一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种双miRNA抑制表达载体及其构建方 法和应用。
【背景技术】
[0002] RNA是生物体内一种重要物质，在生命活动中发挥着各种各样的功能。根据是否 编码蛋白质，RNA可分为信使RNA(messagerRNA，mRNA)和非编码RNA(non-codingRNA， ncRNA)。小RNA(smallRNA，smRNA)是一类重要的ncRNA。miRNA是生物体内一种内源性小 RNA，长度一般为20_24nt。miRNA是pri-miRNA(primaryRNA)的一部分，最初在细胞核中由 RNA聚合酶II转录表达。成熟的miRNA作为引导性分子，根据碱基配对原则与靶基因mRNA 结合，引导沉默复合体（RISC)降解mRNA或阻碍其翻译，从而发挥对靶标基因表达的负调控 作用。
[0003] 紫花苜蓿（MedicagosativaL.)有"牧草之王"的美誉，是世界上被广泛种植的一 种重要的饲料作物。由于紫花苜蓿粗蛋白含量在21. 8%~37. 6%之间，远高于小麦、玉米 等粮食作物的粗蛋白含量，对保证奶牛产奶质量具有重要意义。我国许多地区都存在不同 程度的干旱和盐渍化问题，为了优先保证粮食产量我国主要将苜蓿等牧草种植于受干旱、 盐渍化等影响的贫瘠土地上，因此提高苜蓿抗逆性对提高苜蓿产量，进而保障我国牧草供 应具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的双miRNA抑 制表达载体。
[0005] 一种部分重叠的互补引物对，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1和SEQID NO: 2所示。
[0006] 一种将本发明所述的部分重叠的互补引物对同时作为引物和模板扩增得到的序 列，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:3所示。
[0007] 一种双miRNA抑制表达载体，其包括本发明所述的序列SEQIDNO: 3。
[0008] 本发明所述双miRNA抑制表达载体在提高苜蓿抗逆性中的应用，所述双miRNA抑 制表达载体转化苜蓿后能同时抑制苜蓿中Ms-miR393和Ms-miR398的表达，进而提高苜蓿 中靶标基因MsTIRl、MsAFB2、MsCSDl和MsCSD2的表达，最终使苜蓿的耐盐、抗旱等抗逆性得 到增强。
[0009] 一种本发明所述的双miRNA抑制表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0010] (1)根据苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398序列以及miRNA海绵技术原理，设计权利要 求1所述的部分重叠的互补引物对Seql和Seq2,所述Ms_miR393和Ms_miR398序列的核苷 酸序列分别如序列表中SEQIDN0:4和SEQIDN0:5所示，所述Seql和Seq2序列的核苷 酸序列分别如序列表中SEQIDNO: 1和SEQIDNO:2所示；Seql序列对应的转录产物包含 Ms-miR393_sponge和Ms-miR398_sponge，核昔酸序列分别如序列表中SEQIDN0:6 和SEQ IDNO:7所示，它们分别与Ms-miR393和Ms-miR398存在2~3个碱基不能完全互补配对， 进而形成发夹结构；
[0011] (2)用ddH20将Seql和Seq2配制成10yM浓度溶液，将Seql和Seq2同时作为引 物和模板进行重叠延伸PCR反应，反应程序为：95°C预变性5min;95°C变性30sec，50°C退 火 30sec，72°C延伸 30sec，30 循环；72°C延伸 5min;
[0012] 经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小为400~lOOObp的弥散条带，主条带 大小为600~800bp;将主条带进行切胶回收，连接到克隆载体pEASAY-Tl上获得重组载体 pEASAY-Tl-Seq3,转化大肠杆菌，在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上筛选出阳性 克隆并测序，选出插入序列Seq3含有8~10个重复Seql序列的阳性克隆，其核苷酸序列 如序列表中SEQIDN0:3所示，将阳性克隆大肠杆菌进行扩大培养并提取质粒，使用XbaI 和BamHI双酶切后进一步将Seq3片段连接到植物表达载体pBIGFP上，获得双miRNA抑制 表达载体pBIGFP_Seq3。
[0013] 将重组载体pBIGFP_Seq3转化农杆菌（EH105)，通过50mg/L卡那霉素抗性筛选 获得成功转化的农杆菌单克隆，使用农杆菌介导法转化苜蓿愈伤组织，最终获得遗传转化 苜蓿阳性植株。阳性转化苜蓿植株能够大量表达与Ms-miR393和Ms-miR398分别互补的 Ms_miR393sponge和Ms_miR398sponge，能够抑制Ms_miR393 和Ms_miR398 的活性，从而使 Ms-miR393和Ms-miR398靶标基因的表达不受其抑制，进而增强苜蓿转化植株的耐盐抗旱 等抗逆性。
[0014] 本发明双miRNA抑制表达载体与现有技术不同之处在于：
[0015] 本发明中PCR扩增目标序列所用引物Seql和Seq2序列部分重叠互补，PCR反应时 不需要添加模板，Seql对应转录产物Ms_miR393sponge和Ms_miR398sponge与Ms_miR393 和Ms-miR398能够分别形成不完全互补发夹结构；PCR扩增目标序列所用程序的72°C延伸 时间控制在30sec，从而保证扩增产物Seq3序列包含8~10个重复Seql序列。
[0016] 双miRNA抑制表达载体pBIGFP_Seq3经遗传转化表达后可以应用于提高苜蓿抗 逆性，所述载体pBIGFP-Seq3经转化苜蓿后能够同时抑制Ms-miR393和Ms-miR398的表 达；miR393和miR398在植物抗逆调控中起着重要作用，通过设计miR393和miR398抑制 表达载体能够明显提高植物抗逆性；针对苜蓿Ms-miR393和Ms-miR398设计抑制表达载体 并转化苜蓿，将为抗逆高产苜蓿新品种的培育奠定基础。本发明通过抑制苜蓿Ms-miR393 和Ms-miR398 表达，进而增强Ms-miR393 和Ms-miR398 靶标基因MsTIRl、MsAFB2、MsCSDl 和MsCSD2的表达，这些靶标基因对提高苜蓿耐盐、抗旱等抗逆性具有重要作用。将获得的 pBIGFP-Seq3载体转化苜蓿阳性植株进行盐胁迫和干旱胁迫处理，结果表明转基因苜蓿比 野生型苜蓿抗逆性明显增强。
[0017] 下面结合附图对本发明的双miRNA抑制表达载体作进一步说明。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明中引物Seql和Seq2互补结构图；
[0019]图 2 为本发明中Seql对应的转录产物Ms-miR393_sponge和Ms-miRNA398_sponge 与Ms-miR393和Ms-miRNA398形成的互补结构图；
[0020] 图3为本发明中使用Seql和Seq2为引物进行PCR扩增产物的电泳图；
[0021] 图4为本发明双miRNA抑制表达载体pBIGFP_Seq3结构图；
[0022] 图5为本发明中转基因紫花苜蓿（35S::Seq3)与野生型紫花苜蓿在盐胁迫下的比 较图；
[0023] 图6为本发明中转基因紫花苜蓿（35S: :Seq3)与野生型紫花苜蓿在干旱胁迫下的 比较图。
【具体实施方式】[0024] 实施例1
[0025] l、Ms-miR393和Ms-miRNA398串联互补载体的构建
[0026] 根据苜蓿Ms_miR393和Ms_miR398序列，设计2条不完全重叠互补引物Seql和 3692,5691和5692的核苷酸序列分别如序列表中5￡〇10勵：1和5￡〇10勵:2所示，互补 结构如图1，Seql序列对应的转录产物Ms-miR393_sponge和Ms-miRNA398_sponge与苜蓿 Ms_miR393和Ms_miR398之间存在2~3个碱基不能完全互补配对（图2)，不互补碱基位 点随机