用中心复合设计（CentralCompositeDesign,CCD) 法建立4因素5水平的实验模型：以NaH2PO4的浓度（X1)、P0ELE10的浓度（X2)、体系pH值 (X3)和体系温度（X4)为自变量，以CAP的萃取效率（E% )和富集倍数（F)为响应值设计实 验，各因素及其水平的实验设计方案见表1。
[0036] 表IRSM的实验影响因子及其水平设计方案
[0037] TablelDesignoffactorsandtheirlevelsofCCDforRSM.
[0038]
[0039] 根据前期的单因素分析结果，采用RSM的C⑶方法设计多因素实验，4因 素5水平的详细实验方案及实验结果列于表2中，每组试验重复三次取平均值。通过 Design-Expert8. 0软件对实验数据进行RSM分析，分析结果列表3和4中，经二次回归拟 合后得到各实验因子与响应值之间的关系可用下列函数表示（公式1~2) :
[0042] 表3中的模型方差分析表明，萃取效率二次多项式模型极显著 ((卩〈0.0001)〈0.05)，失拟项（？ = 0.1452>0.05)不显著，即该实验方法是有效的。另外，方 程复相关系数的平方R2 = 〇. 9548说明该模型具有较好的回归性。影响萃取效率响应值的 显著性项分别为A、B、C、D、AC、AD、A2、C2,说明各实验因子与萃取效率响应值不是简单的线 性关系，二次项和交叉项对响应值也有一定的影响，其中实验因子A和C对响应值的影响极 显著（P〈0. 0001))。在NaH2PO4的浓度、P0ELE10的浓度、pH值和温度四个实验因素中，对萃 取效率影响显著性依次为：NaH2PO4的浓度（A，P〈0. 0001)~温度（D，P〈0. 0001) >pH值（C， P= 0? 0002) >P0ELE10 的浓度（B，P= 0? 0362)。
[0043] 表2CXD实验设计及实验结果
[0044]Table2TheextractionefficiencyandenrichmentfactorofCAPforeach experimentoftheCCD.
[0045]
[0047] 表3萃取效率模型的方差分析结果
[0048]Table3Resultsoftheanalysisofvariance(ANOVA)performedtothe extractionefficiencymodels
[0049]
[0050] 表4中的模型方差分析表明，富集倍数二次多项式模型显著（(P= 0.0005)〈0.05)，失拟项（(P= 0.1107) >0.05)不显著，证明该实验方法是有效的。此外， 方程复相关系数的平方R2 = 〇. 9772说明该模型的回归性较好，失拟度小。模型中对富集 倍数响应值的影响达到显著水平的有A、B、C、D、BC和D2,从这些显著性项可以得出，各实 验因子对富集倍数响应值的影响不是简单的线性关系，只有采用响应曲面法才能较好地描 述响应值与各实验因子之间的关系。在NaH2PO4的浓度、P0ELE10的浓度、pH值和温度四个 实验因素中，对富集倍数影响显著性依次为：温度（D，P= 0. 0002)>NaH2P04的浓度（A，P= 0? 0016) >P0ELE10 的浓度（B，P= 0? 0024)>pH值（C，P= 0? 0077)。
[0051] 表4富集倍数模型的方差分析结果
[0052] Table4Resultsoftheanalysisofvariance(ANOVA)performedtothe enrichmentfactormodels
[0053]
[0054] 根据回归方程可以做出各实验因子的响应分析图，从而直观地反映各因子对响应 值的影响以及各因子之间的相互作用关系。将NaH2PO4的浓度、P0ELE10的浓度、pH值和温 度四个因素中的任意两个因素固定在零水平，即可得到另外两个因素对响应值的影响子模 型，从而绘制其响应曲面图。图6和7为各实验因子对萃取效率和富集倍数的响应曲面图。 响应曲面法中，响应面的坡度表示该处理条件对响应值的影响程度，坡度越陡峭，影响越 大。从图6可以看出，NaH2PO4的浓度、POELE10的浓度、pH值和温度四个因素对萃取效率都 有一定的影响，其中NaH2PO4的浓度和温度对萃取效率的影响更为显著，表现为曲线比较陡 峭；P0ELE10的浓度和pH值的影响相对较小。观察图7可以发现，NaH2PO4的浓度、P0ELE10 的浓度、PH值和温度四个因素对富集倍数都有一定的影响，而且温度的影响比较显著。上 述结果与回归分析的结果相一致。
[0055] 通过分析表2、图6和图7可以得出最优实验条件：NaH2PO4的浓度为0. 186g^mL\ P0ELE10的浓度为0. 033g?mL\pH值为3. 8和温度为25°C，体系对CAP的萃取效率可达 99. 42% ;同样，当NaH2PO4 的浓度为 0? 192g?mL\P0ELE10 的浓度为 0? 024g?mL\pH值为 4. 2和温度为30°C时，CAP的富集倍数可以达到22. 56。
[0056] 7)方法确认
[0057] 最佳条件下，在POELElO-NaH2PO4ATPS中加入五种不同浓度（0~1000 ng .mL 3的 CAP标准溶液，分相后，利用HPLC-UV测定CAP的峰面积，进而绘制标准曲线（三组平行试 验）。标准曲线的线性方程和相关系数为：
[0058]Area= 0. 375Xc- 0. 872(r= 0. 9997) (3)
[0059] 其中Area代表峰面积，c代表CAP的浓度。方法精密度的计算：对20ng?mL1的 CAP标准溶液一天内重复5次萃取实验，连续5天重复实验，分析计算得到日内精密度误差 小于4%，日间精密度误差小于6. 7%。关于日间误差的要求，欧盟组织标准2002/657/EC 的规定是低于23 %，所以该测试方法是有效的。利用空白溶液测定基线噪音，分析计算该方 法对CAP的检出限（LimitofDetection，L0D)和检量限（LimitofQuantification，LOQ) 分别为0? 2ug*kg1和0? 7ug*kg\低于分子印迹固相分散-高效液相色谱法和分散液-液 微萃取-高效液相色谱-可变波长检测器法报道的LOD和LQD。国际欧盟组织规定CAP在 食品中的最高含量为〇. 3ng \该体系方法可以满足标准规定的CAP最高含量检测要求， 因此，所提出的方法作为一种绿色检测手段，能够用于食品和环境中的痕量CAP残留检测。
[0060] 8)实际样品分析
[0061] 利用本文建立的POELElO-NaH2PO4ATPS萃取分离-HPLC-UV检测技术在最优条件 下（NaH2PO4的浓度为0? 186g?mL\P0ELE10的浓度为0? 033g?mL'pH值为3. 8和温度为 25°C)对环境水样和水产品（鱼、虾）中的CAP残留进行了分离和测定。对于未加标CAP的 环境水样和水产品，未在检测线范围内检出CAP残留。加标CAP标准溶液（10~IOOng^mL4 的实际样品的回收率（E% )和标准偏差（RSD)见表5,平行实验次数为5。从表中可以看 出，实际样品的E%为96. 80~100. 20%，RSD小于3%，可以证明本方法用于环境水样和水 产品中CAP残留的定量分析检测可行且效果理想。利用HPLC-UV测定实际样品中CAP的高 效液相谱图如图8所示。
[0062] 表5实际样品加标CAP的回收率（n= 5)
[0063] Table5Therecovery(n= 5)ofCAPinrealsamples.
[0064]
【主权项】
1. 一种分离、富集及检测环境水样和水产品中痕量氯霉素的方法，其特征在于：该方 法方法选择具有良好的相分离能力和良好的生物相容性的聚氧乙烯月桂醚作成相物质，选 择盐析能力强的磷酸二氢钠作为分相盐，采用P0ELE10-盐双水相萃取体系分离、富集被检 测样品中氯霉素CAP，即以P0ELE10和无机盐NaH2PO4为高聚物和盐析剂构成双水相萃取体 系，对氯霉素进行分离、富集的方法，具体步骤如下： (1) 在磨口离心管中，加入ImL被检测样品，然后加入P0ELE10和NaH2PO4，并调节体系 的PH为3. 8,最终溶液总体积为10mL，P0ELE10和NaH2PO4的浓度分别为0. 033g*mL1和 0. 186g*mL\充分振荡使其溶解得混合溶液A; (2)将上述步骤（1)中带有混合溶液A的离心管放入离心机中离心处理20分钟后， 将其取出放入25°C的水浴锅中恒温静置分相； (3)待步骤（2)中离心管中的溶液清晰的分成上下两相后，用针管小心的吸取上相； (4) 利用高效液相色谱仪HPLC在波长276nm对步骤（3)中吸取的上相中的氯霉素进 行分析测定。
【专利摘要】本发明涉及一种分离、富集及检测环境水样和水产品中痕量氯霉素的方法，该方法选择具有良好的相分离能力和良好的生物相容性的聚氧乙烯月桂醚作成相物质，选择盐析能力强的磷酸二氢钠作为分相盐，采用POELE10-盐双水相萃取体系分离、富集被检测样品中氯霉素(CAP)，即以POELE10和无机盐（NaH2PO4）为高聚物和盐析剂构成双水相萃取体系，对氯霉素进行分离、富集。该方法建立了一种全新的样品前处理体系—POELE10-盐双水相萃取体系，与现有的萃取体系相比，该方法具有更高的富集倍数和回收率。
【IPC分类】G01N30/08, G01N30/02
【公开号】CN105223279
【申请号】CN201410239707
【发明人】闫永胜, 逯洋, 丛飚, 董延华, 谭振江
【申请人】吉林师范大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年5月30日