专利名称：一种植物表达载体及其构建及利用百脉根为生物反应器生产鸡α干扰素的方法
技术领域：
本发明生物生物技术转化领域，特别是涉及一种以百脉根牧草为生物反应器生产 药用蛋白鸡α干扰素的方法。
背景技术：
α干扰素(Alpha interferon, IFN- α )是一类具有强大和广谱抗病毒作用的细 胞因子，是动物机体防御系统的重要组成，于1957年在研究流感病毒干扰现象时在鸡胚绒 毛尿囊膜发现。鸡α干扰素(chicken alpha interferon, ChIFN-α )对禽流感(AIV)、新 城疫(NDV)、传染性法氏囊炎(IBDV)、传染性支气管炎(IBV)、马立克氏病(MDV)和劳氏肉瘤 (RSV)等病毒均有抑制作用。这些病毒病是危害养禽业发展的重要传染病，常常造成极大的 经济损失，近些年来以高致病性禽流感为代表的鸡病毒病甚至还威胁着人类的健康。尽管 干扰素的临床价值是极高的，但是以微生物发酵和动物细胞生产的高昂成本却严重制约着 干扰素在养禽业中的广泛应用。植物生产系统以其对重组蛋白的有效表达、低成本和安全性在近年来成为生物技 术领域的重要关注对象。研究表明，具有生物学活性的人干扰素基因(HuIFN-α/β)在黄 瓜、南瓜、莴苣和水稻等植物中能得到正确表达。通过直接饲喂含有外源干扰素的饲用植 物，不但可以降低劳动强度，而且还能避免疫苗注射引起的鸡群应激等问题。ChIFN-α在 PH2. 0时仍保持活性不变，热稳定性好，含有ChIFN-α的牧草理论上还可以用于青贮料等 的加工。因此以植物作为生物反应器进行干扰素生产无疑是一可供选择的途径。百脉根 (Lotus cirniculatus L.)为多年生优质豆科牧草，管理粗放，草质细嫩，适口性好，蛋白 质含量高，使用百脉根为受体植物可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能的目 的。
发明内容
本研究通过农杆菌介导法将功能蛋白基因(鸡ChIFN-α基因)导入优良南方豆 科牧草Leo百脉根，对获得的抗性植株进行PCR、RT-PCR、Southern blot. Western blot和 ELISA检测分析，证明功能基因已在受体牧草中获得正确转录和翻译表达，为培育动物食用 后增强免疫力的转基因百脉根提供基础依据。本研究对探索禽流感等病毒性疾病的防治新 途径和保证家禽的安全生产具有一定的意义。本研究目的是通过百脉根植物生物反应器表达生产动物药用蛋白鸡α干扰素， 极大地降低生产成本，在给动物提供优质蛋白的同时提高集机体免疫力。一种植物表达载体，其特征在于骨架载体中插入有编码鸡α干扰素的基因片 段，其启动子为CaMV35S组成型启动子。所述骨架载体为pSH737，编码鸡α干扰素的基因片段插入骨架载体的^CbaI和 KpnI酶切位点之间。
所述植物表达载体为pSFRLH，其结构如图1所示。上述植物表达载体的构建方法，包括如下步骤(1)合成如SEQ ID NOl所述的ChIFN- α基因序列，构建构建到pBSK(+)上，得到 pBSK-BNANSI 质粒，(2)以质粒pBSK-BNANSI为模板，使用PifnaiA3ifna-U1引物扩含有组氨酸标签的 ChIFN-α基因片段，Pifnai 5' -GTTCTAGAATGGCTGTTCCAGCTTCTC-3‘；PIFNA_LH 5' -CGGGTACCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGATCCAGATCCTCCCTAGGTCCTGGT GTTTCCG-3‘，(3)扩增产物与载体？3!1737分别经)0^1和恥111双酶切，回收01正^(1基因小片 段和pSH737质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建CaMV35S启动子驱动的ChIFN- α植物 表达载体。利用百脉根为生物反应器鸡α干扰素的方法，其特征在于以农杆菌介导采用上 述植物表述载体载转化百脉根。所述方法包括如下步骤Α、转化宿主上述重组载体以冻融法转入根癌农杆菌ΕΗΑ105，B、根癌农杆菌的准备携带上述重组载体的新鲜农杆菌菌液接种于YEP液体培养 基中培养至生长对数期，离心后MS重悬菌体，C、浸染及筛选百脉根外植体投入MS重悬菌液中，充分接触，侵染后于暗处共培 养，2d后外植体转入脱菌培养基脱菌培养，之后进行筛选愈伤组织和诱导不定芽，D、分化、生根、移栽分化抗性芽长至34cm时，切下转至生根培养基诱导生根，根 系发达后移栽。所述重悬菌体0D600为0. 1-0. 2，侵染时间8分钟，共培养2天。其中IL YEP培养集中包含5. Og蛋白胨，5. Og酵母提取物，2. 5gNaCl，45. Omg卡 那霉素，20mg利福平，PH值7. 20。。其中IL MS培养基中包含硝酸钾(KN03) 1900毫克，硝酸铵(NH4N03) 1650 毫克，氯化钙(CaC12 · 2H20) 440毫克，硫酸镁(MgS04 · 7H20) 370毫克，磷酸二氢钾 (KH2P04) 170 毫克，硫酸猛(MnS04 · 4H20) 22. 3 毫克，硫酸锌(ZnS04 · 7H20) 8. 6 毫克， 硼酸(H2B03)6. 2毫克，碘化钾(KI)O. 83毫克，钼酸钠(Na2Mo04 · 2H20)0. 25毫克，乙二 胺四乙酸二钠(Na2-EDTA. 2H20) 37. 25毫克，硫酸亚铁(FeS04 · 7H20) 27. 8毫克，硫酸铜 (CuS04 · 5H20) 0. 025 毫克，氯化钴(C0C12 · 6H20) 0. 025 毫克，肌醇 100 毫克，烟酸 0. 5 毫 克，盐酸硫胺素(维Bi) 0. 1毫克，盐酸吡哆素(维B6) 0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5. 80，其中MS重悬培养基中含有4. 3g/L MS、200 μ M的乙酰丁香酮和30g/L蔗糖，pH值 均为6. 0。所述愈伤组织诱导培养基中含有4. 3g/L MS、2. Omg/L 6_苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘 乙酸、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；共培养基中含有4. 3g/L MS,200 μ M的 乙酰丁香酮、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH值为6. O ；脱菌培养基中含有4. 3g/L MS,2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、350mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；分化培养基中 含有4. 3g/L MS,2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH值为6. 0 ；筛选培养基中含有4. 3g/L MS,2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. Img/ L萘乙酸、300mg/L头孢霉素、45. Omg/L卡那霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH值均为6. O ； 生根培养基中含有；2. 15g/L MS、0. 2mg/L乙哚丁酸、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L 琼脂，PH值为6.0。植物组织培养各个阶段的培养条件为愈伤组织诱导和共培养均为暗培养；分 化、筛选和生根为光照培养，光强为38001uX、16h/d。所述外植体为百脉根主茎、花茎或嫩 叶。本发明根据鸡干扰素序列设计并合成ChIFN-α基因SEQ ID Ν01，序列中含KpnI/ SalI和BioI限制性酶切位点，合成序列构建到pBSK(+)上，得到pBSK_BNANSI质粒。根据 亚克隆载体pBSK(+)和表达载体pSH737的多克隆位点设计并合成以下引物PIFNA1 5' -GT TCTAGAATGGCTGTTCCAGCTTCTC-3‘ ；PIFNA_LH 5' CGGGTACCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGATCC AGATCCTCCCTAGGTCCTGGTGTTTCCG-3 ‘，引物序列添加XbaI和KpnI限制性酶切位点及2个 保护碱基。以质粒？831(-8織赂1为模板，使用上述引物扩增含有组氨酸标签的01正^0基 因片段，扩增产物与表达载体PSH737分别经^(bal/Kpnl双酶切后，电泳回收ChIFN-α基因 小片段和PSH737质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建CaMV35S启动子驱动的ChIFN- α 植物表达载体。将获得的PSFRLH植物表达载体通过冻融法转化A. tumefaciens EHA105，菌 落PCR筛选阳性克隆。进一步，本发明通过农杆菌介导法将鸡ChIFN-α基因导入南方豆科牧草百脉根， 使其能够作为生物反应器表达药用蛋白鸡ChIFN-α干扰素。发明人利用百脉根主茎、花茎 茎段、嫩叶片段进行遗传转化并得到转基因植株，经PCR、RT-PCR、Southern blot、Western blot和ELISA检测结果表明ChIFN-a基因整合到百脉根染色体基因组中，并得到正确的 转录和翻译表达，转基因百脉根成功表达ChIFN- α蛋白。百脉根为多年生豆科牧草，管理粗放，草质细嫩，青草期长，适口性好，蛋白质含量 高，与现有技术相比本发明将百脉根作为生物反应器生产药用蛋白，直接作为饲料，不仅可 以极大降低动物干扰素生产成本，而且可以在提供优质蛋白的同时达到改善机体免疫功能 的目的。
图1为植物表达载体pSFRLH的物理图谱，其中，IFNRLH为携带His标签的鸡α干扰素基因片段，利用gus: :npt作为标记 和筛选基因。图2A为载体pSFRLH的PCR检测结果图2B为载体pSFRLH的酶切鉴定结果。图3为转基因百脉根的获得过程，其中a为叶片的愈伤组织诱导，b为从愈伤组织诱导不定芽，c为抗生素Kan筛选 后的抗性芽，d为Kan筛选后的非抗性白化芽，e为抗性芽苗的生根。图4为转基因百脉根⑶S组织化学检测，其中A中野生型叶片无任何蓝色出现，B中转基因百脉根叶片呈现阳性蓝色。图5为转基因百脉和对照百脉根植株，
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其中Tl和T2为转基因植株；CK为野生型植株。图6转基因百脉根的PCR检测，其中M为DL2000DNA分子量标准，1为pSFRLH质粒阳性对照，2为无模板阴性对照， 3为非转基因植株阴性对照，4-11为⑶S阳性植株。图7为转基因植株的RT-PCR检测，其中M为DNA分子量标准，Tl和T2为不同的转基因植株，C为pSFRLH质粒阳性对 照，Mtl为水为模板的阴性对照，M1为非转基因植株，M2为无逆转录酶(MLV)的阴性对照。图 8为转基因植株的Southern blot检测，其中1为非转基因对照，2-5为不同的转基因植株。图9为转基因百脉根中ChIFN-α表达蛋白的^festern blot分析，其中1和2为不同的转ChIFN-α基因植株，表达蛋白分子量约为29. 51kD。图10为百脉根牧草中重组ChIFN-α表达蛋白的ELISA检测，其中CK为非转基因百脉根对照植株，Tl和Τ2为不同的转ChIFN- α基因植株
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 构建重组载体pSFRLH(一)材料和方法1.质粒和菌株质粒pblueSCriptK(pBSK)购至上海捷瑞生物公司，质粒pSH737、大肠杆菌菌株 DH5 α和农杆菌菌株ΕΗΑ105，均已经公开报道，可通过公司购买或其他公开渠道获得，必要 时也可向贵州省农业生物工程重点免费索取。2.受体材料Leo百脉根(Lotus corniculatus L.)种子，经石砂摩擦擦伤种皮后撒播，进行田 间管理至花期开始利用。3.植物表达载体构建根据鸡α干扰素序列(GenBank No :U07868)设计并合成ChIFN-α基因，序列含 KpnI/Sall和BioI限制性酶切位点，合成序列构建到pBSK(+)上，得到pBSK_BNANSI质粒。 根据亚克隆载体pBSK(+)和表达载体pSH737的多克隆位点设计并合成以下引物PIFNA1 5' -GTTCTAGAATGGCTGTTCCAGCTTCTC-3‘ ；PIFNA_m 5' CGGGTACCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGA TCCAGATCCTCCCTAGGTCCTGGTGTTTCCG-3'，引物序列添加XbaI和KpnI限制性酶切位点及2 个保护碱基。以质粒pBSK-BNANSI为模板，使用上述引物扩增含有组氨酸标签的ChIFN- α基因 片段，扩增产物与表达载体PSH737分别经^(bal/Kpnl双酶切后，电泳回收ChIFN-α基因小 片段和pSH737质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建CaMV35S启动子驱动的ChIFN- α植 物表达载体。将连接产物pSFRLH转化Ε. coli TGl感受态细胞。菌落PCR筛选阳性克隆， 提取pSFRLH质粒进行^(bal/Kpnl双酶切鉴定。将获得的pSFRLH植物表达载体通过冻融法 转化A. tumefaciens EHA105,菌落PCR筛选阳性克隆。结果
植物表达载体pSFRLH的物理图谱见图1。通过Xbal/Kpnl双酶切表达质粒pSFRLH 和菌落PCR鉴定，得到条带与预期片段一致，获得构建正确的植物表达载体pSFRLH (见图 2A、图 2B)。实施例2 农杆菌介导的百脉根转化及再生(1)菌液准备携带植物表达载体pSFRLH的新鲜农杆菌菌液按1 100接种于YEP液体培养基 (附加Kml00mg/L，rif20mg/L)，于振荡培养8h (185rpm/min)至生长对数期，4°C离心 (6500rpm/min) 15min后用MS植物液体培养基(附加200 μ M的As)重悬菌体(0D600 = 0. 1-0. 2)2h 后备用。(2)侵染转化晴天新鲜采摘的盛花期百脉根枝叶，流水冲净后，用75%医用酒精浸泡30s， 0. 升汞溶液灭菌3min，无菌水冲洗多次后，将百脉根主茎、花茎和嫩叶分别切段或切块 后，加入准备好的重悬菌液，轻微晃动使外植体和菌液充分接触作用8min，然后用灭菌滤纸 充分吸干其表面菌液，并接入共培培养基于26°C暗处培养，2d后进行脱菌、愈伤及芽诱导 和筛选，每3周继代1次，待分化芽长至3-4cm时将其切下转至生根培养基诱导生根，约4-5 周根系发达后将再生植株移栽至温室花钵土壤中。(3)培养基及培养条件其中IL MS培养基中包含硝酸钾(KN03) 1900毫克，硝酸铵(NH4N03) 1650 毫克，氯化钙(CaC12 · 2H20) 440毫克，硫酸镁(MgS04 · 7H20) 370毫克，磷酸二氢钾 (KH2P04) 170 毫克，硫酸猛(MnS04 · 4H20) 22. 3 毫克，硫酸锌(ZnS04 · 7H20) 8. 6 毫克， 硼酸(H2B03)6. 2毫克，碘化钾(KI)O. 83毫克，钼酸钠(Na2Mo04 · 2H20) 0. 25毫克，乙二 胺四乙酸二钠(Na2-EDTA. 2H20) 37. 25毫克，硫酸亚铁(FeS04 · 7H20) 27. 8毫克，硫酸铜 (CuS04 · 5H20) 0. 025 毫克，氯化钴(C0C12 · 6H20) 0. 025 毫克，肌醇 100 毫克，烟酸 0. 5 毫 克，盐酸硫胺素(维Bi) 0. 1毫克，盐酸吡哆素(维B6) 0. 5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5. 80。IL YEP培养集中包含5. Og蛋白胨，5. Og酵母提取物，2. 5gNaCl，PH值7. 20。愈伤组织诱导培养基中含有4. 3g/L MS、2. Omg/L 6_苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙 酸、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；共培养基中含有4. 3g/L MS,200 μ M的乙 酰丁香酮、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；MS重悬培养基中含有4. 3g/L MS,200 μ M的乙酰丁香 酮和30g/L蔗糖；脱菌培养基中含有4. 3g/L MS、2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、 350mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；分化培养基中含有4.3g/L MS、2. Omg/L 6-苄 氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；筛选培养基中含有 4. 3g/L MS,2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、300mg/L头孢霉素、45. Omg/L卡那霉 素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；生根培养基中含有；2. 15g/L MS、0. 2mg/L乙哚丁酸、300mg/L 头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。实验中生根培养基为1/2MS培养基，其余培养基均为 MS常规培养基，各培养基pH值均为6. O。植物组织培养各个阶段培养条件为愈伤组织诱导和共培为暗培养；分化、芽增 殖、筛选和生根为光照培养，光照强度为30001UX、16h/d。(4)转基因植株检测1)⑶S组织化学法鉴定
取转化的植株幼嫩枝叶，加入GUS染液(50mM NaCl ；IOOmM Tris-HCl(pH 7.5)； 2mM铁氰化钾；ImM X-gluc和20% (ν/ν)甲醇)浸没并抽真空后于37°C黑暗孵育Mh，然 后用90% (ν/ν)乙醇脱色观察。2)基因组DNA的PCR扩增提取⑶S鉴定阳性植株的基因组DNA作为模板进行ChIFN- α目的基因的PCR检 测，以同批非转化组培再生苗为阴性对照。使用检测引物5' -GCTGTTCCAGCTTCTCCAC-3' 和5 ‘ CCTGGTGTTTCCGGTAAGG-3 ‘作为上下游引物检测目的基因，反应条件为94°C 5min ； 94 "C 40sec,56 "C 40sec,72 "C 40sec, 5cycles ；94 "C 40sec,58 "C 40sec,72 "C 40sec, 25cycles ;72°C 8min。扩增产物用1.0% (ff/V)的琼脂糖凝胶进行电泳检测。3) RT-PCR 检测新鲜样品用液氮研磨后加入Trizol提取液提取总RNA。使用一步RT-PCR 法，以1. 0 μ g总RNA (20 μ L反应体系)为模板，使用引物对5 ‘ -GTTCTAGAATGGCTG TTCCAGCTTCTC-3 ‘和 5 ‘ -GGGGTACCCTATTACTA GGTCCTGGTG-3 ‘作为上下游引物对 ChIFN- α基因的转录进行检测，PCR扩增条件为预变性94°C 5min;然后94°C 40sec, 57 °C 40sec,72°C 40sec，5 个循环；94°C 40sec,59°C 40sec,72°C 40sec，25 个循环；最后 72°C延伸8min。PCR产物在1.0% (ff/V)琼脂糖凝胶上电泳检测。实验分别设质粒阳性对 照和非转基因植株和水为模板的阴性对照。4)转基因植株的Southern blot检测Α)探针标记使用PCR扩增法进行探针标记。冰上制备反应液，反应体系(总 体积20yL)为0.5yL正向引物，0.5yL反向引物，l.OyL cDNA模板，2.0yL 10XPCR Buffer,2. 0μ L MgC12, l.OyL Dig-dUTP 标记混合物，12. 5 μ L 2dH20,0. 5μ L Taq DNA 聚 合酶。PCR扩增程序为94°C5min ；94°C 40sec, 54°C 40sec, 72°C 40sec, 5cycle ；94°C40sec, 56°C 40sec，72°C 40sec，25cycle ;72°C 5min。标记探针在 1.0% (ff/V)的琼脂糖凝胶上电 泳检测。B)基因组DNA提取及酶切。0. Ig新鲜烟草叶片，小量法提取烟草基因组DNA。C)使用KpnI和HindIII于37°C双酶切烟草基因组DNA 6h，酶切体系(总体积 400yL)为40yL IOXM Buffer，44y L 基因组 DNAQOy g)，3μ L ΚρηΙ,3μ L HindIII, 310 μ L 2dH20。将酶切基因组DNA沉淀浓缩后，按20 μ g/well上到1. 0%的琼脂糖凝胶样 孔。D)电泳与凝胶处理。使用2V/cm的电压(50V)电泳几后，凝胶用双蒸水洗净并修 剪掉多余边缘，转入洁净培养皿中，用5 X体积变性液振荡洗涤20min，重复1次；双蒸水振 荡洗涤5min后，加入5 X体积的中和液振荡洗涤15min，重复1次。E)转膜与膜处理。以20 X SSC作为转移缓冲液，使用毛细管法将DNA过夜转移到 尼龙膜上。用5X SSC振荡洗涤尼龙膜5min以除去琼脂糖残迹，膜晾干后置80°C烘烤池， 4°C保存备用。F)预杂交和杂交。将尼龙膜置于杂交袋中，加入65°C预热的Hyb高效杂交液5mL， 置杂交箱中62°C振荡杂交1.证。将标记的探针放100°C煮10分钟后立即冰浴冷却10分 钟，按3μ1/膜^mL-I)加入到Hyb高效杂交液中，排尽杂交袋中的预杂交液，加入 5mL含探针的Hyb高效杂交液，置杂交箱中62°C振荡过夜杂交12h。
G)洗膜。用20mL的2 X SSC (含0. 1 % SDS)室温振荡洗涤杂交膜两次，每次5分 钟；用50°C预热的0. IX SSC(含0. SDS)溶液50°C振荡杂交膜洗涤两次，每次15分钟； 加入20mL洗涤缓冲液振荡洗涤杂交膜5分钟。H)杂交检测。杂交膜在洗涤缓冲液中浸润5分钟，在30mL阻断液中孵育30分钟， 在20mL抗体液中孵育30分钟，用30mL洗涤液洗涤2 X 15分钟，在15mL检测缓冲液中平衡 5分钟。将膜放在一层保鲜膜上，加入ImL新鲜配制的发光底物液，然后盖上一层保鲜膜， 室温静置作用5分钟后，用X光片压片，分别进行lmin、3min、5min、10min和20min的曝光、 3min显影、5min定影。5)转基因植物表达产物检测(I)Western blot 检测A)样品制备。百脉根叶片用液氮研磨成细粉后转入1. 5mL离心管中按1 1加入 蛋白提取液，涡旋振荡器上振荡lmin，冰上浸提30min，4°C、12，000rpm/min离心lOmin，取 上清于-80°C冻存备用。B)电泳。配制SDS-PAGE凝胶，组成为10%分离胶9mL(3mL分离胶贮备液(30% Acr-Bis)，2. 25mL 分离胶缓冲液，0. 09mL 10% SDS，3mL 双蒸水，0. 06mL 10% 过硫酸铵， 0. 6mL TEMED)，5%浓缩胶;3mL(l. 5mL 浓缩胶C备液，0. 75mL 浓缩胶缓冲液，0. 03mL10% SDS 溶液，0. 45mL 双蒸水，0. 03mL 10%过硫酸铵，0. 03mL 10%过硫酸铵，0. 24mLTEMED)。C)样品处理。取-80°C冻存样品，加入适量2XSDS凝胶加样缓冲液后，沸水浴加 热5分钟使蛋白充分变性后置于冰上冷却lOmin。D)上样与电泳。蛋白样品按每孔15 μ L上样到凝胶加样孔内，同时上一个标准蛋 白质Marker。110V恒压至溴酚蓝迁移到凝胶外IOmin后停止电泳。E)转膜。350mA转膜60分钟，用丽春红染色液对膜进行染色判断转膜效果。F)封闭。转膜完毕后，立即把NC膜放置到预先准备好的洗膜液中漂洗1-2分钟 后，除去洗涤液，加入封闭液4°C过夜封闭。G)抗体孵育。用封闭液按1 2000稀释一抗，室温缓慢摇动孵育一小时之后，用 封闭液按1 5000稀释二抗，室温缓慢摇动孵育一小时。H)蛋白检测。严谨洗膜后加入新鲜配制的DAB溶液5mL，避光显色5-30min，出现 背景理想的印迹时用蒸馏水终止显色拍照。(2) ELISA 检测取0. 2g转基因植株叶片，加入液氮研磨成粉后，再加入0. 6mL蛋白提取缓冲液研 磨混勻后冰上放置浸提30min，4°C、12，000rpm/min离心15min后取上清进行ELISA检测。 总蛋白的定量采用考马斯亮蓝法。ChIFN- α 标准品(RapidBioLab ChIFN-α ELISA kit)用 ImL 稀释液复溶后按 0. 5倍倍比稀释成系列浓度的样品。取100 μ L标准品和100 μ L不同的百脉根样品置于鸡 IFN- α 一抗包被的96孔板中。轻轻混勻30s，盖上封板膜，37°C温育90min。加入350 μ L/ well洗涤液洗板5次。加入lOOyL/well 1 XBiotin (生物素标记的一抗)，轻轻混勻 30s，盖上封板膜，37°C温育60min。加入350 μ L/well洗涤液洗板5次。加入100 μ L/well IXHRP (辣根过氧化物酶标记的二抗)，轻轻混勻30s，盖上封板膜，37°C温育30min。加入 100 μ L/welITMB显色液，轻轻混勻10s，37°C暗处孵育15min。加入100 μ L/well终止液，轻轻混勻30s，0. 5h内在酶联检测仪上测定0D450吸光值。以0D450为纵坐标，以样品浓度为 横坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算样品浓度。结果获得正确表达鸡干扰素蛋白的转基因百脉根。以百脉根茎段为外植体，通过农杆 菌介导法将ChIFN-α基因转化百脉根，经过愈伤组织诱导、不定芽分化，抗性筛选、生根等 过程(见图幻获得78株抗性苗。通过GUS组织化学法鉴定(见图4)获得转基因百脉根植 株(见图幻13株，进一步通过基因组PCR扩增(见图6)、RT-PCR鉴定(见图7)及Southern blot分析(见图8)，证实目的基因在受体植物中正确转录和以不同拷贝数整合进百脉根染 色体。Western blot (见图9)和ELISA(见图10)检测结果表明，转基因植株正确表达干 扰素蛋白，在不同转基因植株中重组ChIFN-α表达量相差较大，重组ChIFN-α表达蛋白 的量分别为6. 4960和1. ^92ng。表达蛋白最高为64. 96ng · kg—1鲜重(占总可溶蛋白的 0. 0001% )。本发明将干扰素基因ChIFN-α遗传转化以百脉根，能够获得能被干扰素抗体识 别的表达蛋白，这为使用牧草作为生物反应器生产动物药用蛋白奠定了基础，为动物疫病 的防治提供了新的思路。
权利要求
1.一种植物表达载体，其特征在于在骨架载体中插入有编码鸡α干扰素的基因片 段，其启动子为CaMV35S组成型启动子。
2.根据权利要求1所述的植物表达载体，所述骨架载体为PSH737，编码鸡α干扰素基 因片段插入骨架载体的)(bal和KpnI酶切位点之间。
3.根据权利要求2所述的植物表达载体为pSFRLH，其结构如图1所示。
4.权利要求3所述的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤(1)合成如SEQID NOl所述的ChIFN- α基因序列，构建到pBSK(+)上，得到 pBSK-BNANSI 质粒，(2)以质粒pBSK-BNANSI为模板，使用PifnaiA3ifna,引物扩含有组氨酸标签的ChIFN-α 基因片段，Pifnai 5' -GTTCTAGAATGGCTGTTCCAGCTTCTC-3 ‘，Pifna-lh 5' -CGGGTACCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGATCCAGATCCTCCCTAGGTCCTGGTGTTT CCG-3‘；(3)扩增产物与载体？3!1737分别经)0^1和恥111双酶切，回收010^-(1基因小片段和 PSH737质粒大片段，用T4DNA连接酶连接，构建CaMV35S启动子驱动的ChIFN- α植物表达 载体。
5.利用百脉根为生物反应器鸡α干扰素的方法，其特征在于以农杆菌介导采用权利 要求1-3任一所述的植物表达载体转化百脉根。
6.根据权利要求5所述的方法，包括如下步骤Α、转化宿主权利要求1-3任一所述的植物表达载体以冻融法转入根癌农杆菌 ΕΗΑ105,B、根癌农杆菌的准备携带权利要求1-3任一所述的重组载体的新鲜农杆菌菌液接种 于YEP液体培养基中培养至生长对数期，离心后MS重悬菌体，C、浸染及筛选百脉根外植体投入MS重悬菌液中，充分接触，侵染后于暗处共培养后， 将外植体转入脱菌培养基脱菌培养，之后进行筛选愈伤组织和诱导不定芽，D、分化、生根、移栽分化抗性芽长至3-4cm时，切下转至生根培养基诱导生根，根系发 达后移栽。
7.根据权利要求5所述的方法，所述重悬菌体0D600为0.1-0. 2，侵染时间8分钟，共培养2天。
8.根据权利要求5所述的方法，其中ILYEP培养基中包含5. Og蛋白胨，5. Og酵母提 取物，2. 5gNaCl，45. Omg 卡那霉素，20. Omg 利福平，PH 值 7. 20，其中IL MS培养基中包含硝酸钾(KN03) 1900毫克，硝酸铵(NH4N03) 1650毫 克，氯化钙(CaC12 · 2H20) 440毫克，硫酸镁(MgS04 · 7H20) 370毫克，磷酸二氢钾 (KH2P04) 170 毫克，硫酸猛(MnS04 · 4H20) 22. 3 毫克，硫酸锌(ZnS04 · 7H20) 8. 6 毫克， 硼酸(H2B03)6. 2毫克，碘化钾(KI)O. 83毫克，钼酸钠(Na2Mo04 · 2H20) 0. 25毫克，乙二 胺四乙酸二钠(Na2-EDTA. 2H20) 37. 25毫克，硫酸亚铁(FeS04 · 7H20) 27. 8毫克，硫酸铜 (CuS04 · 5H20) 0. 025 毫克，氯化钴(C0C12 · 6H20) 0. 025 毫克，肌醇 100 毫克，烟酸 0. 5 毫 克，盐酸硫胺素(维Bi) 0. 1毫克，盐酸吡哆素(维B6) 0. 5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5. 80，其中MS重悬培养基中含有4. 3g/L MS,200 μ M的乙酰丁香酮和30g/L蔗糖，pH值均为.6. 0，其中愈伤组织诱导培养基中含有4. 3g/L MS、2.0mg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙 酸、300mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH值为6. 0 ；共培养基中含有4. 3g/L MS、 20(^11的乙酰丁香酮、3(^/1蔗糖和68/1琼脂，？!1值为6.0;脱菌培养基中含有4. 3g/L MS、 2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、350mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH 值为6. O ；分化培养基中含有4. 3g/L MS,2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、300mg/ L头孢霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH值为6. O ；筛选培养基中含有4. 3g/L MS、2. Omg/L 6-苄氨基嘌呤、0. lmg/L萘乙酸、300mg/L头孢霉素、45. Omg/L卡那霉素、30g/L蔗糖和6g/L 琼脂，PH值为6. O ；生根培养基中含有；2. 15g/L MS、0. 2mg/L乙哚丁酸、300mg/L头孢霉素、 30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH值为6. O。
9.根据权利要求5所述的方法，其中植物组织培养条件为愈伤组织诱导和共培养均 为暗培养；分化、筛选和生根为光照培养，光强为38001uX、16h/d。
10.根据权利要求5所述的方法，所述外植体为百脉根主茎、花茎或嫩叶。
全文摘要
本发明涉及“一种植物表达载体及其构建及利用百脉根为生物反应器生产鸡α干扰素的方法”，属于生物技术领域。植物表达载体pSFRLH，如图1所示。以百脉根主茎段及花茎茎段、嫩叶作为外植体，以构建的植物表达载体鸡α干扰素基因ChIFN-α的遗传转化，再生，经PCR、RT-PCR、Southern blot、Western blot和ELISA检测结果表明ChIFN-α基因整合到百脉根染色体基因组中，并得到正确的转录和翻译表达，重组蛋白能被ChIFN-α抗体中和。这为使用百脉根牧草作为生物反应器生产动物药用蛋白奠定了基础，为动物疫病的防治提供了新的思路。
文档编号C12N15/82GK102121029SQ20101057917
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者卢凌霄, 宋莉, 李岩, 赵德刚 申请人:贵州大学