一种测定微型鞭毛虫对细菌生产力摄食速率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种测定微型鞭毛虫对细菌生产力摄食速率的方法。
【背景技术】
[0002]微型鞭毛虫是微型食物环(网)中的一个重要类群，浮游生物分泌的可溶性有机质被异养细菌利用，转变成细菌颗粒物，异养的细菌又被微型浮游动物(主要是原生动物中的鞭毛虫和纤毛虫)所摄取，再通过桡足类等中型浮游动物进入传统(经典)食物网。因而鞭毛虫对细菌生产力的摄食速率是估算生态系统碳流中的一个重要环节。
[0003]鞭毛虫中的绝大部分大小在〈20 μ m，在这个粒径范围内的浮游动物也绝大部分是微型鞭毛虫，它们个体较小因而对它们的摄食速率的方法较少。目前主要是应用荧光标记颗粒法和粒径分割计数法来测定微型鞭毛虫对细菌的摄食速率。但是前者往往是应用某大小的颗粒或标记细菌，人造颗粒往往会被鞭毛虫厌食，标记的细菌往往都是单一种类，没办法代表所有的细菌种类；后者可以测定鞭毛虫对细菌现存量的摄食速率，但却不能有效测定对细菌生产力的摄食速率。因此需要一种有效准确直接测定微型鞭毛虫对细菌生产力的方法。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种测定微型鞭毛虫对细菌生产力摄食速率的方法。
[0005]本发明采用如下技术方案:
[0006]本发明的测定微型鞭毛虫对细菌生产力摄食速率的方法的具体步骤如下:
[0007](I)采集表层海水，分别通过2.0 μ m滤膜和20 μ m筛絹预过滤，分别往过滤后的海水中加入3H-亮氨酸示踪培养，使3H-亮氨酸在海水中的浓度为5-40nM，培养0.5_2h，得到两个实验样品；取同样的海水分别通过2 μπι滤膜和20 μπι筛絹预过滤，加入三氯乙酸，使三氯乙酸在海水中的体积浓度为5%，在相同条件下培养，得到两个空白对照样品；
[0008](2)培养结束后，往实验样品中加入三氯乙酸停止反应，三氯乙酸加入量使其在溶液中的体积溶度为5 %，30min后，将样品分别过滤到2.0 μ m和0.22 μ m孔径的25mm直径硝酸纤维膜上，过滤结束后，先用三氯乙酸冲洗三次，然后用酒精冲洗三次，待完全干燥后再收集滤膜，用锡纸包好冷冻保存；
[0009](3)膜样加入乙酸乙酯溶解滤膜，加入闪烁液，用液体闪烁计数仪测定样品的放射性活度；
[0010]细菌生产力的计算按照以下公式:
[0011]BP = UXk/S/(t.V)*3.1
[0012]其中U为样品净计数，即实验样品DPM(放射性活度，每分钟的核衰变次数)减去对照样品的DPM数；k为活度计数与居里数的转化参数；S为所加入的3H-亮氨酸的比活度Ci/mmol, 3.1为亮氨酸与细胞碳的转换系数gC/mmol，t和V分别是培养时间和过滤水样体积；
[0013]通过20 μπι筛絹预处理培养样品的细菌生产力为0.22 μπι硝酸纤维滤膜测定值减去2.0 μ m硝酸纤维滤膜测定值，为BPG ；
[0014]通过2.0 μπι滤膜预处理培养样品的细菌生产力为0.22 μπι硝酸纤维滤膜测定值，为 BPN ；
[0015]微型鞭毛虫对细菌生产力的摄食率μ gC.L' r1= BPN-BPG
[0016]微型鞭毛虫对细菌生产力的摄食压力% = (BPN-BPG) /BPN)。
[0017]步骤⑴中，采集表层Im处的海水。
[0018]步骤(I)中，培养过程中，通过泵吸取同深度采集处的海水来控制培养温度与同深度采集处的表层水一致。
[0019]步骤(2)中，停止反应所用的三氯乙酸的体积浓度为50%。
[0020]步骤⑵中，冲洗所用的三氯乙酸的体积浓度为5 %。
[0021 ]步骤⑵中，冲洗所用的酒精的体积浓度为80 %。
[0022]步骤(3)中，每0.3mL样品中加入ImL乙酸乙酯溶解滤膜，加入1mL闪烁液。
[0023]步骤⑶中，所述的闪烁液为Ultima Gold, Packard。
[0024]本发明方法测定的是2-20 μ m微型浮游动物的摄食率。
[0025]步骤⑴中采用5 μ m滤膜或10 μ m筛絹，来测定〈5 μ m和10 μ m鞭毛虫的摄食速率。
[0026]本发明的积极效果如下:
[0027]本发明的测定微型鞭毛虫对细菌生产力摄食速率的方法应用同位素技术能够直接测定细菌生产力的被摄食率，并且具有方法简单，灵敏度高，测定准确等优点。
【具体实施方式】
[0028]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0029]实施例1
[0030]本发明的测定微型鞭毛虫对细菌生产力摄食速率的方法的具体步骤如下:
[0031](I)采集表层海水，分别通过2 μ m滤膜和20 μ m筛絹预过滤，分别往过滤后的海水中加入3H-亮氨酸示踪培养，使3H-亮氨酸在海水中的浓度为5-40nM，培养l_2h，得到两个实验样品；取同样的海水分别通过2 μπι滤膜和20 μπι筛絹预过滤，加入三氯乙酸，使三氯乙酸在海水中的体积浓度为5%，在相同条件下培养，得到两个空白对照样品；
[0032](2)培养结束后，往实验样品中加入三氯乙酸停止反应，三氯乙酸加入量使其在溶液中的体积溶度为5 %，30min后，将样品分别过滤到2.0 μ m和0.22 μ m孔径的25mm直径硝酸纤维膜上，过滤结束后，先用三氯乙酸冲洗三次，然后用酒精冲洗三次，待完全干燥后再收集滤膜，用锡纸包好冷冻保存；
[0033](3)膜样加入乙酸乙酯溶解滤膜，加入闪烁液，用液体闪烁计数仪测定样品的放射性活度；
[0034]细菌生产力的计算按照以下公式:
[0035]BP = UXk/S/(t.V)*3.1
[0036]其中U为样品净计数，即实验样品DPM减去对照样品的DPM数；k为活度计数与居里数的转化参数；s为所加入的3H-亮氨酸的比活度Ci/mmol，3.1为亮氨酸与细胞碳的转换系数gC/mmol，t和V分别是培养时间和过滤水样体积；
[0037]通过20 μπι筛絹预处理培养样品的细菌生产力为0.22 μπι硝酸纤维滤膜测定值减去2.0 μ m硝酸纤维滤膜测定值，为BPG ；
[0038]通过2.0 μπι滤膜预处理培养样品的细菌生产力为0.22 μπι硝酸纤维滤膜测定值，为 BPN ；