专利名称：一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法
技术领域：
本发明属于海水养殖环境中细菌筛选领域,特别涉及一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法。
背景技术：
自20世纪80年代以来，由于海洋渔业资源的锐减使得海水 养殖业得到迅猛发展，全球的海水养殖每年以10%的速度增加。我国的海水养殖业在养殖面积、放养种类以及产量等方面也得到了很大的发展。然而，大规模发展海水养殖使得近岸大量水面被围拦或密置网箱，水体超负荷运载。由于网围精养采取高密度放养，需投喂大量外源性饵料、肥料等，致使水中氮、磷含量猛增，透明度下降，水质恶化，底质污染严重，水体富营养化加重，病害逐年加重，赤潮频发。随着此项产业的发展，使局部养殖海域的水环境质量受到严重影响。养殖业的自身污染已经开始制约渔业生产的持续健康发展。海水养殖区的沉降量比非养殖区大得多。季如宝等在对贝类养殖的海湾生态系统研究中指出，在贝类密集区，生物的沉降作用非常明显。Hatcher等人在加拿大Upper SouthCove贻贝养殖区进行了测定，发现养殖区的沉降量往往是非养殖区的2倍以上。在瑞典的某一贻贝养殖区，每个养殖季节结束后底质增厚IOcm左右。水产养殖区的底泥中，碳、氮、磷的含量比周围水体沉积物中要高，耗氧量亦高，沉积物中经常可见残饵。当底泥堆积的有机物过多时将导致底质理化指标的改变，微生物的分解作用旺盛，底泥溶解氧不足，因缺氧或无氧而成为还原态；海水中含有大量的硫酸盐，在还原环境中生成H2S，并且由于沉积物的吸附作用，可以渗透扩散到底层数厘米深。所以，海水养殖水质和沉积物环境质量改善是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，该方法操作简单，效果直观可靠，所分离菌株可以利用铵态氮为唯一氮源的培养基进行生长，并且可以耐受高盐度的海水养殖环境，对养殖水体中的铵态氮乃至养殖水体和沉积物中的硫化物具有良好的去除效果。本发明的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，包括(I)配制分离异养硝化细菌用培养基，于121°C下灭菌15-20分钟，待培养基冷却至45 50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板；将海水养殖环境中水样或者沉积物样品与无菌海水混合得到稀释液或均匀悬浊液，将稀释液或均匀悬浊液再与无菌海水按体积比1:9进行梯度稀释，稀释6-7次，得到不同浓度的稀释液；将每一浓度的稀释样品在上述平板上摊开，干燥，静置冷凝后，30°C下培养3-4天；在形成菌落的平板上，挑取单个菌落按照上述方法再重复2-3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株；(2)在步骤(I)中得到的平板上以点接种方式接种上述异养菌株，30°C下培养3-4天后，形成单菌落后，用格利斯试剂点滴于菌落上，挑取菌落周边红色深的，作为硝化能力复核用的供试菌株；(3)将由步骤(2)筛选出的供试菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于含唯一碳源的复核用培养基，30°C下培养7-10天，培养期间每隔3天取培养液至洁净试管，将格利斯试剂点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接菌株的培养基作为空白对照，同样选择红色深的菌株作为脱硫细菌筛选用的供试菌株；(4)将由步骤(3)筛选出的供试菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于脱硫细菌筛选用培养基中，300C下培养，并同时做不接菌株的空白对照；用碘量法测定培养液中硫化物含量，选择硫化物含量明显降低的菌株作为同步去除铵态氮和硫化物能力测试用的供试菌株;(5)将由步骤(4)筛选出的供试菌株同样在脱硫细菌筛选用培养基中培养，培养过程中取样，用钠氏试剂比色法测定培养液中铵态氮浓度，并用碘量法测定培养液中硫化物含量，验证供试菌株的同步去除铵态氮和硫化物能力；选择去除铵态氮和硫化物效果好的， 即得所需异养硝化脱硫细菌。所述步骤(I)中的分离异养硝化细菌用培养基的组成为蛋白胨5g，酵母膏lg，琼脂粉 18g，海水 1L，pH8. 2-8. 4。(2116E 培养基)所述步骤(I)中的水样与无菌海水按体积比1:9混合；沉积物样品与无菌海水按质量体积比lg:99mL混合。所述步骤(I)中的形成菌落的平板具体为每个平板有90-100个菌落。所述步骤(2)中的单菌落的直径为I. 8 2. 2mm。所述步骤(2)中的格利斯试剂的配制方法为将对氨基苯璜酸0. 5g溶于30mL冰醋酸和IOOmL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氨基苯磺酸溶液；称取0. Iga -萘胺溶解于IOOmL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得a -萘胺溶液；将两种溶液等量混合，即得格利斯试剂。所述步骤(3)中的含唯一碳源的复核用培养基的组成为=(NH4)2SO4 2. Og,MgSO4 7H20 0. 03g, FeSO4 0. Olg, NaH2PO4 0. 25g, K2HPO4 0. 75g, MnSO4 4H20 0. Olg，海水1L，pH值7. 0 7. 2 ;碳源为0. Olmol/L的乙酸钠。所述步骤(4)中的脱硫细菌筛选用培养基的组成为(NH4) 2S04 0. 5g，蔗糖5. Og,牛肉膏I. 0g, Na2S饱和液I. 5mL, IL海水，pH7. 6 7. 8。所述脱硫细菌筛选用培养基于121°C下灭菌15-20分钟。有益效果本发明操作简单，效果直观可靠，所分离菌株可以利用铵态氮为唯一氮源的培养基进行生长，并且可以耐受高盐度的海水养殖环境，对养殖水体中的铵态氮乃至养殖水体和沉积物中的硫化物具有良好的去除效果，且不产生亚硝酸盐和硝酸盐的积累，在海水养殖环境水质和沉积物环境修复中具有巨大的发展潜力。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I(I)海水养殖环境中异养细菌的分离、纯化采用2116E培养基(蛋白胨5g，酵母膏lg，琼脂粉18g，海水1L，pH8. 2)作为分离异养硝化细菌用培养基，于121°C下灭菌20分钟，待培养基冷却至45°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板；将海水沉积养殖环境中沉积物样品(离池底液面5 IOcm的暗黑色泥样)与无菌海水按照lg:99mL混合，再取该稀释的悬浊液与无菌海水以1:9比例稀释，依次稀释7次，得到不同浓度的稀释液；将每一浓度的稀释样品取0. ImL在上述平板上用灭菌的涂布棒分散摊开，干燥，每个稀释度的样品三个重复，每变化一次稀释度系列，要重新换移液管，静置冷凝后，将培养基平板扣过来放于生化培养箱30°C下培养3天；在形成菌落(90-100菌落/平板)的平板上，挑取单个菌落按照上述方法再重复3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株；
( 2 )硝化活性的初步判断在2116E平板上以点接种方式接种上述已经纯化过的菌株，在生化培养箱30°C下培养3-4天后，形成直径2. Omm左右的单菌落后，用格利斯试剂(格利斯试剂的配制称取对氨基苯璜酸0. 5g，溶于30mL冰醋酸和IOOmL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氨基苯磺酸溶液；称取0. Iga-萘胺溶解于IOOmL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得a-萘胺溶液；将两种溶液等量混合成格利斯试剂使用)直接点滴于菌落上。若菌落周围出现粉红色圈或者棕红色圈，则认为该菌落具备一定的硝化作用能力，颜色越深者，硝化作用越强。挑取菌落周边颜色较深的，作为下一步硝化(氨氧化)能力复核用供试菌株。( 3 )硝化(氨氧化)能力复核复核用培养基为(NH4)2SO42. OgjMgSO4 *7H20 0. 03g, FeSO4 0. OlgjNaH2PO4O. 25g，K2HPO4 0. 75g, MnSO4 4H20 0. Olg，海水 1L, pH 值 7. 0 ;碳源乙酸钠，使用浓度为0. 01mol/L ；将经初步判定具有硝化能力的异养菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于复核用培养基，30°C下培养I天，培养期间每隔3天取2mL培养液至洁净试管，将格利斯试剂1_2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照，若培养液变红即可确定菌株具有硝化活性。同样选择红色较深的菌株作为脱硫细菌筛选用的供试菌株。(4)脱硫细菌的筛选脱硫细菌筛选用培养基(NH4)2SO4 0. 5g，蔗糖5.0g，牛肉膏l.Og，Na2S饱和液1.51^，11海水，？117.6。按每瓶50mL分装三角瓶，于121°C下灭菌15分钟待用。将经初步判定具有硝化能力的异养菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于脱硫细菌筛选用培养基中，30°C下培养，并同时做不接菌株的空白对照。每两天取样一次，用碘量法测定培养液中硫化物含量，选择硫化物含量明显降低的菌株作为最后同步去除铵态氮和硫化物能力测试用的供试菌株。(5)同步去除铵态氮和硫化物能力的验证试验将由步骤(4)筛选出的供试菌株同样在脱硫细菌筛选用培养基中培养，培养过程中取样，用钠氏试剂比色法测定培养液中铵态氮浓度，并用碘量法测定培养液中硫化物含量，验证供试菌株的同步去除铵态氮和硫化物能力；选择去除铵态氮和硫化物效果好的，即得一株效果较好的异养硝化脱硫细菌，编号NG6-3 (GenBank登录号为EU081880)。在接种该菌株的液体培养基中，第二天铵态氮含量就达到未接菌对照组的一半水平，硫化物含量达到未接菌对照组的44. 3%，第五天开始就能100%去除水体中的硫化物，并做到无亚硝酸 盐和硝酸盐的残留，具有较好的应用前景。
权利要求
1.一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，包括 (1)配制分离异养硝化细菌用培养基，于121°c下灭菌15-20分钟，待培养基冷却至45 50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成平板；将海水养殖环境中水样或者沉积物样品与无菌海水混合得到稀释液或均匀悬浊液；将稀释液或均匀悬浊液再与无菌海水按体积比1:9进行梯度稀释，稀释6-7次，得到不同浓度的稀释液；将每一浓度的稀释样品在上述平板上摊开，干燥，静置冷凝后，30°C下培养3-4天；在形成菌落的平板上，挑取单个菌落按照上述方法再重复2-3次，即可得到经分离纯化后的异养菌株； (2)在步骤(I)中得到的平板上以点接种方式接种上述异养菌株，30°C下培养3-4天后，形成单菌落后，用格利斯试剂点滴于菌落上，挑取菌落周边红色深的，作为硝化能力复核用的供试菌株； (3)将由步骤(2)筛选出的供试菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于含唯一碳源的复核用培养基，30°C下培养7-10天，培养期间每隔3天取培养液至洁净试管，将格利斯试剂点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接菌株的培养基作为空白对照，同样选择红色深的菌株作为脱硫细菌筛选用的供试菌株； (4)将由步骤(3)筛选出的供试菌株用接种环挑取一菌环菌苔接种于脱硫细菌筛选用培养基中，30°C下培养，并同时做不接菌株的空白对照；用碘量法测定培养液中硫化物含量，选择硫化物含量明显降低的菌株作为同步去除铵态氮和硫化物能力测试用的供试菌株; (5)将由步骤(4)筛选出的供试菌株同样在脱硫细菌筛选用培养基中培养，培养过程中取样，用钠氏试剂比色法测定培养液中铵态氮浓度，并用碘量法测定培养液中硫化物含量，验证供试菌株的同步去除铵态氮和硫化物能力；选择去除铵态氮和硫化物效果好的，即得所需异养硝化脱硫细菌。
2.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(I)中的分离异养硝化细菌用培养基的组成为蛋白胨5g，酵母膏lg，琼脂粉 18g，海水 1L, pH 8. 2-8. 4。
3.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(I)中的水样与无菌海水按体积比1:9混合；沉积物样品与无菌海水按质量体积Klg: 99mL混合。
4.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(I)中的形成菌落的平板具体为每个平板有90-100个菌落。
5.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中的单菌落的直径为I. 8^2. 2mm。
6.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中的格利斯试剂的配制方法为将对氨基苯璜酸0. 5g溶于30mL冰醋酸和IOOmL蒸馏水的混合液中，过滤后制得对氨基苯磺酸溶液；称取0. Iga-萘胺溶解于IOOmL热蒸馏水中，冷却后，加入30mL冰醋酸，过滤后制得a -萘胺溶液；将两种溶液等量混合，即得格利斯试剂。
7.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中的含唯一碳源的复核用培养基的组成为=(NH4)2SO4 2. Og,MgSO4 7H200. 03g, FeSO4 0. Olg, NaH2PO4 0. 25g, K2HPO4 0. 75g, MnSO4 4H20 0. Olg,海水 1L,pH值7. O 7. 2 ;碳源为0. Olmol/L的乙酸钠。
8.根据权利要求I所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述步骤(4)中的脱硫细菌筛选用培养基的组成为(NH4)2SO4 0. 5g，蔗糖5. 0g，牛肉膏 I. 0g, Na2S 饱和液 I. 5mL, IL 海水，pH7. 6 7. 8。
9.根据权利要求8所述的一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，其特征在于所述脱硫细菌筛选用培养基于121°C下灭菌15-20分钟。
全文摘要
本发明涉及一种海水养殖环境中异养硝化脱硫细菌的筛选方法，包括(1)海水养殖环境中异养细菌的分离、纯化；(2)通过氨氧化培养基进行异养硝化细菌硝化活性的复核；(3)挑选硝化活性强的菌株作为筛选脱硫细菌的供试菌株；(4)通过含Na2S培养基进行脱硫细菌的初筛；(5)选择脱硫效果好的菌株，进行液体环境中同步去除铵态氮和硫化物能力的验证试验。本发明操作简单，效果直观可靠，所分离菌株可以利用铵态氮为唯一氮源的培养基进行生长，并且可以耐受高盐度的海水养殖环境，对养殖水体中的铵态氮乃至养殖水体和沉积物中的硫化物具有良好的去除效果。
文档编号C12N1/20GK102757919SQ20121025573
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者万夕和, 凌云, 沈辉, 王李宝, 许程林, 钟非, 陈玉生, 黎慧 申请人:江苏省海洋水产研究所