抑制核糖体蛋白的胞内表达的小干扰rna的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及可结合到细胞中的核糖体蛋白的特定位点以特异地抑制核糖体蛋白 表达的siRNA(小干扰RNA)。
【背景技术】
[0002] 蛋白质参与从细胞信号转导到组织重塑乃至器官功能的所有生理过程。因此，细 胞中的蛋白质的合成是非常重要的过程，并且核糖体执行此功能。核糖体是连接氨基酸以 形成蛋白质的细胞器，并且是由核糖体蛋白和核糖体RNA所组成的大亚基。
[0003] rpS3(核糖体蛋白S3)是核糖体的一个组件，位于40S亚基的外表面并且与起始因 子eIF2和eIF3交联。因为rpS3在N-末端区域具有核定位信号，据信rpS3的翻译功能是 在细胞质中操作，并且修复功能是在细胞核中操作。除了其在核糖体功能中的作用，许多核 糖体蛋白在复制、转录、RNA加工、DNA修复和恶性转化中具有次要作用。
[0004] rpS3基因位于人类染色体llql3. 3_ql3. 5。具体地，报道称rpS3基因在结肠直肠 癌患者中过表达。因此，rpS3基因产物在结肠直肠癌中过表达，并且非常可能与其它癌症 相关联。此外，对区域llql3. 3_ql3. 5的研究表明，常常会发生该基因的结构异常和扩增， 并且该基因在人类癌症发展时过表达，所述癌症例如多发性内分泌肿瘤I型、乳腺癌或B细 胞瘤（Pogue-Geileetal.，Mol.Cell.Biol. ,11:3842-3849, 1991)。
[0005] 如本文所用，术语"siRNA(小干扰RNA) "是指约10个核苷酸至几十个核苷酸组 成的、诱导RNAi(RNA干扰）的短双链RNA。RNA干扰（"RNAi"）是在许多真核生物中都 保守的基因表达的转录后抑制方法，并且是指双链RNA被引入到细胞等中使得它能选择性 地诱导靶基因的mRNA的降解或者能抑制靶基因表达的现象，所述双链RNA由具有与靶基 因同源的序列的有义RNA和具有与该有义RNA互补的序列的反义RNA组成。RNAi是由存 在于细胞中的短（即，少于30个核苷酸）的双链RNA( "dsRNA"）分子所诱导（FireA.et al.，Nature, 391:806-811，1998)。因为如上所述RNAi能够选择性地抑制靶基因的表达，它 作为简单的基因敲除方法来替代基于低效同源重组的常规基因破坏方法吸引了相当大的 注意。当siRNA被引入到细胞中时，具有与siRNA的核苷酸序列互补的靶基因的mRNA表达 将被抑制。
[0006] siRNA与靶mRNA结合到RNA诱导的沉默复合物（"RISC")，其裂解靶mRNA。siRNA 显然是再循环的，其很像多周转酶，1个siRNA分子能够诱导约1000个mRNA分子裂解。因 此，mRNA的siRNA介导的RNAi降解比目前可用于抑制靶基因表达的技术更有效。
[0007] 然而，与最初期望的RNAi技术能够适用于所有基因的RNA以选择性抑制所述RNA 的表达不同，最近已发现因为一些基因在高通量的RNAi筛选程序中是未知的，因此不能应 用RNAi技术（Kruegeretal.，Oligonucleotides, 17:237-250, 2007)。此外，在过去的几年 里，已经开发出通过基于数据库的统计分析来预测siRNA序列的算法。然而，已知的是，因 为计算算法不完善，并不是使用所述算法通过在计算机上的模拟方法（insilicomethod) 确定的所有siRNA都能有效地抑制细胞中以及体内的靶mRNA，并且最有效的siRNA只能通 过实验验证来确定（Dereketal.，Annu.Rev.Biomed.Eng.，8:377-402, 2006)〇
[0008] 如上所述，理论上预测的siRNA不能有效抑制mRNA的能力，并且为实现治疗目的 应发现高效的siRNA核苷酸序列。由于这个原因，非常重要的是找到对靶mRNA具有高抑制 作用的特定的极度活跃的靶标。此外，需要通过基于每个基因的mRNA选择若干靶标位点来 制备siRNA，并且至少在细胞水平上直接检查该siRNA的作用，识别具有优异的表达抑制效 果的最佳序列。
[0009] 因此，本发明人进行了广泛的努力来开发用于抑制核糖体蛋白S3(rpS3)表达的 siRNA，并且结果是，构建了结合到rpS3的特定靶标位点的rpS3siRNA，并发现所构建的 siRNA相对于商购的产品具有优异的抑制内源rpS3蛋白表达的效果，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是提供一种特异性抑制rpS3表达的siRNA。
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供了用于抑制rpS3蛋白表达的siRNA，所述siRNA结 合至对应于具有SEQIDN0 :1的核苷酸序列的rpS3mRNA的位置777至795或796至914 的核苷酸序列。
【附图说明】
[0012] 图1示出分析被引入到细胞中的rpS3siRNA的效率的结果（泳道1 :打乱的siRNA， 泳道 2 :RPS3-203,泳道 3 :RPS3-635,泳道 4 :RPS3-777,和泳道 5 :RPS3-796)。
[0013] 图2示出比较rpS3siRNA的效率的结果（泳道1 :对照，泳道2 :RPS3-777,泳道3 : B公司，和泳道4:S公司）。
[0014] 图3示出鉴定不被siRNA影响的表达rpS3的稳定细胞的结果（泳道1 :打乱的 siRNA，泳道 2 :RPS3-203,泳道 3 :RPS3-635,泳道 4 :RPS3-777,泳道 5 :RPS3-796)。
【具体实施方式】
[0015] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普 通技术人员的通常理解具有相同的含义。大体上，将在下面描述的本文中使用的命名法和 实验方法是本领域公知的且通常采用的。
[0016] 本发明人已经构建了具有优异的特异性抑制内源rpS3蛋白在细胞中的表达效果 而不会影响过表达蛋白的siRNA。
[0017] 在本发明中，为了确认所构建的rpS3siRNA在被引入细胞内后是否有效地操作， 将作为对照的扰乱的siRNA，由本发明人以前构建的靶向rpS3蛋白质的siRPS-203中每种， 以及本发明构建的siRPS3-777和796每种，引入到各种动物细胞中，并通过Western印迹 测量rpS3蛋白在细胞中的水平。结果发现，用作对照的扰乱的siRNA在细胞中的rpS3蛋 白质水平没有显示出变化，而新构建的本发明的777和796siRNAs大大抑制rpS3蛋白的表 达水平，并且相比在现有技术中已使用的203和635siRNA，也显著抑制蛋白的表达水平（图 1)〇
[0018] 换句话说，在本发明的例子中，可以看出，siRPS3-777和796特异地抑制rpS3蛋 白的表达水平。
[0019] 因此，在一个方面，本发明涉及通过结合到选自下组的靶核苷酸序列，抑制rpS3 蛋白表达的siRNA(SEQIDN0:2和3)，所述组对应于具有SEQIDN0:1的核苷酸序列的 rpS3mRNA的位置777到795和796到914的核苷酸序列。
[0020] 根据本发明的siRNA可以具有15-21个核苷酸的长度。
[0021] 如本文所用，术语"siRNA"是指可诱导靶mRNA的降解或通过切割靶mRNA抑制靶 基因表达的短双链RNA。
[0022] 根据本发明的结合到对应于rpS3mRNA的位置777到795的核苷酸序列和对应于 rpS3mRNA和位置796到914的核苷酸序列的siRNA分别由SEQIDN0 :2和3表示。
[0023] 本发明的siRNA不限于完全配对，并且可以含有由于错配（对应的核苷酸不互补） 而产生的非配对部分，凸起部分（在一条链上缺乏对应的互补核苷酸）等。本发明的siRNA 可以是能干扰rpS3的活性和表达的、包括10-40个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选 19-21个核苷酸的双链RNA。
[0024] 如本文所用，术语"siRNA的长度"指的是形成双链（配对）的核苷酸的数目。本 发明的siRNA的末端结构可以是平末端或粘性末端，只要该siRNA可以由于其RNAi效应而 使靶基因的表达沉默、减少或抑制。
[0025] 粘性末端结构可以是3' -末端突出结构和5'末端突出结构。突出核苷酸的数量 没有特别的限制，但可以是，例如1-8个核苷酸，优选1-4个核苷酸。此外，在siRNA-端的 突出部分可包括dTdT、UU或双链形成部分继续可包括与rpS3mRNA-致或互补的序列。此 外，siRNA不一定在两末端都具有切断结构，并且可以具有这样的茎环结构，即在双链RNA 每一侧的末端通过接头RNA连接。此外，接头的长度没有特别的限制，只要它的长度不妨碍 茎部的配对。
[0026] 为了防止核酸酶造成的体内迅速降解并增强体内稳定性，本发明的siRNA可以通 过本领域已知的普通方法进行化学修饰。例如，siRNA的至少一个核苷酸的糖（核糖环）的 2'位置的羟基可以被氢、卤素、-0-烷基、-0-酰基或氨基取代，具体地被H、OR、R、R'OR、SH、 SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br、I等取代，其中R可以是烷基或芳基，优选具有1至6个 碳原子的烷基，并且R'可以被亚烷基，优选具有1-6个碳原子的亚烷基。可替代地，构成核 苷酸的磷酸骨架可以被例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或胺基磷酸酯修饰。
[0027] 在化学修饰中，在本发明siRNA的至少一个核苷酸可以被取代，这样它会呈 现为LNA(锁核酸）、UNA(解锁核酸）、吗啉基和PNA(肽核酸）中的任何一种核酸类 似物。LNA、UNA、PNA、吗啉基等的制备可以根据本领域中已知的知识基于本发明提 供的siRNA序列信息来进行，并且可以参照以往的文献（VeeduRN，WengelJ.，Chem Biodivers, 7(3) :536-42, 2010；DemidovVV.,TrendsBiotechno1,21 (1):4-7, 2003 ； ShantanuKarkareetal. ,ApplMicrobiolBiotechnol, 71:575-586, 2006)进行。
[0028] 在siRNA的化学修饰的例子中，siRNA有义或反义链的磷酸二酯键可以被硼烷磷 酸酯（boranophosphate)或硫代磷酸酯取代，以增加siRNA的核酸酶抗性。例如，取代可以 被引入到siRNA有义或反义链的3'末端或5'末端或这两端，优选RNA末端，例如，3'末端 突出（例如，（dT)n，n= 1至5的整数，优选2至4)。
[0029] 作为另一例子，可以将ENA(乙烯桥核酸）或LNA(锁核酸）引入到siRNA有义或 反义链的5'末端或3'末端或这两端。优选地，可以引入到siRNA有义链的5'末端。在这 种情况下，siRNA稳定性会增加而不影响RNAi活