专利名称：：用于检测alk-1基因突变的引物组、该引物组的用途及包含该引物组的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及引物，具体涉及用于检测ALK-1基因突变的引物组，本发明还涉及该引物组的用途，以及包含该引物组的试剂盒。
背景技术：
：活化素受体激酶I(activinreceptortypeI1-likekinase-l,ALK-1也称为ACVRL1)位于12qll_ql4，含10个外显子，基因组全长约15kb+。它突变能引起遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditaryhemorrhagictelangiectasiaHHT)或遗传性肺动脉高压(heritablepulmonaryarterialhypertensionPAH)。有些突变携带者同时具有两种病症。HHT是一种常染色体显性遗传性出血性疾病，以皮肤黏膜多发性毛细血管扩张伴反复出血为特征，临床上一般可分为I型HHT和II型HHT两种表型。其中II型HHT由ALK-1基因突变引起，HHT-1I最常见的临床表现为反复的自发性出血或轻度创伤出血，以鼻出血最常见，而临床处理却非常棘手。肺动脉高压是各种原因引起的静息状态下右心导管测得的肺动脉平均压(meanpulmonaryarterialpressure,mPAP)^25mmHg的一组临床病理生理综合征。肺动脉高压可以作为一种疾病而独立存在，更常见的是很多疾病进展到一定阶段的病理生理表现。由于肺血管重塑引起肺循环血流动力学改变，最终可导致右心衰竭，甚至死亡。这是一种极度恶性的疾病，七成多患者是年轻人，几乎每个人都知道癌症预后差，但没有人知道肺动脉高压室一种极度恶性疾病，它的病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强，其愈后是灾难性的，可以说，这种病就是心血管疾病中的癌症。这种疾病平均发病年龄是36岁，75%患者集中于20-40岁年龄段，还有15%患者年龄在20岁以下，几岁的孩子也会发病。世界上该病的发病率在IX1(Γ5IXΙΟ—6之间，其中约6%为家族性的。目前，ALKl基因突变的肺动脉高压患者患病年龄比骨形成蛋白2(BMPR2)基因突变的患者更加年轻化，一旦发病进展更加迅速，更加凶险。因此采用DNA检测寻找ALK-1基因突变有助于查清病因，识别家系中高风险的成员，以及未出生孩子的患病风险，这对提高人口素质，优生优育有重要的意义。对临床上指导用药，寻找病因，基因评估等具有重要的意义。
发明内容本发明的目的之一是提供一种用于检测ALK-1基因突变的引物组。ALK-1基因的第I到第10外显子区，3’UTR和启动子中的任意一个区域在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，都视为ALK-1基因发生了突变。因而，根据ALK-1基因第I到第10外显子区，3’UTR和启动子序列分别设计出能专一性鉴别ALK-1基因是否突变的特异性引物组。可通过PCR扩增和测序测定ALK-1基因上述区域是否发生改变，以鉴定ALK-1基因是否发生突变。因此，本发明的用于检测ALK-1基因突变的引物组可以是ALK-1基因第I到第10外显子区、3’UTR和启动子中任一区域对应的引物组。本发明第一个目的提供的用于检测ALK-1基因突变的引物组，包括ALK-1基因第I到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，即选自ALK-1基因第I到第10外显子区、3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组，具体地，所述引物组选自ALK-1基因的第I外显子区(Exonl)的PCR扩增引物组、第2外显子区(Exon2)的PCR扩增引物组、第3外显子区(Exon3)的PCR扩增引物组、第4外显子区(Exon4)的PCR扩增引物组、第5外显子区(Εχοηδ)的PCR扩增引物组、第6外显子区(Εχοη6)的PCR扩增引物组、第7外显子区(Εχοη7)的PCR扩增引物组、第8外显子区(ExonS)的PCR扩增引物组、第9外显子区(Εχοη9)的PCR扩增引物组、第10外显子区(ExonlO)的PCR扩增引物组、3’UTR的PCR扩增弓丨物组和启动子的PCR扩增弓丨物组中的任意一组，所述的上述各PCR扩增弓丨物组为表I所示。表1:ALK_1基因PCR扩增引物序列ATT,I~引物~~ΓΓ门扩增产物长度ALK-1_Γ1序列(5’—3’))予列表编14、j予可(bp)PFIGCATCATTTCCGTCTATTCTCASEQIDNO.1,1---589IiimJ■PRTCTCCCGATCCGCACTCSEQ1DN0.2(promcLcitPF2ATACCCCTGTGCTGAGTGCSEQIDN0.3-----708__PR2AAATGTTTCTTATTCCAGCGTCSEQIDN0.4__PF.3GCTGGGCAATAGGAAACGSEQ丨DNO.5Exonl---—-—-71bPR3GGACTGATCTGGGAAAGGTGSEQIDN0.6PF4TCATGGCTCTTACTCCACCTCSEQIDN0.7Exon^605^PR4TCATGGCTCTTACTCCACCTCSEQIDN0.8PF5GAGGGACAGTAGGACAGAAATGSEQIDN0.9Exon3---τ-7———569PR5GCTGCTCCGAAGGAGGTTSEQIDNO.1OExon4PF6~GCAGGACTCTGGGATCTAAC'T—SEQIDNOil60权利要求1.用于检测ALK-1基因突变的引物组，其特征在于，包括ALK-1基因的第I到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组包括所述启动子的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物PRl的引物组、具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的引物PF2和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物组；所述Exonl的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的引物组；所述Exon2的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4和具有SEQIDNO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物组；所述Exon3的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5和具有SEQIDNO.10所示的核苷酸序列的引物PR5的引物组；所述Exon4的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6和具有SEQIDNO.12所示的核苷酸序列的引物PR6；所述Exon5的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7和具有SEQIDNO.14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物组；所述Exon6的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8和具有SEQIDNO.16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物组；所述Exon7的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9和具有SEQIDNO.18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物组；所述Exon8的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PFlO和具有SEQIDNO.20所示的核苷酸序列的引物PRlO的引物组；所述Exon9的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFlI和具有SEQIDNO.22所示的核苷酸序列的引物PRll的引物组；所述ExonlO的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PF12和具有SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PR12的引物组；所述3’UTR的PCR扩增引物组包括具有SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PF13和具有SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PR13的引物组、具有SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PF14和具有SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PR14的引物组、具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PF15和具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PRl5的引物组。2.根据权利要求1所述的用于检测ALK-1基因突变的引物组，其特征在于，还包括ALK-1基因的第I到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR测序引物组，所述的PCR测序引物组包括所述启动子的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl和具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的引物PF2；所述Exonl的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3所述Exon2的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4所述Exon3的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5所述Exon4的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6；所述Exon5的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7；所述Exon6的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8；所述Exon7的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9；所述Exon8的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PFlO；所述Exon9的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFll；所述ExonlO的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PF12；所述3’UTR的PCR测序引物组包括具有SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PF13、具有SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PF14和具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PF15。3.权利要求1所述的PCR扩增引物组在制备通过PCR扩增自生物样品获得核酸样品检测ALK-1基因是否突变的试剂中的用途。4.包含权利要求1的引物组的用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括ALK-1基因的第I到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增引物组，所述的PCR扩增引物组如权利要求1所示。5.根据权利要求4所述的用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，其特征在于，还包含有权利要求2所述的PCR测序引物组。6.根据权利要求4或5所述的用于检测ALK-1基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括常规PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂和DNA测序试剂。7.一种使用权利要求1或2所述的引物组或者权利要求4或5所述的试剂盒对ALK-1基因的PCR扩增方法，其特征在于，取所述的ALK-1基因的第I到第10外显子区，3’UTR和启动子分别对应的PCR扩增引物组中的一组或两组以上的PCR扩增弓丨物组对ALK-1基因进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应包括30个扩增循环反应，其条件为变性温度9894°C，退火温度为5560°C，延伸温度72°C。8.根据权利要求7所述的ALK-1基因的PCR扩增方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应中每20μI的反应体系中使用O.2IμI的各引物和IO-1OOng模板DNA。9.根据权利要求7或8所述的ALK-1基因的PCR扩增方法，其特征在于，还包括PCR产物纯化步骤，所述产物纯化的条件为37°C孵育60min，70°ClOmin。全文摘要本发明公开了用于检测ALK-1基因突变的引物组，至少包括ALK-1基因第1到第10外显子区，3’UTR和启动子中任一区域对应的PCR扩增引物组和PCR测序引物组。本发明还公开了所述引物组的用途、包含所述引物组的试剂盒以及使用所述引物组对ALK-1基因进行PCR扩增方法。所述的引物组可以专一性鉴别ALK-1基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性。文档编号C12Q1/68GK102994628SQ20121025555公开日2013年3月27日申请日期2012年7月23日优先权日2012年7月23日发明者卢文菊,张晨婷,王健申请人:广州医学院第一附属医院