一种分离、富集及检测环境水样和水产品中痕量氯霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分离、富集及检测环境水样和水产品中痕量氯霉素（CAP)的新方 法，特指以基于双水相萃取法（Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE)，利用聚氧乙稀月桂 醚（polyoxyethylene(10)laurylether(P0ELE10,C32H66O11))萃取体系，分离、富集及检测 环境水样和水产品中痕量氯霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 氯霉素是由DavidGottlieb从委内瑞拉链丝菌中分离出来的一种广谱抗菌剂，因 其对多种致病菌具有敏感性且可人工合成，曾被广泛应用于临床医学。由于可以通过对细 菌核糖核蛋白体50S亚基的作用阻止蛋白质的合成，CAP对各种敏感菌导致的感染疗效显 著。但与此同时，CAP还可以与人体线粒体的70S相结合，从而抑制人体线粒体的蛋白合成， 对人体产生毒性作用。由于CAP对人体的造血系统有严重的不良反应，现已限制其在临床 上的应用，除非无其他药物可替代时方可考虑使用。尽管各国都已经意识到CAP对人类健 康的严重威胁，并已严令禁止在动物性食品生产过程中使用CAP，但因其对部分传染性疾病 具有很好的疗效且价格低廉、抗菌效果稳定，CAP在养殖业仍被大量使用。因此，为了禁止 并杜绝CAP在养殖业的滥用，建立一种快速、简单、高效的CAP预处理技术和分析检测方法 至关重要。传统的分离/富集预处理方法普通存在有机溶剂使用量大、处理时间长、二次污 染环境等缺点。因而，迫切需要建立一种适用于环境和食物中痕量或超痕量抗生素残留检 测的新型绿色预处理分离/富集技术。
[0003] 近年来，ATPE技术作为绿色、简捷、高效的预处理手段，越来越受到研究者的关注。 ATPE技术由于萃取率高、操作条件温和以及对环境无二次污染等优点，被广泛应用于金属 离子、药物以及生物活性物质的分离、纯化。聚氧乙稀月桂醚（P0ELE10)是一种能够与盐在 一定条件下形成ATPS的聚合物，通过对一系列P0ELE10-无机盐/有机盐ATPS双节线数据 和液-液相平衡数据的讨论，发现P0ELE10-盐ATPS体系具有相比理想、富集倍数较高等优 点，适于环境和食品中痕量或超痕量抗生素的分离/富集预处理操作。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种分离、富集及检测环境水样和水产品中痕量氯霉素的 方法，该方法建立了一种全新的样品前处理体系一P0ELE10-盐双水相萃取体系。该方法 将P0ELE10引入双水相体系，由于该物质具有分相迅速、用量少、绿色无染等优点，因此， POELElO-NaH2PO4分离/富集体系具有高富集倍数、高选择性、无有机溶剂、适合大剂量样 品分离/富集等特点。与现有的萃取体系相比，该方法具有更高的富集倍数和回收率。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明方法选择具有良好的相分离能力和良好的生物相容性的聚氧乙烯月桂醚 作成相物质，选择盐析能力强的磷酸二氢钠作为分相盐，采用P0ELE10-盐双水相萃取体系 分离、富集被检测样品中氯霉素（CAP)，即以P0ELE10和无机盐（NaH2PO4)为高聚物和盐析 剂构成双水相萃取体系，对氯霉素进行分离、富集的方法，具体步骤如下：
[0007] (1)在磨口离心管中，加入ImL被检测样品，然后加入P0ELE10和NaH2PO4,并调节 体系的PH为3. 8,最终溶液总体积为10mL，P0ELE10和NaH2PO4的浓度分别为0. 033g?mL1 和0. 186g?mL\充分振荡使其溶解得混合溶液A;
[0008] (2)将上述步骤（1)中带有混合溶液A的离心管放入离心机中离心处理20分钟 后，将其取出放入25°C的水浴锅中恒温静置分相；
[0009] (3)待步骤（2)中离心管中的溶液清晰的分成上下两相后，用针管小心的吸取上 相；
[0010] (4)利用高效液相色谱仪HPLC在波长276nm对步骤（3)中吸取的上相中的氯霉素 进行分析测定；
[0011] 本发明的优点和效果是：
[0012] (1)本发明所采用的双水相萃取与高效液相色谱联用技术在对环境水样和水产品 中的痕量氯霉素残留进行分离、富集和检测过程中，不使用有毒有机溶剂，具有绿色无污染 的优点，不会对环境造成二次污染。
[0013] (2)本发明所采用的POELElO-NaH2PO4I水相萃取技术，与已有的其它双水相体系 相比，具有相比理想、富集倍数高等优势，能够满足环境水样和水产品中痕量氯霉素残留的 预处理要求。
[0014] (3)本发明所采用的POELElO-NaH2PO4双水相萃取技术，成相物质用量少，检测成 本低，易于操作。
【附图说明】
[0015] 图1本发明方法中成相盐对CAP分离/富集的影响示意图（图1成相盐的选择）。
[0016] 图2本发明方法中NaH2PO4浓度对CAP分离/富集影响的曲线图。
[0017] 图3本发明方法中P0ELE10浓度对CAP分离/富集影响的曲线图。
[0018] 图4本发明方法中温度对CAP分离/富集影响的曲线图。
[0019] 图5本发明方法中体系PH值对CAP分离/富集影响的曲线图。
[0020] 图6本发明方法中各实验因子对萃取效率的响应曲面图。
[0021] 图7本发明方法中各实验因子对富集倍数的响应曲面图。
[0022] 图8本发明方法中萃取实际样品加标量为IOng?mL1CAP的高效液相色谱图。
【具体实施方式】 [0023]
[0024] 1)成相盐的选择
[0025] 选择一种合适的成相盐是双水相萃取的一个重要因素。P0ELE10-盐双水相萃取 是将P0ELE10和盐溶液以及目标物（CAP)混合在一起，由于盐析作用，该体系将分成两相， 目标物（CAP)被选择富集到富含P0ELE10的上相。由于选择的盐析剂不同，体系的分相 及富集能力亦不相同，因此，实验讨论了CAP在不同的P0ELE10-盐（Na3C6H507、Na2C4H406、 (NH4) 2HP04、ZnS04、（NH4) 2S04、Na2W04、NaH2PO4)ATPS中的分配行为，并将所研究各体系对CAP 的萃取效率和富集倍数绘于图1中。从图中可以看出，POELElO-NaH2PO4ATPS对CAP的萃取 效率和富集倍数均明显高于其他体系，因此，选取NaH2PO4作为成相盐构建ATPS对CAP进行 萃取分离富集。
[0026] 2)NaH2PO4浓度对CAP分离/富集的影响
[0027] 实验讨论了对于POELEIO-NaH2PO4ATPS在相同温度下，NaH2PO4的浓度对CAP在 两相间分配的影响，并将其萃取效率和富集倍数随浓度的变化趋势绘于图2中。从图2中 可以看出，总体上，萃取效率和富集倍数均随NaH2PO4的浓度增加而增大，这是因为体系中 NaH2PO4的增加，会增强体系的盐析能力，促进P0ELE10带动CAP从盐相中析出，向上相转移； 当NaH2PO4的浓度达到0. 198g^mL1后，再继续增加NaH2PO4，萃取效率和富集倍数均未有显 著增加，这可能是由于NaH2PO4的水合作用已经达到最大值，无法再通过增加NaH2PO4提高 CAP的萃取率。由于当NaH2PO4的浓度低于0. 174g^mL1时，萃取效率和富集倍数均太低；而 NaH2PO4的浓度高于0. 198g?mL1时，萃取效率和富集倍数未有显著变化，因此选择NaH2PO4 的浓度范围在0. 174~0. 198g?mL1之间作为后续多因素实验的因素水平范围。
[0028] 3)P0ELE10浓度对CAP分离/富集的影响
[0029] 实验讨论了当体系中NaH2PO4的浓度、温度和pH值不变时，P0ELE10的浓度对CAP 萃取效率和富集倍数的影响，结果见图3。从图中可以看出，随着P0ELE10浓度的增加，萃取 效率增加而富集倍数减少，这是因为，随着P0ELE10的增加，CAP更易进入上相，从而使萃取 效率明显增加；但是在P0ELE10增加的同时，上相的体积也在增加，从而使得CAP在上相的 浓度减少，进而导致富集倍数降低。为了兼顾萃取效率和富集倍数两个参数的最优化，取 P0ELE10的浓度范围为0. 021~0. 033g?mL1作为RSM设计的因素水平范围。
[0030] 4)温度对CAP分离/富集的影响
[0031] 温度是除成相物质的种类和浓度以外的另一个能够对ATPS成相产生重要影响的 因素。因此，实验讨论了当POELElO-NaH2PO4ATPS中两种成相物质的浓度和体系pH值不变， CAP的萃取效率和富集倍数随温度的变化，结果见图4所示。可以看出，随着温度的升高，萃 取效率和富集倍数增大，这是因为，温度升高，P0ELE10的疏水性增强，导致P0ELE10更易从 盐溶液中析出，从而带动更多的CAP进入上相。为了保护CAP中的活性成分，将多因素实验 中的萃取温度定于15~35°C范围内。
[0032] 5)体系PH值对CAP分离/富集的影响
[0033] 实验讨论了当POELElO-NaH2PO4ATPS中两种成相物质的浓度和体系温度均固定， 体系的PH值对CAP的萃取效率和富集倍数的影响，结果见图5所示。当体系的pH值低于 3. 0时，不能形成两相体系，这是因为此时体系的盐析能力太弱，不足以将P0ELE10排出形 成ATPS;当pH值大于3.0,低于4. 5时，萃取效率和富集倍数随pH值的增加而增大；当pH 值大于4. 5时，萃取效率和富集倍数基本不再改变。因此，设计RSM实验时，pH值范围定为 3. 0 ~4. 6〇
[0034] 6)利用响应曲面法进行多因素实验分析
[0035] 以单因素实验为基础，采用统计分析软件DeSign-EXpert8. 0设计RSM实验。RSM 实验设计包括因子设计和回归分析。使