一种植物核糖体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物核糖体的制备方法。
【背景技术】
[0002]长期以来抗植物病毒的药剂筛选和相关研宄一直在持续开展，目前市场上也可得到一些抗病毒的药剂，然而绝大多数抗植物病毒剂的抗病毒活性仅仅在30%至60%之间，理想的抗植物病毒药剂依然十分缺乏。
[0003]植物病毒病防治的研宄仍是当务之急。简单地进行化合物的抗病毒筛选既耗费了大量的精力又难找到理想的化合物。近年，抗植物病毒剂研宄中出现了一些新的动向，给抗植物病毒剂的研宄与开发带来新的机遇。表现在:随着相关学科的发展以及各种先进的现代分析检测技术及手段向该领域的渗透，为了解微区的、动态的、或者分子间的互作方面提供了可能，这为抗植物病毒剂的药理研宄注入巨大活力；抗植物病毒剂研宄中新的筛选体系和方法的建立，并且研宄视觉随着药理研宄的深入，已开始仅仅从研宄药剂对病毒的活性影响扩大到研宄病毒、寄主植物和药剂间的相互关系，研宄开始变得深入而全面。另夕卜，天然抗病毒物质长期以来有不少研宄成果报道，由于活性成分在天然物中往往含量低，来源有限，开发成本高，要大规模开发作为实用的抗植物病毒剂使用并不现实。这个领域的研宄目前来说，更重要的是药理学研宄与先导化合物的确定。对环境友好而对寄主植物没有不良影响却对病毒具有抑制活性的天然物筛选及其药理研宄，无疑是极有价值的研宄对象和重要的基础性研宄领域，活性物的筛选与结构鉴定一方面可直接作为仿生合成的模板(先导)，为新农药仿生创制服务；而更具深远意义的还在于对活性物的药理及机制研宄，明确作用靶标，由靶标去设计更有效的先导，或者直接利用靶标筛选，并从而确定先导化合物，通过先导优化再进行人工化学合成与结构修饰开发抗病毒剂，这无疑是抗植物病毒剂走向成功的更有效途径。并且现代化学技术的进展，在农药合成与筛选中新的思路和方法不断出现，如针对靶标的计算机辅助设计、农药合成的分子设计、分子等排理论、化合物结构与活性关系定量解析(QSAR)、有机概念图等给抗植物病毒剂化学合成提供了有利条件。药理研宄和相关学科的进展给抗植物病毒剂带来新的机遇，抗植物病毒剂研宄与其它学科的紧密联系，将推动新世纪抗植物病毒剂实用化进程，使其在植物病毒危害控制中发挥重要作用。
[0004]在对抗植物病毒化合物的筛选过程中已经发现一些化合物能有效地抑制病毒的蛋白质合成，但它们对寄主植物的毒害也相当严重(除PAP等植物蛋白的特殊例子外)，因此未得到实际应用。从中也给人们启示，如果能找到一些化合物能抑制植物病毒(TMV)的蛋白合成，而对植物细胞无毒害作用，这些化合物有可能发展成理想的抗病毒剂。在病毒与寄主十分复杂的关系中，病毒RNA与寄主核糖体的结合是病毒蛋白质合成的一个关键步骤，在病毒的整个侵染循环中具有非常重要的意义。分子生物学等领域的研宄已经表明，寄主mRNA和病毒RNA与寄主核糖体的结合特点是有区别的，这些mRNA(包括病毒RNA)与寄主核糖体结合以后的翻译过程特点则几乎无区别。因此，如果我们能找到一种化合物，它能有效地阻断病毒RNA与寄主核糖体的结合，而对植物自身的mRNA的翻译无影响，即实现对病毒和对寄主细胞蛋白质合成的抑制选择性，那么，这种化合物有可能是抗植物病毒高效安全活性物质研宄的一个突破口。从而以病毒核酸和核糖体结合直接为药物作用靶标，来筛选药物，最终有望开发把病毒复制控制在病毒侵染寄主早期的病毒核酸与寄主核糖体结合这一关键步骤的优良抗植物病毒剂，这对于抗植物病毒病药剂的研制具有重要意义。
[0005]材料的来源与质量直接关系到体系建立的成功性，探寻合理的制备技术在整个研宄过程中占有重要地位，材料的质量保证是体系及药物筛选的前提。因此，寻找一种材料的制备方法是非常必要的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种植物核糖体的制备方法。
[0007]本发明的目的是这样实现的，包括麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤，具体包括:
A、麦胚的制备:取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径Imm筛，再过孔径0.45mm筛，收集0.45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗涤，洗涤后加入固液体积比8~12倍的无菌水，置于摇床上于温度3~5°C晃摇洗涤8~12min，洗涤2~4次，加入固液体积比1~3倍的裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理8~12min,处理2~4次，干燥，于3~5°C保存备用；
B、核糖体麦胚抽提物的制备:称取A步骤制备的麦胚0.05?0.15g，置于DEPC处理过的离心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5?1.5ml的核糖体抽提缓冲液(2XBuffer A:40mM Hepes/KOH, 120mM K(AC)2，5mM Mg (AC) 2, 2mM CaCl2, 4mM DTT^P 8 ?12 μ I 标准混合氨基酸(lmM/each，promega)，混摇使粉末分散，置于频率30Hz的振荡器上震荡抽提20?40s，于O?5°C静置2?4min，于3?5°C、30000g离心20?40min，上清液上SephadexG-25柱，用I X Buffer A (核糖体抽提缓冲液2X Buffer A倍比稀释)洗脱，以1.5ml/管或0.5ml/管依次收集洗脱液，并将洗脱液于3?5°C、30000g离心8?12min纯化处理，测定各管洗脱液260nm和280nm紫外吸收值，作洗脱曲线，以吸收峰作为不同组分的依据，对相应峰的洗脱液通过琼脂糖电泳和氯仿/酚法去蛋白后核酸琼脂电泳，鉴定洗脱液，确定含核糖体的麦胚抽提物并收集，得到目标物，置液氮中保存备用。
[0008]本发明解决了核酸核糖体离体结合体系的构建及药物的抗病毒活性筛选中材料的来源与质量，本发明制备得到的植物核糖体质量纯净，纯度较高且提取完整，可用于病毒TMV-RNA离体蛋白翻译体系，用于靶向性药物筛选，作为核糖体的一个来源。
【附图说明】
[0009]图1为提纯TMV紫外扫描图谱示意图；
图2为提纯TMV SDS-PAGE蛋白电泳示意图；
图3为TMV病毒核酸RNA的紫外扫描图谱示意图；
图4为总RNA (I )、提纯TMV-RNA (2)、麦胚核糖体(4)电泳图；
其中:1_ 植物总 RNA ;2_ 提纯 TMV-RNA ；3-RNA-Marker(0.5，1，2，3，4，5，6kb 标准);4_ 麦胚核糖体抽提物；
图5为血清IgG纯化前后SDS-PAGE差异显不不意图；
图6为感病烟草叶片SDS-PAGE及Western blot检测示意图；
图7为挑选制备水洗前后的麦胚对比示意图；
图8为核糖体麦胚抽提液G-25凝胶纯化洗脱曲线示意图；
图9为麦胚抽提物凝胶洗脱含核糖体组分电泳检测示意图；
图10为核糖体，感病烟叶总RNA及TMV-RNA电泳图谱示意图；
其中:1-核糖体；2-感病烟叶总RNA ；3-TMV-RNA ；
图11为第一个淋出峰进一步离心并脱蛋白后针对核酸电泳图谱示意图；
图12为凝胶洗脱具麦胚核糖体部分小体积收集顺次电泳图谱。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0011 ] 本发明所述的植物核糖体的制备方法，包括麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤，具体包括:
A、麦胚的制备:取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径Imm筛，再过孔径0.45mm筛，收集0.45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗涤，洗涤后加入固液体积比8~12倍的无菌水，置于摇床上于温度3~5°C晃摇洗涤8~12min，洗涤2~4次，加入固液体积比1~3倍的裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理8~12min,处理2~4次，干燥，于3~5°C保存备用；
B、核糖体麦胚抽提物的制备:称取A步骤制备的麦胚0.05?0.15g，置于DEPC处理过的离心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0.5?1.5ml的核糖体抽提缓冲液(2XBuffer A:40mM Hepes/KOH, 120mM K(AC)2，5mM Mg (AC) 2, 2mM CaCl2, 4