一种筛选异化铁还原细菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种筛选异化铁还原细菌的方法。
【背景技术】
[0002] 铁是一种变价金属，铁的生物氧化还原涉及多种元素的生物地球化学循环。以 Fe(III)和Fe(II)为主导的铁循环过程是调控重金属迀移转化的关键因子之一，而微生物 介导的异化铁还原过程能够同时实现有机污染物在厌氧条件下的氧化分解。因此，微生物 介导铁还原过程在生态环境及生物修复中具有重要作用。
[0003] 由于现代工业的快速发展，环境中有机污染物逐步的累积，导致许多被污染的环 境提供了一种厌氧或缺氧的条件。而在厌氧环境下，Fe(III)成为了有机物氧化最重要 的电子受体。异化铁还原细菌不是一个分类学上的概念，它实际上是具有Fe(III)还原 功能的一类微生物的总称。具有异化铁还原能力的微生物在细菌和古细菌域中都有发 现（LeeandNewman,Microbialironrespiration:impactsoncorrosionprocesses. AppliedandEnvironmentalMicrobiology, 2003, 62:134-138)。迄今为止，已经在细 菌域的9个门，15个纲，27个目，37个科，65个属及古细菌域2个门，5个纲，7个目，7个 科，10个属中发现有异化铁还原微生物的分布，表1是有关沉积物中部分异化铁还原微 生物及其来源(Lovley,Bioremediationoforganicandmetalcontaminantswith dissimilatorymetalreduction.JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnolo gy， 1995, 14:85-93)。
[0004] 表1部分沉积物中异化铁还原细菌及其来源
【主权项】
1. 一种筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 利用逐步提高液体培养基中Fe (III)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养：将 污泥样品加入含Fe(III)的液体培养基中，充氮气厌氧培养，所述液体培养基中Fe(III)的 初始浓度为5~10mm 〇l/L，培养过程中将Fe (III)还原能力较强的菌群逐步转接至Fe (III) 浓度更高的液体培养基中，每次转接将Fe (III)的浓度提高5~10mm〇l/L，直至提高到 50mmol/L ； (2) 从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌：将经过步骤（1)富集培养后的泥浆悬液 离心，取上清菌液稀释后划线接种于Fe (III)浓度为10~50mmol/L的固体培养基上，待菌 液完全被固体培养基吸收后再倾倒一层相同的固体培养基，待上层的固体培养基凝固后， 再倾倒一层液体石蜡加以封盖；将此三层平板培养24~72h后挑取单菌落，接种于Fe (III) 浓度为10~50mmol/L的液体培养基中，充氮气厌氧培养24~72h后测定液体培养基中 Fe( II )浓度，选取积累Fe( II )浓度最高的菌株，再次接种于所述三层平板中进行培养和 分离，重复上述过程，直至获得纯化菌株； 所述步骤（1)、（2)中培养基的酸碱度均保持在：pH6. 0~9. 0 ;对应的培养温度均为： 20 ~40°C。
2. 根据权利要求1所述的筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于：在所述步骤（2) 之后还包括重金属耐受能力或高盐度耐受能力的梯度驯化步骤；所述重金属耐受能力的 梯度驯化步骤采取如下方法：将步骤（2)获得的纯化菌株接种于Fe(III)浓度为10~ 50mmol/L的液体培养基中，充氮气厌氧培养；培养过程中将重金属耐受能力及Fe (III)还 原能力较强的菌株逐步转接至Cr ( VI)浓度更高的液体培养基中，液体培养基中Cr ( VI) 的最高浓度不超过2. 5mmol/L，Fe (III)的浓度保持不变，培养基酸碱度均保持在：pH6. 0~ 9. 0 ;对应的培养温度均为：20~40°C ; 所述高盐度耐受能力的梯度驯化步骤采取如下方法：将步骤（2)获得的纯化菌株接种 于Fe (III)浓度为10~50mmol/L的液体培养基中充氮气厌氧培养，培养过程中将耐盐能 力及Fe (III)还原能力较强菌株逐步转接至NaCl浓度更高的液体培养基中，液体培养基中 NaCl的最高浓度不超过60g/L，Fe (III)的浓度保持不变，培养基酸碱度均保持在：pH6. 0~ 9. 0 ;对应的培养温度均为：20~40°C。
3. 根据权利要求1或2所述的筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于：在所述步骤 (1)、⑵、重金属耐受能力以及高盐度耐受能力的梯度驯化步骤中使用的含Fe (III)的液体 培养基为柠檬酸铁培养基；所述步骤（2)中使用的含Fe(III)的固体培养基为柠檬酸铁固 体培养基。
4. 根据权利要求1或2所述的筛选异化铁还原细菌的方法，其特征在于：在所述步骤 (1)、（2)、重金属耐受能力以及高盐度耐受能力的梯度驯化步骤中，充氮气厌氧培养的方法 为：将液体培养基置于培养容器中，通入氮气使培养容器内的空气完全排出，之后密封容器 进行培养。
【专利摘要】本发明公开了一种筛选异化铁还原细菌的方法，包括：(1)利用逐步提高液体培养基中Fe(Ⅲ)浓度的方式对沉积物污泥进行富集培养；(2)从富集菌群中分离纯化异化铁还原细菌，以及重金属耐受能力和耐盐能力的梯度驯化步骤。所述异化铁还原细菌的筛选方法简便易行且筛选周期短，筛选过程中无需厌氧操作系统等昂贵的分离设备，有效降低了筛选成本，获得的纯化菌株具有较强的Fe(Ⅲ)还原能力。另外，通过对纯化菌株的重金属耐受能力和耐盐能力的梯度驯化能够快速、简便地获得对Cr(Ⅵ)重金属以及不同盐浓度环境具有耐受能力的异化铁还原菌株，为重金属、盐域等环境下的生物修复提供种质资源。
【IPC分类】C12N1-20
【公开号】CN104745519
【申请号】CN201510183645
【发明人】刘洪艳, 王红玉, 马帅, 殷艳艳
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月17日