专利名称：一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner，简称Bt)是一种分布极其 广泛的、在其生活史中能形成芽胞和产生多种蛋白晶体的革兰氏阳性细菌。Bt是目前微生 物农药中研究最为深刻、应用最为广泛的微生物杀虫剂，它至少对无脊椎动物中线性动物 门、原生动物门、扁形动物门等4个门以及节肢动物中九个目的有害生物有活性，对人、畜 无毒，害虫不易产生抗性、成本低、易于工业化生产，半个世纪以来已广泛应用于全球的多 种农业和林业害虫的生物防治。Bt能产生对多种昆虫或无脊椎动物有害的毒素，这些毒素有的是蛋白质，有的 是小分子物质，有的在细菌营养生长期产生，有的在芽孢形成期产生，有的分泌到细菌外， 有的贮存在细胞内。目前的Bt毒素最常见的是杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, I CPs)，也称δ -内毒素(delta-endotoxin)，于芽胞形成期在菌体的一端或两端 形成，Bt的杀虫大多或完全依赖于ICPs (依昆虫而定)，它的形状、结构和大小均与其毒力 有着密切关系。其中cry2a就是ICPs基因的一种，产生的cry2a蛋白能用于杀虫实验及转 基因植物的抗虫防护。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种转基因水稻Bt蛋白Cry2a的原核表达及 纯化方法，选取抗虫的Bt--cry2a为对象，利用原核表达系统表达cry2a蛋白，并用亲合层 析纯化表达产物，以获得较高纯度的表达蛋白cry2a。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达方法，包括以下步骤1)根据华中农业大学测序好的cry2a的基因，以及所要连接的载体PMD18-T的多 克隆位点设计并合成的正、反向引物，进行PCR扩增、回收，并对该PCR回收物进行DNA连接 反应；2)大肠杆菌感受态细胞的制备和转化；3)表达质粒的重组构建、重组菌的诱导表达。所述正、反向引物的序列如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具体如下正向引物5，-CGGGATCC(BamHI) ATGAACAACGTGCTGAACAGCGGCAG-3，；反向引物5，-CGGAATTC(EcoRI) TTAGTAGAGTGGCGGCAGGTTGGTG-3，。所述大肠杆菌感受态细胞为E. coli DH5 α和E. coil Transetta(DE3)。进一步的，通过Ni-NTA亲和层析进行表达蛋白纯化。所述转基因水稻Bt蛋白cry2a在胶体金免疫层析试纸条中的应用。本发明是通过制备cry2a蛋白的抗体在胶体金免疫技术中的应用来达到检测BT基因的目的。胶体金免疫技术，是90年代新兴的一种免疫学方法，现在生物医学各领域得 到了日益广泛的应用。它实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程， 显色程度与抗原含量成正比。本发明通过制备转基因水稻Bt蛋白Cry2a进而获得抗体，并制作成胶体金免疫层 析试纸条，以便在转基因植物检测中快速、准确的检测出Bt基因。本发明所研制的胶体金免疫层析试纸条是将金标苏云金芽孢杆菌cry2a单克隆 抗体喷涂在玻璃纤维膜上。由于毛细管作用，样品将沿着硝酸纤维素膜移动，当有苏云金芽 孢杆菌cry2a存在时继而被固定的抗体着色，在样品观察区(S区)可形成一条色带，以此 来检测Bt基因的存在。同时内置质控色带(C区)是为了确认该实验是否成立。胶体金免 疫技术具有便捷、快速、灵敏、安全、低成本等特点，由于不需要酶促反应的底物，单份测定， 除试剂外无需任何特殊的仪器设备，且试剂稳定，近年来发展迅速。该法检测速度快，一般 一两分钟可出结果，灵敏度高，可达50IU/L。本发明所述一种转基因水稻Bt蛋白Cry2a的原核表达及纯化方法，操作简单、成 本低，并制备得到纯度在90%以上的表达蛋白Cry2a。进一步，利用本发明制备的高纯度转 基因水稻Bt蛋白Cry2a可获得抗体，并可制作成胶体金免疫层析试纸条，为在转基因植物 检测中快速、准确的检测出Bt基因提供了可能。
图1为Cry2a的原核表达及纯化路线图。 图2为cry2a基因PCR扩增结果，其中泳道3为质粒PCR扩增；泳道4为空白对 照。图3为cry2a-T重组克隆质粒PCR鉴定结果，其中泳道11为重组克隆质粒；泳道 12为空白对照；泳道13为阳性对照。图4为cry2a-T重组克隆质粒酶切鉴定结果，其中泳道4_5为cry2a-T双酶切后； 泳道7为cry2a-T重组质粒。图5为蛋白质纯化结果，其中泳道1为宿主菌(E.coli BL21(DE3))；泳道2为 PET-30a(+)；泳道3为cry2a_pET30a (+)；泳道4和6为纯化前；泳道7-9为纯化后。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。本发明所用限制性内切酶、溶液KSolution I)均购自宝生物工程(大连)有 限责任公司，引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，质粒DNA提取试剂盒、DNA回 收试剂盒与亲和层析柱均购自上海申能博彩生物科技有限公司，大肠杆菌感受态细胞 Transetta (DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，其他所用化学试剂购自国药集团化学 试剂有限公司。实施例1苏云金芽孢杆菌cry2a基因编码的cry2a蛋白的原核表达及纯化方法转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化路线图参见图1。1.引物的设计与合成根据cry2a的基因，以及所要连接的载体PMD18-T的多克隆位点，利用PrimerPremier 5. 0设计一对特异性引物-正、反向引物。其中，在正向引物(cry2a-F)加上BamH I位点，在反向引物(cry2a-R)加上EcoRI位点。正、反向引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成，其中，正、反向引物的序列 如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，具体如下正向引物5，-CGGGATCC(BamHI) ATGAACAACGTGCTGAACAGCGGCAG-3，；反向引物5，-CGGAATTC(EcoRI) TTAGTAGAGTGGCGGCAGGTTGGTG-3，。2. PCR 扩增将含有cry2a基因的pCAMBIA 1300载体的质粒DNA作为模板，进行PCR扩增，PCR 扩增结果参见图2。
含PCR产物的胶块，用DNA凝胶回收试剂盒回收。在无菌Eppendorf管中加入4 μ L回收PCR产物，1 μ L pMD18_T载体，5 μ L Solution〗，总体积为10 μ L。将各组分混勻，16°C连接过夜，得到DNA连接产物。4. E. coli DH5 α感受态细胞的制备挑取大肠杆菌DH5 α (Ε. coli DH5 α )单菌落到含有50mL LB培养基的三角瓶中， 于37°C振荡培养过夜；取培养过夜的菌液10 μ L到含有50mL LB培养基的三角瓶中，37°C振 荡培养到0D600值为0. 4-0. 6 ；将培养好的的菌液转移到50mL的离心管中，冰浴IOmin ；在 40C，5000rpm条件下离心5min，去上清，收集细胞；用20mL冰预冷的0. IM CaCl2轻轻悬浮 沉淀，在冰上放置IOmin ；在4°C，5000rpm条件下离心lOmin，用2mL 0. IM CaCl2悬浮沉淀， 按每管200 μ L分装细胞悬浮液于无菌的Eppenforf管中，用液氮快速冷冻，储存于_70°C。5.连接产物转化Ε. coli DH5a感受态细胞及鉴定在100 μ L大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5 α中加入10 μ L DNA连接产物，手指轻
5
PCR扩增体系如下 10XPCR Buffer5μ L
dNTP(IOmM)4μ L
模板 DNA(100ng/y L) IyL 正向引物(10 μ Μ)IuL
正向引物(10 μ Μ)IuL
Ex-Taq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ L ddH2037. 5 μ L
总体积50 μ L
PCR反应程序如下 94 °C5min
94 °C 60 °C
30 Cycles
72 °C
72 °CIOmin
3. PCR产物的回收及连接反应
用1 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳结束，将凝胶置于紫外分析仪内，切取弹管壁，混勻混合物，置于冰上30min ；42°C水浴热激处理90sec，迅速放回冰上，冰浴5min ； 加入800 μ L LB培养液，混勻，37°C，150rmp振荡培养Ih ；4000rpm离心2min后弃去多余 LB培养液，剩余200 μ L LB将感受态细胞轻轻悬浮加入20 μ L的IPTG (24mg/mL)，40 μ L的 X-gal (20mg/mL)，涂布在含有100 μ g/mL Amp的固体琼脂培养基上，用玻璃棒涂抹均勻，待 充分吸收后37°C倒置孵育12-16小时。以α _互补现象进行重组子的筛选，挑取平板上生长的白色菌落进行PCR鉴定，鉴 定结果参见图3。其中，PCR反应体系和反应程序同步骤2PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳 检查扩增产物。接种经PCR鉴定为阳性的菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C，240rpm 振荡培养过夜。用DNA提取试剂盒提取质粒PMD18-T-cry2a。6.表达质粒的重组构建待测序结果正确后，用BamH I/EcoR I内切酶双酶切质粒PMD18_T-Cry2a，酶切结 果参见图4。酶切反应参照限制性内切酶说明书(宝生物工程(大连)有限责任公司)中的 具体操作进行。反应结束，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收操作与步骤3中PCR产 物回收相同。回收的cry2a基因片段与双酶切后(BamH I/EcoR I)的表达载体pET_30a(+) 连接，连接体系参照连接酶试剂盒说明书(宝生物工程(大连)有限责任公司DNA Ligation Kit Ver. 2. 0)中的具体操作进行，获得重组表达质粒pET_30a(+)-cry2a后转化到E. coli Transetta (DE3)感受态细胞中，经过双酶切和PCR鉴定正确后，进行序列分析鉴定，读框正 确后得到重组菌，然后开始表达。7.重组菌的诱导表达将重组菌落接种于5mL LB培养基(含卡那青霉素50 μ g/mL和氯霉素34 μ g/mL) 中，37°C摇床培养至对数生长前期(0D值约为0.6)，加入0.6mmol/L IPTG诱导5h。取适量 菌液离心集菌后进行SDS-PAGE分析表达情况。取培养好的菌液lmL，以IOOOOrpm室温离心 3分钟集菌，弃上清，200 μ L纯水悬起沉淀，取20 μ L悬浮液加入20 μ L 2 X SDS凝胶加样缓 冲液，煮沸十分钟，取20 μ L进行SDS-PAGE分析。电压80V，20min ； 120V，80min，进行染色、 脱色。对凝胶染色30分钟后，脱色Ih后进行分析。 8.表达蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化将重组菌落接种于5mL LB培养基(含卡那青霉素50 μ g/mL和氯霉素34 μ g/mL) 中，37°C摇床培养过夜后按重组菌LB培养基=1 100接种于大三角瓶中至对数生长前 期(0D值约为0. 6)，加入0. 6mmol/L IPTG诱导5h。收集菌体后加入超声Buffer, IOOmL培 养基所的菌体加20mL超声Buffer。将菌悬起后，超声破碎(超声破碎30次，超声10s，间 隔20s)。4°C，12000rpm, 20min,充分离心，上清与沉淀用SDS-PAGE分析确定蛋白位置，结果 大部分位于沉淀中，以包涵体形式表达。沉淀用5mL裂解缓冲液于4°C慢慢搅拌溶解。4 12000rpm，离心20min，倒出上清于4°C用于纯化，纯化结果参见图5。具体纯化过程如下①向ImL 50% Ni-NTA His Bind Slurry 中加入4mL Bind Buffer 轻轻混勻，通过 重力作用自然沉降，移弃悬浮液。②将菌体超声破碎后收集的上清与Ni-NTA在4°C振摇2h，装柱后收集穿透液，做 SDS-PAGE 分析。③用4X4mL Wash Buffer洗杂，装入洗杂液后先用橡皮帽堵住出口处静置半小时后，移除橡皮帽，流速控制在30mL/h分别收集流出液，做SDS-PAGE分析。④用4X0. 5mL Elute Buffer洗脱，分别用4个印pendorf管收集洗脱液，流速控 制在15mL/h，做SDS-PAGE分析，结果显示目的蛋白在此条件下被洗脱下来。纯化出来的目的蛋白纯度达到90 %以上。9.重组蛋白cry2a的复性和浓缩重组包涵体蛋白纯化完，并经SDS-PAGE分析含量和纯度后，选择含量高而且纯 度达到要求的重组蛋白用复性液透析复性。采用复性透析母液中脲含量递减的方式逐渐 除去变性剂，每个阶段都置于4°C透析2-4h。用Millipore浓缩管浓缩，4000rpm，4°C离心 30min-60min，浓缩后取一定量蛋白用Bradford法测定蛋白含量，其余装于Eppendorf管 中-70°C保存。附说明1.蛋白纯化所用到的Buffer如下超声Buffer :20mM Tris_HCl、0. 3M NaCl、10% Glycerol、ρΗ8· 0。裂解缓冲液(Buffer):50mM Tris_HCl、0. IM NaCl,5% Glycerol,8M urea、pH8. 0。Bind Buffer :20mM Tris_HCl、0. 3M NaClUO % GlycerolUOmM Imidazonle、 pH8. 0。Wash Buffer :20mM Tris-HCl、0· 3M NaClUO % Glycerol、8M urea、 20mMImidazonle、pH8. 0。Elute Buffer :20mM Tr i s_HCl、0. 3M NaCUlO % Glycerol、8M urea、 500mMImidazonle> pH8. 0。复性透析母液20mMTris_HCl、0. 3M NaCl、6M，4M，2M and OM urea、pH8. 0。2.亲和层析柱的制备①轻轻颠倒混勻固化M2+树脂取5mL装入层析柱，树脂自然沉降。②用3倍体积的去离子水冲洗树脂(树脂沉降后为一个柱体积)。③用3倍柱体积的Bind Buffer平衡树脂，静置。3.亲和层析柱的彻底再生从层析柱下端流干所有液体，用2倍NTA树脂体积的再生缓冲液(6M盐酸胍或 0. 2M的乙酸)2倍柱体积的去离子水3倍柱体积的2 % SDS1倍柱体积的25 %乙醇1倍柱体积的50 %乙醇1倍柱体积的75 %乙醇5倍柱体积的100 %乙醇1倍柱体积的75%乙醇1倍柱体积的50 %乙醇1倍柱体积的25 %乙醇1倍柱体积的去离子水1 倍柱体积的 0. IM EDTA(PH 8. 0)
1倍柱体积的去离子水1 倍柱体积的 0. IM NiSO43倍柱体积的去离子水20%的乙醇洗1倍柱体积的体积之后，加1倍柱体积的20%的乙醇4°C保存。4. SDS-PAGE 分析用溶液①2XSDS凝胶加样缓冲液(贮存液)4XTris-HCI(pH6. 8)25mL，甘油 20mL，SDS 4g，溴酚蓝(0. 001 % W/v) 2_3mL 去离子 水定容至lOOmL，应用时取95yL加入5yL β-巯基乙醇。②5XTris_甘氨酸电泳缓冲液12. Ig Tris，94g Gly，5g SDS，加蒸馏水定容至1L，应用时用蒸馏水稀释5倍。③SDS-PAGE 凝胶染色液(IOOmL)甲醇水(1 l)90mL,乙酸 IOmL ；考马斯亮蓝 R2500. 25g。④SDS-PAGE凝胶快速脱色液(IOOmL)甲醇30mL，乙酸IOmL ；蒸馏水60mL ；用Whatmanl号滤纸过滤以除去颗粒状物质，
室温保存。5. SDS聚丙烯酰胺凝胶配制表1两块15%聚丙烯酰胺凝胶(15mL)
权利要求
1.一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达方法，包括以下步骤1)根据华中农业大学测序好的cry2a的基因，以及所要连接的载体PMD18-T的多克隆 位点设计正、反向引物，进行PCR扩增和回收，并对PCR回收物进行DNA连接反应；2)大肠杆菌感受态细胞的制备和转化；3)表达质粒的重组构建、重组菌的诱导表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正、反向引物序列如SEQID Nol和 SEQ ID No 2所示，具体如下正向引物5，-CGGGATCC(BamHI)ATGAACAACGTGCTGAACAGCGGCAG-3，； 反向引物5’ -CGGAATTC(EcoRI)TTAGTAGAGTGGCGGCAGGTTGGTG-3，。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为E.coliDH5 α 禾口 Ε·coil Transetta(DE3)ο
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过Ni-NTA亲和层析进行表达蛋白的进 一步纯化。
5.如权利要求1所述的方法制备的转基因水稻Bt蛋白cryh在胶体金免疫层析试纸 条中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种转基因水稻Bt蛋白cry2a的原核表达及纯化方法，包括以下步骤1)根据华中农业大学测序好的cry2a的基因，以及所要连接的载体PMD18-T的多克隆位点设计正、反向引物，进行PCR扩增和回收，并对PCR回收物进行DNA连接反应；2)大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备和转化；3)表达质粒的重组构建、重组菌的诱导表达；4)表达蛋白Ni-NTA亲和层析纯化。采用本发明方法得到的目的蛋白纯度达到90％以上，同时利用本发明制备的高纯度转基因水稻Bt蛋白cry2a可获得抗体，并可制作成胶体金免疫层析试纸条，以便在转基因植物检测中快速、准确的检测出Bt基因。
文档编号C12N1/21GK102094039SQ20101057864
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者刘启文, 吴潇, 唐雪明, 朱宏, 杨奇, 王金斌, 程凯, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如, 魏曼曼 申请人:上海市农业科学院