一种小鼠rankl突变体表达载体及其构建、表达及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物学、分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种具有生物 活性的不同半胱氨酸位点（Cys)突变的小鼠核因子KB受体活化因子配基（RANKL)的突变 体表达载体及其构建、表达及应用。
【背景技术】
[0002] 骨骼具有为了自身的形态变化和维持血钙浓度而重复形成和吸收、进行重建的动 态平衡特征。正常的骨豁通过由成骨细胞、骨细胞介导的骨形成及由破骨细胞介导的骨吸 收而处于动态平衡状态。骨骼动态平衡的维持是一个多因素、多环节的复杂调控过程，而成 骨细胞、骨细胞与破骨细胞间的信号耦联是核心。这种信号耦联是由一系列的分泌性蛋白 在起着关键的调控作用，而其中最为重要的便是到目前为止研究最为透彻的核因子κΒ受 体活化因子配基（receptoractivatorofNF-κBligand，RANKL)。
[0003] 在骨骼系统中，RANKL主要由成骨细胞、骨细胞表达和分泌，它通过与破骨细胞表 面的RANK蛋白（S卩RANKL的受体)相互作用进而调节破骨细胞的分化成熟。同时，成骨细胞 还会分泌骨保护素蛋白（0PG)，它通过与RANK蛋白竞争结合RANKL，从而起到抑制破骨细胞 分化成熟的作用。一系列研究已经充分表明，RANKL/RANK/0PG信号体系在成骨细胞-破骨 细胞耦联及骨骼代谢平衡中具有核心作用。
[0004]RANKL蛋白在体内存在两种形式：全长RANKL及可溶性RANKL(solubleRANKL， sRANKL)。其中，小鼠RANKL蛋白全长316个氨基酸，人RANKL蛋白全长317个氨基酸，两者 同源性达84%。而sRANKL则是分泌至细胞外的RANKL，它由一系列的蛋白酶如TACE、ADAM10 和MMP-14等对全长RANKL进行剪切得到，剪切位点在小鼠RANKL的139Phe，在人RANKL的 140Ile。RANKL蛋白具有典型的TNF结构域，与TNFalpha、CD401igand、Apo2L(TRAIL)及 Fasligand(FasL)等同属TNF家族。此外，全长RANKL还包括茎状结构区、一段短片段的疏 水性跨膜区和位于RANKL氨基端1-48的低复杂性氨基酸序列。TNF结构域是RANKL-RANK及 RANKL-0PG的相互作用区，是调控破骨细胞分化成熟的关键部位；225Glu、222Arg、299Asp 氨基酸对于RANKL-RANK的相互作用是关键的。由于小鼠RANKL蛋白与人源RANKL蛋白的 同源性较高，因此人们通常以小鼠RANKL蛋白做为研究对象，来进一步研究人RANKL蛋白的 相关生理生化特征。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的问题在于提供一种小鼠RANKL突变体表达载体以及表达 系统，进而便于更准确的对小鼠RANKL蛋白进行深入的研究。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为带有FLAG标 签的含有如SEQ·IDN0:16、SEQ·IDN0:17、SEQ·IDN0:18、SEQ·IDN0:19、SEQ·IDN0:20、SEQ· IDN0 :21、SEQ.IDN0 :22、SEQ.IDN0 :23、SEQ.IDN0 :24、SEQ.IDN0 :25、SEQ.IDN0 :26、SEQ.ID NO:27、SEQ.IDNO:28、SEQ.IDNO:29或SEQ.IDNO:30所示核苷酸序列的小鼠RANKL突变体基 因的载体。其中，所述小鼠RANKL突变体，其氨基酸序列如SEQ.IDNO:1、SEQ.IDNO:2、SEQ.IDN0 :3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDN0 :5、SEQ.IDN0 :6、SEQ.IDN0 :7、SEQ.IDN0 :8、SEQ.IDN0 :9、 SEQ.IDNO: 10、SEQ.IDNO: 11、SEQ.IDNO: 12、SEQ.IDNO: 13、SEQ.IDNO:14 或SEQ.IDNO:15 中任一所示。FLAG标签系统是公认的用于表达、纯化以及检测融合蛋白的表达系统，广泛应 用于Westernblotting、免疫细胞组化、免疫共沉淀、流式细胞术、蛋白纯化以及蛋白相互 作用、蛋白分离等多个研究领域。FLAG标签是专为标记目的而设计的多肽标签，由8个亲水 氨基酸残基组成（DYKDDDDK)，因此不会占据其他表位与结合域，避免导致融合蛋白的功能、 分泌性以及转运发生改变。由于它的亲水性特点，FLAG标签倾向于定位在融合蛋白表面， 因此更易与抗体结合以及被肠激酶酶解。有两种商品化的抗体Ml和M2可特异性识别FLAG 标签，其中Ml克隆的FLAG抗体可用于检测FLAG标签位于N末端的重组蛋白，而M2克隆的 FLAG单克隆抗体则可以检测几乎所有的FLAG标签蛋白。
[0007] 所述表达载体是通过将编码上述小鼠RANKL突变体的基因克隆至pFLAG-Cl载体 中的MCS区域获得的。
[0008] 在所述的表达载体中，所述pFLAG-Cl载体是以pCMV-N-Flag和pEGFP-Cl为出发 载体通过基因重组获得的。
[0009] 本发明提供了一种构建上述的表达载体的方法，包括使用限制性内切酶NheI和 BglII双酶切质粒pCMV-N-Flag和pEGFP-Cl，进行基因重组操作的步骤，将pCMV-N-Flag载 体中的FLAG标签替换至pEGFP-Cl载体的EGFP标签位置，且pEGFP-Cl载体的EGFP标签被 完全替换掉。
[0010] 本发明提供了一种含有所述的表达载体的重组细胞，所述重组细胞为由上述的表 达载体转染的HEK293细胞。HEK293细胞株来源于人胚肾上皮细胞，其极少表达细胞外配体 所需的内生受体，由于容易转染且容易培养，常被用于转染试验，是一个很常用的表达研究 外源基因的细胞株。
[0011] 本发明提供了一种构建上述重组细胞的方法，取上述的表达载体转染入HEK293 细胞株中，经过抗性筛选，即得表达带有FLAG标签的小鼠RANKL突变体的细胞。
[0012] 本发明提供了一种所述的重组细胞在细胞染色、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应 用。
[0013] 本发明提供了一种重组细胞表达系统，所述表达系统为分别将上述的各个表达载 体转染入细胞得到的细胞总和。
[0014] 本发明提供了一种所述的表达系统在细胞染色、免疫印迹和免疫沉淀试验中的应 用。
[0015] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0016] (1)本发明所述的含有编码FLAG标签的小鼠RANKL突变体的基因的表达载体，所 述表达载体表达了一种带有FLAG标签的小鼠RANKL蛋白中位于不同位点的半胱氨酸（Cys) 位点选择性突变为甘氨酸（Gly)的小鼠RANKL突变体，从而可以更加准确的、方便的、高效 的对小鼠RANKL蛋白进行深入的研究；
[0017] (2)本发明所述的小鼠RANKL突变体的表达载体的构建方法步骤简单易于操作， 所用时间短，通过该方法可以快速的获得小鼠RANKL突变体的表达载体；
[0018](3)本发明所述的表达带有FLAG标签的小鼠RANKL突变体的重组细胞制备方法， 通过采用该方法获得的重组细胞可以稳定的表达带有FLAG标签的小鼠RANKL突变体，进而 方便的研究小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征；
[0019] (4)本发明表达带有FLAG标签的小鼠RANKL突变体的重组细胞可表达产生小鼠全 长RANKL及小鼠可溶性RANKL蛋白，且小鼠全长RANKL的N端融合了 FLAG标签，可被FLAG 抗体特异检测到，进而可以应用于细胞染色、免疫印迹、免疫沉淀等试验，从而可以方便、高 效的研究Cys位点突变对小鼠RANKL蛋白相关生理生化特征的影响；
[0020] (5)本发明所述的表达带有FLAG标签的小鼠RANKL突变体的表达系统，该系统为 具有生物活性的、带有FLAG标签、不同半胱氨酸位点（Cys)突变了的小鼠核因子κΒ受体活 化因子配基（RANKL)的表达系统，通过该系统可以研究不同Cys位点突变对小鼠RANKL蛋 白相关生理生化特征的影响。
【附图说明】
[0021] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0022] 图1为实施例1的PCR克隆获得小鼠RANKL基因片段的电泳结果；
[0023] 图2为实施例1的重组pEGFP-RANKL载体的限制性内切酶鉴定结果；
[0024] 图3为实施例2的使用多位点定点突变方法获得的8种小鼠RANKL突变体的表达 载体的限制性内切酶鉴定结果；
[0025]图4为实施例2的使用单位点定点突变方法获得的7种小鼠RANKL突变体的表达 载体的限制性内切酶鉴定结果；
[0026] 图5为实施例3中质粒pCMV-N-Flag和pEGFP-Cl的酶切产物的1%琼脂糖凝胶电 泳结果；
[0027] 图6为实施例3中质粒pFLAG-Cl的酶切产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果；
[0028] 图7为实施例3中制备的小鼠RANKL突变体的表达载体的酶切产物的1%琼脂糖 凝胶电泳结果；
[0029] 图8为实施例4中制备的表达FLAG标签及不同Cys位点突变小鼠RANKL突变体 的重组细胞的WesternBlotting鉴定结果；
[0030] 图9为实施例5中表达FLAG标签及不同Cys位点突变的小鼠RANKL突变体的重 组细胞的棕榈酰化检测结果。
【具体实施方式】
[0031] 本发明的下述实施例中所用的试剂、载体、蛋白、细胞等均为市售产品，不同厂家、 不同型号的下述试剂、载体、蛋白、细胞均可实现本发明的目的，效果并无明显差异，本发明 的下述各实施例仅以如下型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白、细胞为代表，进行技术效果 的阐述，并不局限于以下所列举的型号和生产厂家的试剂、载体、蛋白和细胞。
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[0033] pMD 19_TSimp 1 eVector、TaKaRaLATaq、TaKa