Amsh基因突变体及其应用
【专利摘要】本发明公开了AMSH基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码AMSH突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的方法，筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统，以及用于筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的试剂盒。其中，该分离的编码AMSH突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.364A>G突变。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患腓骨肌萎缩症。
【专利说明】
AMSH基因突变体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及AMSH基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离编码AMSH突变 体的核酸、分离的多肽、筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统、用于筛选易患腓骨肌萎 缩症的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。
【背景技术】
[0002] 腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth Disease, CMT)，又称遗传性运动感觉神经 病（hereditary motor and sensory neuropathy, HMSN)。CMT 是一组最常见的具有高度 临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病，主要影响运动神经元和/或感觉神经元以及 相关的Schwann cells。根据电生理标准，CMT主要分为两类：脱髓鞘型（CMT1)和轴突型 (CMT2)。CMT2又可分为14个亚型（CMT2A-CMT2N)。CMT患病率大概为1/2500,而CMT2A占 所有CMT病人的20-40 %。其中，CMT2A主要表现为远端肢体肌肉无力和/或萎缩，肢体远端 感觉丧失。后期手部出现骨间肌，大、小鱼际肌萎缩、形成猿手畸形、但萎缩一般不超过肘关 节以上，腿部的损伤先从腓肠肌开始，后逐渐扩展至骨间肌，小腿屈肌、最后累及大腿下1/3 肌肉，但其上部完全正常，形成"鹤腿"或倒置的酒瓶样畸形，因足背屈无力常呈马蹄内翻畸 形。本病可影响患者运动功能，难以进行精细的手指活动。严重患者需使用膝-踝-足矫 正器或轮椅。本病预后一般较好，病程进展缓慢，发病后仍能存活数十年。
[0003] 目前已经发现MFN2、KIF1B基因的突变与CMT2A发病相关，但是仍有许多患者病因 未明，其他基因的突变可能也是导致该疾病的病因。因而，目前对腓骨肌萎缩症尤其是其致 病基因的研究仍有待深入。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够有效筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的手段。
[0005] 本发明是基于发明人的下列工作完成的：
[0006] 发明人发现，目前的致病基因和致病突变挖掘的研究中，多使用全外显子组测序 法。全外显子组测序是利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然 后针对每个外显子进行深度测序的技术。利用外显子组测序找出孟德尔遗传病致病基因的 案例很多，比如2009年美国Sarah B Ng等人利用外显子组测序成功定位出mile综合症的 基因 DH0DH (可参见：Ki jima, K.，et al. , Mitochondrial GTPase mitofusin 2mutation in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A. Hum Genet, 2005. 116 (1-2): 23-27?，通过参照 将其全文并入本文）。我国Wang等人利用外显子组测序发现了小脑共济失调的新的突变 基因 TGM6(可参见：Zhao，C.，et al.，Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIFIBbeta. Cell, 2001. 105(5):587-597.，通过参照将 其全文并入本文）。随着外显子组测序技术的广泛应用和日渐成熟，一批新的致病基因（突 变）被相继发现，极大地推动了相关疾病诊断及治疗的研究进展。
[0007] 因而，发明人针对收集的一个五代CMT2A患者家系，通过外显子组测序、连锁分析 联合Sanger测序验证的方法进行致病突变挖掘和验证，最终确定了腓骨肌萎缩症的一个 新的致病基因--AMSH基因，以及其上的致病突变c. 364A>G突变。
[0008] 进而，根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码AMSH突变体的核 酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0:1相比，具有c. 364A>G突变，即相对于野 生型AMSH基因，本发明的AMSH基因突变体的cDNA序列第364位碱基A突变为G。根据本 发明的实施例，发明人确定了 AMSH基因的突变体，该突变体与腓骨肌萎缩症的发病密切相 关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患腓 骨肌萎缩症。
[0009] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与 SEQ ID N0:2相比，所述分离的多肽具有P.N122D突变，即该突变是由于c. 364A>G突变而 引起的，具体地，相对于野生型AMSH，本发明的分离的多肽（即AMSH突变体）的氨基酸序列 第122位氨基酸天冬酰胺突变为天冬氨酸。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有 效地检测生物样品是否易患腓骨肌萎缩症。
[0010] 根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的 系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生 物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相 连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判 断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列， 与SEQ ID N0:1相比，是否具有c.364A>G突变，判断所述生物样品是否易患腓骨肌萎缩症。 利用该系统，能够有效地筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品。
[0011] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样 品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测AMSH基因突变体的试剂，其中 与SEQ ID N0:1相比，该AMSH基因突变体具有c. 364A>G突变。利用根据本发明的实施例 的试剂盒，能够有效地筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品。
[0012] 根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构 建体包含前面所述的分离的编码AMSH突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体 细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗腓骨肌萎缩症的药物。
[0013] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利 用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗腓骨肌萎缩症的药物。
[0014] 根据本发明的第七方面，本发明还提出了一种构建药物筛选模型的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前面所述的编码AMSH突变体的 核酸。由此，利用本发明的药物筛选模型，能够有效地筛选治疗腓骨肌萎缩症的药物。
[0015] 需要说明的是，本发明发现的CMT2A的一个新致病基因AMSH的致病突变 c. 364A>G，可以用于早期筛查CMT2A致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干 预治疗；也可用于CMT2A的分子诊断及与相关疾病的的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简 便、早期诊断率高，检测结果可以为腓骨肌萎缩症的早期诊断、鉴别诊断及开发腓骨肌萎缩 症治疗药物提供科学依据。
[0016] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0017] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0018] 图1显示了根据本发明实施例的筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统及其 组成部分的示意图，其中，
[0019] 图II为根据本发明实施例的筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统的示意 图，
[0020] 图III为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，
[0021] 图1III为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；
[0022] 图2显示了根据本发明一个实施例的腓骨肌萎缩症患者家系的家系图；
[0023] 图3显示了根据本发明的一个实施例，图2所示腓骨肌萎缩症患者家系中健康成 员和先证者，以及家系外正常人的AMSH基因c. 364A>G突变位点的代表性Sanger测序验证 峰图。
【具体实施方式】
[0024] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0025] AMSH基因突变体
[0026] 根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码AMSH突变体的核酸。根据 本发明的实施例，所述核酸与SEQ ID N0 :1相比，具有c. 364A>G突变。
[0027] 在本文中所使用的表达方式"编码AMSH突变体的核酸"，是指与编码AMSH突变体 的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与AMSH突变体的 编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或 cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码AMSH突变体的核酸为DNA。根据本发明 的实施例，发明人确定了 AMSH基因的突变体，该突变体与腓骨肌萎缩症的发病密切相关， 从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患腓骨肌 萎缩症，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患 腓骨肌萎缩症。
[0028] 对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包 括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况 下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID N0 :1，实际 包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0029] 该编码AMSH突变体的核酸，是本申请的发明人通过外显子组测序、连锁分析联合 Sanger测序验证的方法确定的腓骨肌萎缩症的致病基因AMSH的新的致病突变。该致病突 变位点在现有技术中并未被提到。
[0030] 其中，野生型AMSH基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：
[0032] 其编码的蛋白质具有如下所示的氨基酸序列：
[0034] 发明人发现的AMSH基因突变体与SEQ ID N0:1相比，具有c. 364A>G突变，即相对 于野生型AMSH基因，本发明的AMSH基因突变体的cDNA序列第364位碱基A突变为G。由 此，其所编码的产物与野生型的AMSH相比，具有p. N122D突变，即该突变是由于c. 364A>G 突变而引起的，具体地，相对于野生型AMSH，本发明的分离的多肽（即AMSH突变体）的氨基 酸序列第122位氨基酸天冬酰胺突变为天冬氨酸。
[0035] 目前，尚未见AMSH基因为腓骨肌萎缩症的致病基因，AMSH基因的c. 364A>G突变 为腓骨肌萎缩症的致病突变的相关报道。
[0036] 根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与 野生型AMSH相比，该分离的多肽具有p. N122D突变，即该突变是由于c. 364A>G突变而引起 的，具体地，相对于野生型AMSH，本发明的分离的多肽（即AMSH突变体）的氨基酸序列第 122位氨基酸天冬酰胺突变为天冬氨酸。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离 的编码AMSH突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测 生物样品是否易患腓骨肌萎缩症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有 效地预测生物体是否易患腓骨肌萎缩症。
[0037] 筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统和试剂盒
[0038] 根据本发明的第三方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易患腓骨肌萎 缩症的生物样品的方法的系统。
[0039] 参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统 1000包括核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。
[0040] 根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。根据本 发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生 物样品AMSH是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人 体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而 能够进一步提高筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所 使用的术语"核酸样本"应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中AMSH是否存在 突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包 含AMSH编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提 取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物 样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患 腓骨肌萎缩症的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别 限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录 单元102,其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单 元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构 成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患腓骨肌萎缩症的生物 样品的效率。
[0041] 根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核 酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样 本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以采用测序的 方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置 200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核 酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库 进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。
[0042] 关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不 同的测序平台进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina 公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb 2010)或 Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063;Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和 设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
[0043] 需要说明的是，在这里所使用的术语"核酸序列"应作广义理解，其可以是在对核 酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采 用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列 中含有对应AMSH的编码序列即可。
[0044] 另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集AMSH外显子，该筛选 富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。由此， 文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设 置有AMSH外显子特异性引物，以便利用AMSH外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR 扩增。由此，可以通过PCR扩增，富集AMSH外显子，从而能够进一步提高筛选易患腓骨肌萎 缩症的生物样品的效率。根据本发明的具体实施例，AMSH外显子特异性引物具有如SEQ ID NO :3和4所示的核苷酸序列：
[0045] 正向引物：5'-GAAGTAGCAGGTATGGTACAGTA-3'（SEQ ID N0 :3);
[0046] 反向引物：5' -ATCTGTGTTACAACCCTGAGC-3'（SEQ ID NO :4)。
[0047] 发明人惊奇地发现，通过采用上述引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成 对AMSH外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4所示的核苷酸序 列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。
[0048] 根据本发明的实施例，可以用于进行测序的设备并不受特别限制。根据本发明的 实施例，可以采用第二代测序平台，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序平台。 根据本发明的具体示例，测序单元202可以为选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装 置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测 灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步 提尚对核酸样本进彳丁检测分析的效率。从而，提尚后续对测序数据进彳丁分析时的精确性和 准确度。
[0049] 根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样 本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0 :1的区别判断生物样 品是否易患腓骨肌萎缩症。由此，利用该系统，能够有效地筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样 品。
[0050] 具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 364A>G突变， 判断生物样品是否易患腓骨肌萎缩症。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核 酸序列与SEQ ID N0 :1相比，具有c. 364A>G突变，是生物样品易患腓骨肌萎缩症的指示。 根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID N0 :1进行比对的设备并不受特别限制，可以采 用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。
[0051] 根据本发明的第四方面，本发明提出了一种用于筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样 品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的试剂盒包 括：适于检测AMSH基因突变体的试剂，其中与SEQ ID N0 :1相比，该AMSH基因突变体具有 c. 364A>G突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易患腓骨肌萎缩症的 生物样品。在本文中，所使用的术语"适于检测AMSH基因突变体的试剂"应做广义理解，即 可以是检测AMSH编码基因的试剂，也可以是检测AMSH突变体多肽的试剂，例如可以采用识 别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针或引物，优选地，所 述核酸探针或引物具有如SEQ ID N0 :3-4所示的核苷酸序列。由此，可以高效地筛选易患 腓骨肌萎缩症的生物样品。
[0052] 需要说明的是，在本文前面筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统部分中所描 述的特征和优点，同样适用于筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的试剂盒，在此不再赘述。
[0053] 构建体及重组细胞
[0054] 根据本发明的第五方面，本发明还提出了一种构建体。根据本发明的实施例，该构 建体包含前面所述的分离的编码AMSH突变体的核酸，即本发明的AMSH基因突变体。由此， 利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗腓骨肌萎缩 症的药物。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物 细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
[0055] 在本发明中所使用的术语"构建体"是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序 列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构 建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片 段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线 性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本 发明中所使用的术语"核酸"可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包 括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构 建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于 操作。
[0056] 根据本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该 重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够 表达构建体所携带的AMSH基因突变体。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细 胞，能够有效地筛选治疗腓骨肌萎缩症的药物。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受 特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动 物。
[0057] 构建药物筛选模型的方法
[0058] 根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本 发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的编码AMSH突变体的核 酸。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例， 利用本发明的药物筛选模型，能够有效地筛选治疗腓骨肌萎缩症的药物。
[0059] 需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的 至少一部分细胞表达前述的AMSH基因突变体即可。例如，可以用采用基因转化的方法，将 前面所述的本发明的构建体转入受体动物（非人），从而使达动物的至少一部分细胞表达 前述的AMSH基因突变体；也可以采用无标记转基因技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术、定点 整合技术等，使受体动物的AMSH基因发生c. 364A>G突变，并有效表达前述的多肽，从而该 受体动物能够发生腓骨肌萎缩症，进而能够有效地用于筛选治疗腓骨肌萎缩症的药物，也 即能够有效用作药物筛选模型。
[0060] 需要说明的是，本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个CMT2A患者 家系进行全基因组外显子组测序分析，从而发现了一个CMT2A新的致病基因AMSH，以及该 基因上的致病突变。由此，本发明丰富了 AMSH基因的致病基因和致病突变图谱，进一步阐 明了腓骨肌萎缩症的分子发病机制，对于腓骨肌萎缩症的早期致病基因筛查和干预治疗提 供科学依据。
[0061] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明 性的，而不能理解为对本发明的限制。
[0062] 若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为 可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来 源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特 殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0063] 实施例1确定腓骨肌萎缩症致病突变
[0064] 1、样本收集
[0065] 发明人在山东省兖州、威海市发现一个CMT家系，其家系图见图2。如图2所示，其 中，〇表示正常女性，□表示正常男性，表示男性患者，?表示女性患者，箭头所指为先证 者（Y-04)。
[0066] 该CMT2A家系包含29个成员，其中CMT2A患者5名。先证者（Y-04)经北京大学 第三附属医院神经内科确诊为CMT2A。先证者主要表现为约30年前（16-17岁）开始出现 走路慢，25-26岁起易跌倒，渐加重，3年后开始影响日常生活，写字费力，双手小肌肉萎缩， 右手及左腿为著，无明显感觉异常及麻木等，偶有肉跳及抽筋感，曾有言语不清，后缓解，无 呼吸困难、吞咽困难及呛咳。既往：幼年发育正常，无痴呆及认知障碍家族史。查体：神清语 利，无明显舌肌萎缩及纤颤，吸吮、下颂反射未引出；余颅神经（_);鹤腿征，双手大鱼际肌、 骨间肌萎缩，左下肢背屈差，四肢近端肌力V级，上肢反射低，下肢反射未引出；腹壁反射未 引出（略有肥胖）；胸肌反射阴性，病理征阴性；四肢远端针刺觉减退（上肢6-7分，下肢5 分）。所有家庭成员患者都存在相同的临床表现，在家族中该疾病呈常染色体显性遗传。
[0067] 发明人采集了该家系中在世的所有成员的外周血，所有血样均签属知情同意书， 并获得伦理委员会批准。
[0068] 2、目标区域捕获测序
[0069] 发明人利用 Aglient SureSelect Human All Exon kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)结合Solexa高通量测序技术，对上述腓骨肌萎缩症 患者家系中的3名患者（Y-05、Y-14、Y-04)和1名正常人（Y-01)的外显子组序列进行了测 序，其中以200名家系外正常人作为对照。
[0070] 具体如下：
[0071] 2.1DNA 提取
[0072] 取上述腓骨肌萎缩症患者家系中的3名患者（Y-05、Y-14、Y-04)和1名正常人 (Y-01)的外周血，分别采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品 中提取基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得各基因组DNA的0D 26。/ 〇D2S。均应位于1. 7-2. 0之间，浓度不少于200纳克/微升，总量不少于30微克。
[0073] 2.2目标区域捕获与测序
[0074] 利用超声波仪（CovarisS2, Massachusetts, USA)将各基因组DNA样本随机打断 成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接 头制备文库（可参见：http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明 书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过连接介导PCR(ligation_mediated PCR，LM_PCR)的线性扩增与捕获试剂SeqCap EZ Oligo pool进行杂交富集，再经过LM-PCR 的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为 Illumina Hiseq2000,读取长度为90bp，各样本的平均测序深度最少为50X。
[0075] 3、变异检测、注释及数据库比较
[0076] 利用Illumina basecalling Software 1. 7对上述获得的原始测序数据进行 处理，经过过滤去污染后，使用S0APaligner/S0AP2(可参见：Li R, Li Y, Kristiansen K, et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R, Yu C, Li Y, ea al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009, 25 (15): 1966-1967,通过参照将其全文并 入本文）比对到参考基因组UCSC NCBI37/hgl9,以便获得比对到基因组上的唯一比对序 列。然后利用 SOAPsnp (可参见：Li R，Li Y，Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res 2009, 19 (6):1124-1132， 通过参照将其全文并入本文）确定靶区域的基因型。
[0077] Indel (insertion-deletion，插入 / 缺失标记）米用 BWA (通过 Burrows-Wheeler 变换比对）（version 0.5. 9-rl6)比对到参考基因组Hgl9(snpl32)，然后利用GATK(Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0? 4705)确定 indel 的类型（可参见：Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2010 ；26 (5):589-595 ；McKenna, A, Hanna M, Banks E, et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 2010 ;20 (9): 1297-1303.，通过参照将其全文并入本 文）。
[0078] 结果发现，样品Y-01有114150个单核苷酸多态性（SNPs)和7952处的插入/缺 失；样品Y-04中有118247个单核苷酸多态性（SNPs)和8000处的插入/缺失；样品Y-05中 有110759个单核苷酸多态性（SNPs)和7812处的插入/缺失；样品Y-14中有117892个单核 苷酸多态性（SNPs)和7907处的插入/缺失。随后通过dbSNP数据库（http://hgdownload. cse. ucsc. edu/goldenPath/hgl9/database/snpl32. txt. gz)，HapMap 数据库（ftp://ftp. ncbi. nlm. nih. gov/hapma p)，千人基因组数据库（ftp://ftp. lOOOgenomes. ebi. ac. uk/ voll/ftp)，炎黄数据库（http://yh.genomi cs. org.cn/)等公共数据库的过滤，去掉所有 已知的且在数据库中等位基因频率大于0. 005的变异（变异MAF值高，通常为不致病的普 通多态性），并利用SIFT软件进行SNP功能预测。
[0079] 然后根据遗传模式是常染色体显性且假设为全外显率的情况下，选择在三个患者 (Y-05、Y-14、Y-04)中存在，在正常对照（Y-01)中不存在的罕见杂合突变作为候选基因。定 位至AMSH基因上一个杂合错义突变c. 364A>G，p. N122D。
[0080] 进一步，Sanger验证发现，AMSH基因的c. 364A>G突变在该家系成员的3个患者 (Y-05、Y-14、Y-04)和1个家系内正常人（Y-01)中存在共分离。并且，这个突变在200例 正常人群中不存在突变。
[0081] 其中，已知 AMSH (associated molecule with the SH3domain of STAM)属于 金属蛋白酶JAMM(JABl/MPN/Mov34)家族的一个去泛素化蛋白酶，可选择性切除lysine 63 (K63)联接的多聚泛素化肽链的泛素，而对lysine 48 (K48)联接的泛素没有作用。AMSH 含有多个功能结构域：MIT domain (microtubule-interacting and transport domain)， SBM(SH3binding motif)， JAMM motif， NLS(nuclear localization signal)， DUR(the distal ubiquitin recognition site)，其中 JAMM motif 为 AMSH 去泛素化蛋白酶活性区 域。AMSH通过其功能结构域与其它分子相互作用，参与多个生物学过程：
[0082] 1)负调节受体下调机制：G蛋白偶联受体（GPCRs)、受体酪氨酸激酶（RTKs)如 EGFR、Trk等受体与细胞因子结合后，为防止受体持续激活对细胞造成的损害，激活受体 内吞并被E3连接酶c-Cbl泛素化，泛素化受体与Hrs-STAM复合物相互作用，在早期内吞 体（endosome)中被分选出来，依次与 ESCRT(endosomal sorting complex required for transport)-1，-II, -III复合物作用形成多泡体（MVBs)，进而与溶酶体融合后受体在溶酶 体内被水解而下调激活受体。AMSH通过其SH3结构域与STAM结合，去除受体的泛素化，去 泛素化后的受体不被溶酶体降解而进入再循环利用过程。
[0083] 2)维持ESCRT-III复合物正常功能：ESCRT-III复合物是MVBs分选途径中重要 成员，参与泛素化蛋白的稳态调节，在细胞膜、高尔基网状结构和溶酶体间蛋白运输发挥关 键作用。AMSH通过其MIT结构域与ESCRT-III复合物多个分子（CHMP1A，CHMP1B，CHMP2A， CHMP3)相互作用，发挥ESCRT-III复合物正常功能。
[0084] 3)调节多个信号通路：AMSH又称信号传导衔接分子结合蛋白STAMBP (signal transducing adaptor molecule binding protein)，可与 Grb2 和 PI3K 相互作用，分别参 与RAS-MAPK，PI3K-AKT-mT0R信号通路。在TGF-0信号通路中，AMSH可与Smad6结合，并 通过阻碍Smad6与BMP I型受体及Smadl的结合，从而诘抗Smad6对信号通路的抑制效果， 延缓由BMP-7介导的Smadl磷酸化。BMP信号还可以通过JNK或者p38MAP激酶使AMSH磷 酸化，削弱AMSH对Smad6的诘抗效果。
[0085] 4)参与自噬通路：自噬是一种由溶酶体介导的细胞内过多或异常蛋白质的降解 机制。自噬体成熟需要与MVBs融合，而具有正常功能的ESCRT-III复合物是MVBs形成所 必需的。AMSH通过维持ESCRT-III复合物正常功能参与自噬通路调节。
[0086] 由此，发明人认为，AMSH基因为腓骨肌萎缩症的致病新基因，AMSH基因的 c. 364A>G(p. N122D)突变，为腓骨肌萎缩症的致病突变。
[0087] 实施例2Sanger法测序验证
[0088] 分别对实施例1中所述的腓骨肌萎缩症患者家系中的所有家系成员（包括患者和 正常家属），以及200名家系外正常人的AMSH基因进行检测：针对AMSH基因的c. 364A>G突 变设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和测序的方法获得突变位点有关序列，根据确定 序列测定结果属于突变型还是野生型，验证AMSH基因及该突变与腓骨肌萎缩症之间的相 关性。
[0089] 具体方法步骤如下：
[0090] 1、DNA 提取
[0091] 按照实施例1中所述的提取DNA的方法，分别提取制备受试者外周静脉血中的基 因组DNA，备用。
[0092] 2、引物设计及PCR反应
[0093] 首先，参考人类基因组序列数据库hgl9/build36. 3,设计得到具有SEQ ID N0:3-4 所示核苷酸序列的AMSH基因外显子特异性引物，具体序列如下：
[0094] 正向引物：5'-GAAGTAGCAGGTATGGTACAGTA-3'（SEQ ID N0 :3);
[0095] 反向引物：5' -ATCTGTGTTACAACCCTGAGC-3'（SEQ ID NO :4)。
[0096] 接着，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反 应：
[0097] 反应体系（50 y 1):
[0098] 10X Pl'u bulTcr 5fjJ dNTP(2.5mM) 5^1 正向引物（20pM) 1^1 反向引物（2〇nM) 1私1 DNA模板 1蚪 Pfu DNA 聚合酶（2-3U4U) 2^1 水 35(al
[0099] PCR反应条件：
[0100]
[0101] 由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。
[0102] 3、测序
[0103] 将步骤2中获得的各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物直接进行DNA测序。 其中，测序采用ABI3730型测序仪进行。
[0104] 基于测序结果，在本发明的腓骨肌萎缩症患者家系中对AMSH基因的该突变位点 进行突变排查，结果发现该家系中所有患者均携带c. 364A>G(p. N122D)的杂合突变，而其 正常家属以及200例家系外正常人群均不携带该突变。其中，图3显示了上述腓骨肌萎缩 症患者家系中先证者和家系内健康成员，以及家系外正常对照的AMSH基因c. 364A>G突变 位点的代表性Sanger测序验证峰图。
[0105] 由此，进一步证明AMSH基因为腓骨肌萎缩症的致病基因，AMSH基因的c. 364A>G突 变为该病的致病突变。
[0106] 实施例3检测试剂盒
[0107] 制备一检测试剂盒，其包含能够检测AMSH基因的c. 364A>G突变的引物，用于筛选 易患腓骨肌萎缩症的生物样品，其中这些引物为AMSH基因外显子特异性引物，其序列如实 施例2中所述SEQ ID NO :3-4所示。
[0108] 利用上述试剂盒筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的具体步骤为：按照实施例1 步骤2的2. 1"DNA提取"中所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述AMSH 基因的外显子特异性引物进行PCR反应（PCR反应体系和反应条件参见实施例2)，并按照本 领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列 是否具有c. 364A>G突变，能够有效地检测本发明的AMSH基因突变体在待测者DNA中是否 存在，从而能够有效地检测待测者是否易患腓骨肌萎缩症，进一步，能够从待测者中筛选出 易患腓骨肌萎缩症的生物样品。
[0109] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0110] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种分离的编码AMSH突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQ ID NO :1相比， 具有c. 364A>G突变， 任选地，所述核酸为DNA。2. -种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO :2相比，所述分离的多肽具有p. N122D 突变， 任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。3. -种筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的系统，其特征在于，包括： 核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本； 核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核 酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列； 判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核 酸序列或其互补序列，与SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 364A>G突变，判断所述生物样品是 否易患腓骨肌萎缩症。4. 根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括： RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及 反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转 录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。5. 根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括： 文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及 测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测 序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。6. 根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述文库构建单元进一步包括： PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有AMSH基因外显子特异性引物，以便利用所述 特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增， 任选地，所述特异性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列， 任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子测序装置的至少一 种。7. -种用于筛选易患腓骨肌萎缩症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有： 适于检测AMSH基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO :1相比，所述AMSH基因突变体具 有c. 364A>G突变， 任选地，所述试剂为核酸探针或引物， 任选地，所述核酸探针或引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列。8. -种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码AMSH突变体的核酸。9. 一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过权利要求8所述的构建体转化受 体细胞而获得的。10. -种构建药物筛选模型的方法，其特征在于，包括： 使动物的至少一部分细胞表达权利要求1所述的核酸， 任选地，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。
【文档编号】C12Q1/68GK105821062SQ201510013105
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】刘少君, 戴兰兰, 刘勇, 谌于蓝, 陈玉剑, 张建国, 阙海萍
【申请人】深圳华大基因科技有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所