专利名称：一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及的是一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒。
背景技术：
赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻类(主要原因种)、原生动物和细菌的过度繁殖或聚集造成海水变色的现象。近年来，由于人类活动的加剧，海洋日趋富营养化，导致赤潮频发，并已成为一种全球性的生态灾害，给水产养殖业、捕捞业和滨海旅游业造成了巨大损失，同时也给海洋生态环境带来负面影响，甚至直接威胁人类健康。有害赤潮在我国呈现出爆发次数增多、面积扩大、持续时间延长和危害加剧的趋势。如在2004年我国爆发赤潮的次数就达120次，特别是1998-2000年连续3年我国的黄海、渤海和南海就发生面积达上千平方公里的特大赤潮，为世界罕见，因此，赤潮引起了公众和政府的高度重视。对赤潮原因种进行正确鉴定是研究、认识和防治其引起的赤潮的前提和基础，同时更应建立简单、快速和特异性强的检测方法，监测赤潮高发区的水环境，对可能爆发的有害赤潮进行预警，特别是指导渔业生产者及时采取应对措施，以减少经济损失。特别是由于赤潮藻多种多样，在全世界的4000多种浮游生物中，能形成赤潮的达260多种。因此，在自然水域中多种赤潮藻常常同时存在，在水环境的日常监测中，就有必要建立一种能同时对自然水样中的多种赤潮藻进行检测的技术。当前，对自然水样中的赤潮藻的检测的传统方法，主要是以其分类学特征为基础，借助光镜和电镜对其细胞形态特征进行观察，并最终对其进行鉴定。
形态鉴定法的缺点(I)赤潮藻一般个体较小，识别困难，光镜有时只能鉴定到属，而要进一步确定其具体种类，可能需要进行电镜观察，因而工作繁锁且检测成本较高，难以适应日常水环境监测对大量样品的快速、准确处理的要求；(2)赤潮的发生通常是暴发性事件，自然水体中的赤潮藻在赤潮发生早期的细胞浓度较低，并与非赤潮藻混合在一起，一些常规的监测手段，如藻种采集、定性和定量记录等较为困难，因而可能延误赤潮藻的预警；(3)赤潮藻细胞的表观形态极易随生活环境和生理状态发生更改，因此其鉴定的经验依赖度高，这就使得有些赤潮微藻的鉴定成为分类学家的专长，也增加了自然海域中赤潮种源的鉴定、监控以及预警的难度。最近，分子生物学技术为赤潮藻的鉴定提供了新思路。赤潮藻的分子检测技术以藻细胞的基因组核糖体DNA (rDNA)为靶目标，其主要原因是藻类基因相对恒定，不会像其表观形态特征随环境条件的不同而发生变化。因此，其可克服形态学鉴定法的缺点，具有特异性强，检测迅速的特点。近年来，出现了大量有关赤潮藻分子检测方法，包括DNA 测序、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)>随机扩增多态性DNA (RAPD) (random amplified polymorphic DNA)、全细胞突光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、实时突光定量PCR和三明治杂交(sandwich hybridization, SHA),这些方法都只能对自然样品中的单种赤潮藻进行检测。最近，还出现了可对自然样品中的多种赤潮藻进行并行检测的基因芯片法。然而，当前还没有一种可以对自然水样中的多种赤潮藻进行现场检测的分子技术。 现有的分子检测方法的缺点(I)现有的分子检测技术除基因芯片技术除外均只能对自然样品的单种赤潮藻进行鉴定和检测，不能对自然样品的多种赤潮藻进行检测；(2)无法实现现场检测现有的分子检测方法必须借助特别的实验仪器，如DNA测序需要PCR仪和测序仪，限制性片段长度多态性和随机扩增多态性DNA需要DNA电泳仪，全细胞荧光原位杂交需要荧光显微镜，实时荧光定量PCR需要荧光定量PCR仪，三明治杂交需要酶标仪等，这就使得这些检测方法必须在实验室才能完成，无法对自然水体中的赤潮藻进行现场检测。(3)现有芯片检测技术的缺点虽然现有的芯片技术能实现对自然样品中多种赤潮藻的并行检测，但其核酸制备需要核酸扩增仪，结果的判读需要荧光扫描仪，使其检测费用较高，且也难以成为现场检测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒。本发明的技术方案如下一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒，包括膜分类基因芯片条，含检测赤潮异湾藻、东海原甲藻、 新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、阴性对照探针和阳性对照探针，每条探针2个重复；核酸制备所需试剂自然样品核酸粗提试剂2%(m/v)CTAB, 0. 5%(ν/ν) β -mercaptoethanol,1. 4MNaCl, 20mM EDTA, IOOmM Tris-Cl, 10U RNase Inhibitor ；5 X NASBA Buffer :0. 2M Tris-HCl, 60mM MgCl2, 0. 35M KCl2, 25mM DTT, 20mMdNTP ；NTP 10mM ATP, IOmM GTP, IOmM CT P,6. 5mM UTP, 3. 5mMDigoxigenin-l1-UTP ；5 X Primer mix 75%DMS0, I μ M NASBA-PI, I μ M NASBA-P2, 25mM DT T, 20mMdNTP ；4XEnzyme mix :1. 5M 山梨醇，0. 42mg/ml BSA, 16U/ml RNase H, 6400U/ml T7RNAPolymerase, 1280U/ml RT-M-MLV，4000U/ml RNA inhibitor ；核酸杂交所需试剂RNA 变性剂1. 5M NaCl，0. 15M 二水柠檬酸三钠，pH7. 0，0. 15M 甲醛；杂交液l%BlockingReagent II, 0. 75M NaCl, 0. 075M二水柠檬酸三钠，50 μ g/ml鲑精DNA ；
Buffer II l%Blocking Reagent II，0.1M Tris, 0. 15NaCl，pH7.5 ；碱性磷酸酶标记的DIG抗体AP-抗DIG ；20 X SSC 3MNaCl，0. 3M 二水柠檬酸三钠，ρΗ7· O ;IOXBuffer1:1. OM Tris,1. 5MNaCl, ρΗ7· 5 ；IOXBufferII1:1. OM Tris,1. OM NaCl, O. 5Μ MgCl2, ρΗ9· 5 ；10%SDS ；显色剂2.81%ΝΒΤ, 2. 19%BCIP, 70% 二甲基甲酰胺。所述膜分类基因芯片条的制备方法为(I)按下表序列信息探针信息
权利要求
1.一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒，其特征在于，包括膜分类基因芯片条，含检测赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、阴性对照探针和阳性对照探针， 每条探针2个重复；核酸制备所需试剂自然样品核酸粗提试剂2%(m/v)CTAB, O. 5%(ν/ν) β -mercaptoethanol,1. 4Μ NaCl, 20mM EDTA, IOOmM Tris-Cl, IOU RNase Inhibitor ；5XNASBA Buffer :0.2M Tris-HCl, 60mM MgC12, 0. 35M KC12, 25mM DTT, 20mM dNTP ； NTP 10mM ATP, IOmM GTP, IOmM CTP,6. 5mM UTP, 3. 5mMDigoxigenin-l1-UTP ；5XPrimer mix 75%DMS0, I μ M NASBA-PI, I μ M NASBA-P2, 25mM DTT, 20mM dNTP ；4 X Enzyme mix :1. 5M 山梨醇，0. 42mg/ml BSA, 16U/ml RNase H, 6400U/ml T7RNA Polymerase, 1280U/ml RT-M-MLV，4000U/ml RNA inhibitor ；核酸杂交所需试剂RNA变性剂1. 5M NaCl，0. 15M 二水柠檬酸三钠，pH7. 0，0. 15M甲醛；杂交液l%Blocking Reagent II, 0. 75M NaCl, 0. 075M二水柠檬酸三钠，50 μ g/ml 鲑精DNA ；Buffer II l%Blocking Reagent II，0.1M Trisj 0. 15NaCl，pH7. 5 ；碱性磷酸酶标记的DIG抗体AP-抗DIG ；20 X SSC 3M NaCl，0· 3M 二水柠檬酸三钠，ρΗ7· O ;IOXBuffer1:1. OM Tris,1. 5M NaCl, ρΗ7· 5 ；IOXBuffer II1:1. OM Tris,1. OM NaCl, O. 5Μ MgCl2, ρΗ9· 5 ；10%SDS ；显色剂2. 81%ΝΒΤ，2· 19%BCIP，70% 二甲基甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述膜分类基因芯片条的制备方法为(I)按下表序列信息探针信息
全文摘要
本发明公开了一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒，包括膜分类基因芯片条，含检测赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、阴性对照探针和阳性对照探针，每条探针2个重复；以及核酸制备所需试剂和核酸杂交所需试剂；本试剂盒即是要开发一种便携式、灵敏和快速的检测试剂盒，该试剂盒既能对自然样品中的几种常见赤潮藻，包括赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻进行同时检测，又不需要昂贵的仪器，也即实现对自然样品中多种赤潮藻的现场检测。
文档编号C12Q1/68GK103045753SQ20131002246
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者张春云, 陈国福, 马超帅 申请人:哈尔滨工业大学(威海)