本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基及其制备方法和应用。
背景技术：
细菌菌蜕即不含菌体内容物(包括胞浆、核糖体、胞质颗粒等)，但其细胞外膜形态物质保持不变，能够有效识别外源抗原，且不可繁殖的死菌形态。一般的基因工程疫苗都需要佐剂辅助才能发挥良好的免疫效力，但目前所知的佐剂都具有毒性，没有毒副作用的佐剂还尚未出现。而细菌菌蜕疫苗自身就具备佐剂的性质，且免疫效率高，安全性良好，是一种前景广阔的新型疫苗。维氏气单胞菌属于气单胞菌属，主要分布于淡水环境中，世界范围内分布极为广泛，主要感染免疫力相对低下的淡水鱼类，给水产养殖业带来了巨大的经济损失。为更好防治该类细菌引起的疾病，通过构建了一种新型的基因工程疫苗-维氏气单胞菌菌蜕疫苗，应用于水产养殖中疾病的防治。
维氏气单胞菌在适宜环境下生长，通过升温诱导裂解酶基因E表达，使维氏气单胞菌内容物丢失，形成菌蜕。目前，维氏气单胞菌菌蜕主要通过发酵生产的方法获得，并且一直依赖进口培养基进行研究的，但是进口培养基不仅具有菌蜕浓度高的优点，还具有裂解率高的优点，但是进口培养基价格昂贵，大大增加了生产成本，因此，大大限制了维氏气单胞菌菌蜕的生产。而国内报道的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基发酵生产的维氏气单胞菌菌蜕产量较低，同时裂解率不能达到生产要求。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基及其制备方法和应用，使所述培养基能够达到进口培养基的发酵效率的同时还能大幅度降低生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：蛋白胨8～12g/L、豆粕4～6g/L、酵母粉5～8g/L和氯化钠8～12g/L；培养基的pH值为7.0～7.5。
优选的，包括以下质量浓度的组分：蛋白胨10g/L，豆粕5g/L，酵母粉6g/L和氯化钠10g/L。
优选的，所述蛋白胨为百家工贸蛋白胨。
优选的，所述酵母粉为安琪酵母粉。
优选的，所述培养基的pH值为7.2。
本发明提供了所述的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基的制备方法，包括以下步骤：
将蛋白胨、豆粕、酵母粉、氯化钠和水混合搅拌，得到的混合物调整pH值，得到维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基。
本发明提供了所述培养基或所述的方法制备的培养基在维氏气单胞菌菌蜕发酵中的应用。
优选的，所述维氏气单胞菌菌蜕发酵的温度优选为27～29℃；所述发酵的转速优选为150～190rpm。
优选的，所述维氏气单胞菌菌蜕发酵时诱导维氏气单胞菌菌蜕的温度为41～43℃。
本发明提供了一种维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：蛋白胨8～12g/L、豆粕4～6g/L、酵母粉5～8g/L和氯化钠8～12g/L；培养基的pH值为7.0～7.5。本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基通过选择蛋白胨和豆粕作为氮源，酵母粉作为碳源，氯化钠作为无机盐，同时严格控制四种组分的用量来满足使维氏气单胞菌菌蜕浓度达到8.8×107cell/mL，同进口培养基能使菌蜕浓度能达到1×108cell/mL比较接近，能够满足市场需要。培养基的营养成分不同会影响细菌活性，而细菌活性对细菌的裂解有重要影响，活性不强的细菌或未正常分裂细菌不能正常裂解，本发明提供的培养基使菌蜕裂解率达到99.999％，因此本发明提供的培养基能够保证发酵得到的维氏气单胞菌活力强的优点。同时本发明提供的培养基降低生产成本，提高工厂化生产的可能性，大大克服了维氏气单胞菌菌蜕发酵依赖进口培养基的现状。
具体实施方式
本发明提供了一种维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：蛋白胨8～12g/L、豆粕4～6g/L、酵母粉5～8g/L和氯化钠8～12g/L；培养基的pH值为7.0～7.5。
本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基以水为溶剂，包括质量浓度为8～12g/L的蛋白胨，优选为9～11g/L，更优选为10g/L。所述蛋白胨为维氏气单胞菌生长提供氮源。在本发明的实施例中，所述蛋白胨的来源优选为百家工贸蛋白胨、奥博星蛋白胨，更优选为百家工贸蛋白胨。
本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基包括质量浓度为4～6g/L的豆粕，优选为4.5～5.5g/L，更优选为5g/L。所述豆粕的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的豆粕即可。所述豆粕为维氏气单胞菌生长提供氮源。
本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基包括质量浓度为5～8g/L的酵母粉，优选为5.5～7g/L，更优选为6g/L。所述酵母粉为维氏气单胞菌生长提供碳源。所述蛋酵母粉的来源优选为安琪酵母粉、奥博星蛋白胨，更优选为安琪酵母粉。
本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基包括质量浓度为8～12g/L的氯化钠，优选为9～11g/L，更优选为10g/L。所述氯化钠的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的氯化钠即可。本发明实施例中，所述氯化钠购自西陇化工公司。所述氯化钠为维氏气单胞菌生长提供无机盐。
本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基包括水，以水为溶剂，溶解上述组分。所述水优选为双蒸水、纯净水或蒸馏水，更优选为蒸馏水。
本发明提供的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基的pH值优选为7.0～7.5，更优选为7.2。
本发明提供了所述维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基的制备方法，包括以下步骤：
将蛋白胨、豆粕、酵母粉、氯化钠和水混合搅拌，得到的混合物调整pH值，得到维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基。
本发明中，所述混合搅拌的的转速优选为200～300rpm。
本发明中，pH值调整的方法没有特殊限制，采用常规的方法即可。
本发明提供了上述技术方案所述培养基或上述技术方案所述方法制备的培养基在维氏气单胞菌菌蜕发酵中的应用。
简单说明发酵过程或发酵的步骤，引出诱导的过程
本发明中，所述维氏气单孢菌(Aeromonas schubertii)由北京市水产研究所提供，由本实验室传代并进行保存。
本发明中，所述维氏气单胞菌菌蜕发酵的温度优选为27～29℃，更优选为28℃；所述发酵的转速优选为150～190rpm，更优选为160～180rpm，最优选为170rpm。
本发明中，所述诱导维氏气单胞菌发生菌蜕的时间为发酵开始10～48h。
本发明中，所述维氏气单胞菌菌蜕发酵时诱导维氏气单胞菌菌蜕的温度优选为41～43℃，更优选为42℃。本发明中，提高培养温度的目的是诱导裂解酶基因E表达，所述基因E的表达使维氏气单胞菌发生裂解，内容物排出，形成菌蜕。
本发明中，所述裂解率的测量时机优选为诱导温度持续22.5h后进行。
所述菌蜕得率按照式I进行计算：
所述菌蜕得率＝[(n1-n2)/n1]×100％ 式I
n1为温度诱导前活菌数，n2为温度诱导后活菌数。
下面结合实施例对本发明提供的一种维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，百家工贸蛋白胨8g/L、豆粕6g/L、安琪酵母粉5g/L和氯化钠12g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.0。
采用上述制备的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基进行发酵培养，具体包括以下步骤：
1)接种：下午17：00从最新的平板中挑取单菌落接入到3ml试管中(AMP添加浓度为100μg/ml,kana添加为50μg/ml)，放入摇床中28℃，200rmp恒温振荡培养16h。
2)转接
将AMP和Kana加入提前配好的装有100ml/500ml的三角瓶和50ml/250ml三角瓶中，在接种前加入到发酵摇瓶当中。按照1％的接种量将种子液分别加入发酵摇瓶当中。发酵温度为28℃，170rpm培养。
3)检测菌浓及升温诱导
在发酵摇瓶培养期间检测OD600，当培养到OD600＝0.4～0.5时，取样，按照10-4、10-5和10-6进行稀释涂板，计算菌体浓度。
对菌液的培养温度迅速升温升到42℃，诱导裂解酶基因E表达，所述裂解酶基因E表达后培养22.5h后，取样进行稀释涂板，测其裂解后的一个活菌数。
4)裂解后活菌数统计
分别测量42℃培养22.5h时的OD值并且稀释涂板，对其菌落数进行统计。
实施例2
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，奥博星蛋白胨12g/L、豆粕4g/L、安琪酵母粉8g/L和氯化钠8g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.5。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
实施例3
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，百家工贸蛋白胨9g/L、豆粕5.5g/L、安琪酵母粉5.5g/L和氯化钠9g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.1。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
实施例4
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，博奥星蛋白胨11g/L、豆粕4.5g/L、博奥星酵母粉7g/L和氯化钠11g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.3。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
实施例5
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，百家工贸蛋白胨10g/L、豆粕5g/L、安琪酵母粉6g/L和氯化钠10g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.2。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
对比例1
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，玉米浆8g/L、豆粕6g/L、安琪酵母粉5g/L和氯化钠12g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.3。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
对比例2
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，奥博星蛋白胨15g/L、安琪酵母粉8g/L和氯化钠8g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.2。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
对比例3
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，奥博星蛋白胨10g/L、豆粕3g/L、安琪酵母粉10g/L和氯化钠5g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.2。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
对比例4
配制如下组分含量的维氏气单胞菌菌蜕发酵用培养基，以水为溶剂，货号为OXIOD-LP0042的进口胰蛋白胨10g/L、OXIOD-LP0042的进口酵母浸粉5g/L和氯化钠10g/L；用1％的NaOH溶液和1％的HCl溶液调整培养基的pH值为7.2。
采用上述方法制备的菌蜕发酵用培养基按照实施例1所述的方法对维氏气单胞菌进行发酵得到菌蜕。
实施例1～5和对比例4的活体浓度和裂解率结果见表1。
表1实施例1～5和对比例4的活体浓度和裂解率一览表
从表1可以看出，实施例1～5的活体浓度达到8.8×107～9.5×107CFU/mL，裂解率均达到100％，对比例4是采用的进口培养基进行的发酵培养，活体浓度达到1.1×107CFU/mL，裂解率均达到100％，可以看出，本发明提供的培养基方案基本能够达到进口培养基的活体浓度，而且裂解率达到100％，说明本发明提供的培养基方案培养的维氏气单胞菌火力强。此外，通对比例1～3的实验数据来看，活菌浓度与裂解率均不能达到本申请的发酵效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。