均来自上海生工生物工程 有限公司。培养基LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。发酵培养基豆饼粉32g/ L，鱼粉llg/L，淀粉10g/L，(NH4)2SO4 10g/L，用自来水配制。液体摇瓶培养均采用500mL三 角瓶，在37°C条件下按220r/min条件在恒温摇瓶柜中进行。α -淀粉酶活力测定参考中国轻工业部标准GB1805. 1-93生物材料样品保藏芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03， 已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2010年8月11日，保藏编号CCTCC M 2010199。本发明的有益效果本发明实施后获得的分泌表达载体可以实现多种蛋白在芽孢 杆菌宿主中的高效分泌表达，在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
图1大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PCH02的限制性酶切图谱结构。图中符号意义如下T7 termi 来源于T7噬菌体的转录终止子；pMBl ori 来源于 大肠杆菌质粒PBR322的大肠杆菌复制原件；ori-pama 来源于芽孢杆菌载体pHY300PLK的 芽孢杆菌复制元件；tet 四环素抗性基因，可以使含有质粒的大肠杆菌和芽孢杆菌转化子 表现出四环素抗性。图2芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03的限制性酶切图谱。图中符号意义如下Pamy 中温α -淀粉酶表达控制元件，包括中温α -淀粉酶基 因强启动子和信号肽编码区；Τ7 termi 来源于T7噬菌体的转录终止子；pMBl ori 来源于 大肠杆菌质粒PBR322的大肠杆菌复制原件；ori-pama 来源于芽孢杆菌载体pHY300PLK的 芽孢杆菌复制元件；tet 四环素抗性基因，可以使含有质粒的大肠杆菌和芽孢杆菌转化子 表现出四环素抗性。
具体实施例方式通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。实施例1 中温α -淀粉酶基因表达调控元件Pamy的克隆以解淀粉芽孢杆菌CICIM Β4311染色体DNA为模板扩增α -淀粉酶基因的表达控 制元件(Pamy)，采用引物5' -AATTACCGGGTACCCTGGCTGAAAACATTGAGCC-3'，(SEQ ID NO 3)5 ‘ -AATCCGCGGCTCGAGAACTAGTGTCGACGAGCTCCTGCAGAAGCTTTACGTAGGATCCAATGAAT TCGAATTCGGGCCCATTTACGGCTGATG-3‘，(SEQ ID NO 4)扩增片段全长约0. 3kb，用限制性内切酶Kpn I、和Sac II消化，与经相同酶切的 分子克隆通用载体pBluescript sk(-)连接，连接混合物转化大肠杆菌JM109的感受态 细胞，37°C下在含氨苄青霉素(100yg/mL)的LB平板上选择转化子。转化子质粒命名为 pSK-amy，该质粒含有中温α _淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区，为便于使用在信号肽 编码区下游增加了多个限制性内切酶识别位点。实施例2 大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02的构建第一步获得含大肠杆菌复制元件pMBl ori的DNA片段以质粒pBR322为模板，用PCR方法扩增大肠杆菌复制元件，利用引物如下5' -ATCTCGAGCAGCTGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTG GGGCCTCTMACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAMGGAGGMT CATGACCAAAATCCCTTMC-3 ‘, (SEQ ID NO 5)5'-ATAGGCCTTACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCC-3，，(SEQ ID NO 6)PCR扩增获得一约0. 9kb大小的DNA片段，该片段包含大肠杆菌复制原件pMBlori，该片段用Xho I和Stu I酶切后备用。在引物SEQ ID NO :5中，下划线部分序列与T7 噬菌体转录终止序列一致，在所构建的载体中起转录终止的作用。第二步获得含芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet的片段以芽孢杆菌质粒pHY300PLK为模板，扩增含芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素 抗性基因tet的片段，利用引物如下5，-ATAGGCCTGCTAGAAATTCCTTAAGG-3，，(SEQ ID NO 7)5，-ATCTCGAGAATGCATGGTACCGCTAGAAATTCCTGTTATAAAAAAAGGATC-3，，(SEQ ID NO 8)PCR扩增获得一约3kb大小的DNA片段，该片段含有芽孢杆菌复制元件ori-pama 和四环素抗性基因tet，片段用Xho I和Stu I酶切后与在本实施例第一步中获得的片段进 行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名 为PCH02，该质粒的限制性酶切图谱如图1所示。 实施例3 芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03的构建将实施例1中获得的重组质粒pSK-amy用限制性内切酶Kpn I和Sac II酶切，分 离其中约0. 3kb大小的片段，该片段含有中温α -淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区组 成的表达调控元件Pamy，分离后备用。将实施例2中获得的大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02用限制性内切酶Kpn I 和Xho I酶切，与上一步骤中用同样酶切并分离获得的0. 3kb片段进行连接，连接物转化大 肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCHA03，该质粒的限 制性酶切图谱结构如图2所示。实施例4 利用芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03实现高嗜热α -淀粉酶基因在芽孢 杆菌中的分泌表达以含有古细菌Pyrococcus furisus来源的高嗜热α -淀粉酶基因的质粒 pEtac-amy [沈微王正祥唐雪明等.古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α -淀粉酶基因在 大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造，2003，1 :12-14.]为模板，利用引物如下5，-AATGAATTCATGGCAAAATACTTGGAGC-3，，(SEQ ID NO 9)5，-AATAAGCTTTTACCCAACACCACAATAAC-3，，(SEQ ID Ν0:10)PCR扩增获得一约1. 4kb大小的DNA片段，该DNA片段为P. furiosus α -淀粉酶基 因的成熟肽编码基因(Pfa)，编码的α-淀粉酶具有极高的耐热性，在121°C条件下处理1 小时酶活仍能保留一半以上M。上述DNA片段用EcoR I和Hind III酶切后与实施例3中 获得的经同样酶切处理的载体PCHA03进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素 的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCHA-pf a。大量提取质粒pCHA-pf a分别转化枯 草芽孢杆菌标准株168、解淀粉芽孢杆菌CICIM B2125和地衣芽孢杆菌标准株14580等，在 含15μ g/mL四环素的LB固体培养基中筛选转化子，转化子分离纯化后分别接种含15 μ g/ mL四环素的LB液体培养基，培养24小时后分别取IOmL培养液接种IOOmL发酵培养基中。 作为对照，用空质粒PCHA03转化枯草芽孢杆菌标准株168、解淀粉芽孢杆菌CICIM B2125和 地衣芽孢杆菌标准株14580等获得的转化子也同样接种。上述菌株在发酵培养基中摇瓶培 养48小时后各取培养液30mL，以8，000r/min离心20min，取上清液在高压灭菌锅中121 °C 保温1小时，保温后分别取少量培养液检测酶活，结果如表1
表1不同转化子培养液的酶活
权利要求
1.一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为PCHA03，其核苷酸序列为SEQID N0:2，该 芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏 中心，保藏编号CCTCC M 2010199。
2.权利要求1所述表达载体PCHA03的构建方法，其特征在于(1)制备中温α_淀粉酶表达控制元件Pamy 以生产菌CICIM Β4311中温α -淀粉酶基 因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌CICIM B4311 中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1， 与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列相比，序列SEQ ID NO 1 在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T ；(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PCH02它含有芽孢杆菌复制元件ori-pama，大 肠杆菌复制元件PMBl ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基因tet ；该大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02的构建步骤如下第一步以大肠杆菌质粒PBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMBlori ；第二步以大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PHY300PLK为模板，利用PCR方法获得该质粒 中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet ；将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02 ；(3)步骤(1)中获得的中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤(2)中获得的大肠杆 菌_芽孢杆菌穿梭质粒PCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03。
3.权利要求1所述的芽孢杆菌分泌表达载体PCHA03的应用，其特征在于芽孢杆菌分 泌表达载体PCHA03用于转化不同类型的芽孢杆菌枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，及地 衣芽孢杆菌，利用中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区控制外源蛋白的表达。
全文摘要
一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法，属于微生物、基因工程技术领域。芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03，其核苷酸序列为SEQ ID NO2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2010199。本发明主要利用我国中温α-淀粉酶生产菌株(B.myloliquefaciens)CICIM B4311α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区构建适合在芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的载体pCHA03。本发明实施后获得的分泌表达载体可以实现多种外源蛋白在芽孢杆菌宿主中的高效分泌表达，在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
文档编号C12R1/19GK101993887SQ20101025274
公开日2011年3月30日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者沈微, 王正祥 申请人:江南大学