Rb和p53基因的突变型及其应用的制作方法

专利名称：Rb和p53基因的突变型及其应用的制作方法
背景技术：
发明领域本发明一般涉及细胞生长和增殖性疾病的调控领域，较具体地，本发明涉及RB-1和p53基因的突变型及其治疗应用。
相关技术的描述细胞增殖的控制是一个复杂的过程，包括多个相互作用成分。一个细胞的生长与否依赖于起负向作用和起正向作用的生长调控基因表达的平衡。当起负向作用的生长调控基因在细胞中表达或将该基因提供给某一细胞时，将抑制细胞生长。当起正向作用的生长调控基因在细胞中表达或将该基因提供给某一细胞时，将促进细胞增殖。
最近，鉴定出一些起负向作用的生长调控基因即肿瘤抑制基因，它们对细胞的增殖具有负效应。这些基因包括(但不局限于)人成视网膜细胞瘤基因RB-1和p53基因。一些负生长调控基因的缺乏或失活与某些种类的癌肿相关。
人成视网膜细胞瘤基因RB-1是这类肿瘤抑制基因的原型。细胞中该基因的双等位基因缺乏或基因表达受抑制或其基因产物的抑制将致瘤或引起异常的细胞增殖。在分子水平上，RB-1双等位基因丢失或失活与成视网膜细胞瘤等肿瘤临床表现以及如骨肉瘤、纤维肉瘤、软组织肉瘤和黑素瘤等临床上相关肿瘤有关。此外，RB-1功能丢失与其它一些原发性癌肿如原发性小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌和前列腺癌关联。
肿瘤抑制基因Rb和p53抑制癌细胞和非癌细胞的增殖在许多不同的肿瘤细胞类型中，RB-1或p53野生型cDNA的再导入显示能部分地恢复正常生长调控作用，因为重新导入的基因会诱导生长抑制或阻滞。Rb基因作为肿瘤抑制基因是因为Rb基因的一个等位基因失活会导致易发生癌肿。然而，Rb基因的生长抑制效应并不仅限于肿瘤细胞。正常的含有2份Rb基因拷贝的细胞在一定的生长条件下引入额外的Rb基因拷贝会导致生长抑制或阻滞。类似地，已有文献报道野生型p53能抑制非癌细胞的生长。因此，由Rb和p53控制的步骤可能并非直接地影响致瘤性表型，而是影响控制肿瘤和正常细胞生长的步骤。
正常细胞病理性增殖的机理由于存在大量不同的病理性细胞增殖情况，因此，需要有一些新的针对这些情况的方法提供治疗疗效。这些病理性情况可以发生在几乎所有能发生异常细胞增殖的细胞中。这些能表现病理的或异常生长的细胞类型有(1)成纤维细胞、(2)血管内皮细胞和(3)上皮细胞。由上述可见，需要有方法来治疗个体的几乎所有器官和组织系统中的局部或弥漫性病理情况。
例如单就眼睛而言，新的方法用于治疗各种不同的由正常的、良好的或恶性的细胞或组织异常增殖引起的病理疾病情况，其中包括(但不局限于)眼睛的纤维增殖、血管增殖和/或致瘤性疾病早熟视网膜病、增殖性玻璃体视网膜病、增殖性糖尿病视网膜病、毛细血管瘤、脉络膜新生血管网、视网膜下新生血管网、视网膜下新生血管化、角膜新生血管化引起的老年黄斑退化、上视网膜膜增殖引起的黄斑皱褶、核性硬化引起的成年人白内障、创伤或手术后的纤维性向内生长、视神经胶质瘤、多发性血管瘤视网膜、新生血管性表光眼、海绵状血管瘤、虹膜发红、镰形细胞增殖视网膜病、眼手术或受伤后上皮细胞向下生长、后发性白内障膜、乳头状瘤、地中海贫血伴视网膜新生血管化、弹性假黄瘤引起的视网膜下新生血管化以及I型和II型多发性神经纤维瘤、成视网膜细胞瘤、眼色素层黑素瘤和眶假瘤。本发明应用到的其它良性细胞增殖疾病包括(但不局限于)牛皮癣、鳞癣、乳头状瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌和Stevens-Johnson综合症。
应该注意到，正常细胞具有两个Rb和两个p53正常等位基因，当在组织培养的生长条件下供给细胞生长因子时，这两种基因的野生型蛋白质不能阻止细胞增殖。病理情况下静止细胞的失控增殖也是由于细胞暴露于由病理状态诱发的生长因子(见下述)。例如地中海贫血患者的眼睛中血管的失控增殖如果不停止，将导致视网膜脱离。将额外的Rb基因或p53基因拷贝导入这样的细胞可能或不可能充分地抑制细胞生长。事实上，外源Rb基因导入许多肿瘤细胞只是滞缓细胞的生长率，而不是完全阻止。先前报道的细胞株如Saos-2和DU145是这种现象的良好例子。可能需要导入更多的基因拷贝，但是一方面很难控制需要被导入或能够被导入的拷贝数目。另一方面，生长因子的暴露可能导致表达的Rb蛋白的失活。
通过磷酸化调控Rb蛋白的活性如果生长抑制基因的失活是去除针对细胞生长的限制因素中的一个基本步骤，那么一定存在一些机制来调控这些基因产物的活性以使细胞以可控方式增殖。可以设想，一个给定的生长抑制基因的表达可能在质量或数量方面受到调控。就Rb基因来说，处于稳态状态的蛋白质水平与细胞体积之比在整个细胞周期中恒定。Rb蛋白浓度的无变化提示一定有其它一些机制使得一个细胞能调控这种蛋白的活性。有一些证据显示Rb蛋白(pRb)的活性受到它的磷酸化状况调控。各种生长促进和抑制因子通过微扰生长抑制基因产物如Rb蛋白的磷酸化而发挥它们的效应。在诱导Rb蛋白磷酸化中生长促进因子起作用的证据是，观察到在静态细胞中Rb蛋白以低磷酸化(underphosphorylated)形式存在。此外，当静态细胞通过暴露于血清或生长因子如EGF以及胰岛素和运铁蛋白而受刺激增殖时，Rb蛋白的绝大多数形式在G1期的是低磷酸化的，但当细胞进入G1/S界相期时，则变成高磷酸化。这些数据表明，Rb蛋白是受到血清或生长因子诱导的信号转导途径中的靶目标。最后，不能对生长因子的增殖促进效应作出应答的衰老的人成纤维细胞，也不能使Rb蛋白磷酸化。
也有证据显示生长抑制因子在Rb蛋白磷酸化的负调控中所起的作用。当用视黄酸或维生素D3、二甲基亚砜(DMSO)和其它分化诱导剂处理活跃生长的白血病或成神经细胞瘤细胞时，发现Rb蛋白在G1早期时细胞生长抑制开始前低磷酸化，并且诱导分化。此外，用旁分泌生长抑制转多肽生长因子β1(TGFβ1)治疗肺上皮细胞可导致Rb蛋白磷酸化的负调控并伴随着G1后期中细胞生长的抑制。总之，这些数据提示Rb蛋白的低磷酸化形式活跃地抑制细胞跨越G1/S界相期，同时在G1期被激活的一种激酶(S)能失活Rb蛋白从而使细胞可以进入S期。
尽管在肿瘤细胞中通过缺失或突变永久性地去除Rb基因，可允许生长。在具有正常Rb基因表达的正常细胞中，都是通过Rb基因产物即Rb蛋白(pRb)的细胞周期依赖的转译后修饰来去除针对生长的限制因素。pRb以多磷酸化形式存在，有证据表明低磷酸化形式是活性形式。例如，SV40大T抗原优先与Rb蛋白的低磷酸化形式结合。Rb蛋白的磷酸化使它从SV40大T抗原中释放出，只有pRb的低磷酸化形式结合着且抑制从E2启动子处开始的转录。因此，Rb蛋白的低磷酸化形式活跃地抑制细胞生长，而细胞增殖与Rb蛋白的高磷酸化相关。各种生长促进和抑制因子可能通过微扰Rb蛋白的磷酸化而发挥它们的效应。虽然一个正常细胞可能正在表达Rb蛋白，但是当它暴露于适宜的生长因子时被诱导生长，就如同可能在各种生长状况包括病理情况下所发现的那样。在某些病理情况下，一个原本正常的细胞可能不利地被诱导增殖。糖尿病视网膜病患者眼睛中的正常静态成纤维细胞的增殖是这种不期望的细胞生长诱导的一个例子。不加治疗，增殖的成纤维细胞将最终与视网膜结合，导致视网膜的快速脱离。
p53蛋白的激活类似于Rb基因，p53基因的失活或突变常见于肿瘤和非肿瘤细胞。与病毒抗原如SV40大T结合时，野生型p53蛋白也是负调控型的。p53蛋白作为转录因子发挥功能，它结合至特异的DNA序列。野生型p53蛋白与DNA结合的能力是其功能正常发挥的关键。在突变型p53中，丢失了蛋白质结合至特异的DNA靶序列或激活转录的能力，这暗示这些活性对蛋白质的抑制功能是重要的。然而，最近也有报道显示p53蛋白的序列特异性DNA结合活性具有隐蔽性。新合成的p53蛋白没有活性，除非该蛋白被修饰，否则它不能与其特异的DNA序列结合。一个修饰位点是C端的365-393氨基酸残基。这一区域是RNA成分的附着位点，也是细菌热休克蛋白dnaK的结合部位。当抗体Pab421与365-389氨基酸残基结合后，蛋白质因构象改变被激活，从而能与其特异的DNA序列结合。
pRb和p53作用方式的差异虽然Rb和p53两者被认为是肿瘤抑制基因，但是它们的作用方式非常不同。先前有证据表明两种基因可能以不同的途径发挥作用。没有Rb基因的鼠呈胚胎致死，而没有p53基因的鼠虽然对癌肿的发生具有较高的易感性，但是能够正当发育。在细胞水平上，缺乏p53的癌细胞能通过甚至在没有外源p53情况下的Rb基因的过量表达而受到生长抑制或阻滞。另一方面，缺乏Rb的细胞对p53基因的生长抑制效应易感。在分子水平上，p53和pRb(直接或间接地)与不同的蛋白质靶和DNA序列相互作用。
Rb和p53基因在治疗中的应用虽然这两种蛋白在作用方式上有差异，但是它们在一方面是相似的，即在实验条件下，两种蛋白活性形式的过量表达导致细胞生长的抑制或阻滞。已知细胞生长受到抑制基因如Rb和p53表达的控制，同时，它们的蛋白必须呈活性构象才能发挥功能，因此可将这些基因的活性形式用于基因治疗。就pRb来说，新合成的蛋白是低磷酸化和具活性的。当细胞暴露于生长因子时可能发生失活。理想的是具有pRb的突变型形式，其维持活性形式，对磷酸化引起的失活具有抗性。就p53来说，新合成的蛋白没有活性，除非其被修饰，否则不能结合DNA。在基因治疗中，非常理想的是具有p53基因的突变型形式，它的蛋白质甚至无需进一步的修饰已呈活性。最后，因为两种蛋白具有不同的作用方式，理想的是在治疗中结合使用Rb和p53基因两者，从而使细胞对一种基因的生长抑制效应产生抗性的突变或生长状态可能对另一种基因易感。
已有技术的缺陷在于，缺少突变的肿瘤抑制基因，以致当细胞暴露于生长因子时，基因产物(蛋白质)永久地具有活性并发挥功能。更具体地，已有技术的缺陷在于没有p53和Rb基因的有效和功能性的突变形式。已有技术的缺陷还在于，将Rb和p53基因的野生型和/或突变型形式同时应用于癌和非癌细胞增殖疾病。
发明概况一方面，本发明提供一种治疗诸如存在于非癌细胞增殖疾病和癌细胞增殖疾病中的不适当的或病理性的细胞生长的通用方法。更具体地，本发明通过施用突变的生长抑制基因和/或基因产物来提供治疗病理生理性细胞增殖疾病的方法。
在本发明的一个例子中，提供了一种分离的DNA分子，所述分子是在功能上有活性的突变的生长抑制基因形式或是不同突变生长抑制基因的组合。
在本发明的另一个例子中，提供了一种新的含有在功能上具有活性的成视网膜瘤或p53基因突变型的质粒。
在本发明的又一个例子中，提供了为达到治疗目的，连续地或同时地施用Rb和p53基因的野生型和/或活性突变型的方法。
在本发明的其它例子中，提供了治疗病理性细胞增殖疾病的方法，包括同时或连续地给非癌增殖细胞施用突变的Rb基因和突变的p53基因。
此外，还提供了治疗个体恶性细胞疾病的方法，包括同时或连续地给增殖的癌细胞施用突变的Rb基因和突变的p53基因。
通过下面目前本发明的优选实施例，本发明的其它方面、特征和优越性将更明显。这些实施例用于公开目的。
附图简述

图1为应用多克隆抗Rb抗体RB1-Ab#18和#20，通过细胞蛋白的免疫沉淀作用发现pRb和p53之间的同源区域。
图2为应用多克隆抗Rb抗体RB1-Ab#18和#20，通过细胞蛋白的免疫沉淀作用证实pRb和p53之间的同源区域。
图3显示无Pab421时，P1、P3、P5突变型p53蛋白与特异的DNA序列结合的能力。
图4为与野生型蛋白即(A)体内标记蛋白和(B)体外标记蛋白的磷酸化格局(pattern)二维图谱相比，显示突变型Rb蛋白磷酸化格局的二维图谱分析。
图5显示成视网膜细胞瘤蛋白与SV40大T抗原的结合以及磷酸化后该结合物的解离。
图6显示磷酸化的成视网膜细胞瘤蛋白的二种不同形式(与SV40大T抗原结合和不结合)的二维图谱分析。
图7显示在不同的生长条件下成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化格局变化的二维图谱分析。
图8显示m89 Rb突变型抑制正常细胞WS1生长的能力。
图9显示m89 Rb突变型抑制膀胱肿瘤细胞株TCCS UP生长的能力。
本发明的详细描述定义术语“基因的功能表达”用于包括基因转录的抑制、基因转录产物(前信使RNA)的降解、拼接的抑制、信使RNA的消除、阻止信使RNA的翻译、阻止蛋白质翻译后修饰、蛋白质的消除或抑制蛋白质的正常功能。
术语“转染的质粒”用于包括细菌质粒，其含有将被携带(转染)进入所选择细胞的突变的成视网膜瘤或p53基因。
术语“基因治疗”用于包括为了调节基因表达和/或基因产物的功能，将部分或全部基因、DNA构建物、RNA或基因产物插入到一个细胞、一群细胞、组织、病理损伤处、器官或生物体中。
术语“预防性基因治疗”用于包括可用于部分或完全抑制疾病或疾病蔓延的基因，也包括可用于补充或替代细胞、组织或种系中缺少的或有缺陷的负生长的基因。
术语“细胞增殖性疾病”用于包括任何人或动物的疾病，其影向器官、体腔或身体部分的任何一处或几处，其特征是细胞、细胞群或组织的单个或多个局部的异常增殖，而不论良性还是恶性。
术语“原核生物”指包括所有细菌，可以用DNA进行转化以使本发明的重组分子表达。
术语“真核生物”指包括所有酵母菌、真菌、动物和植物细胞，可以用DNA进行转化以使本发明的重组分子表达。
用于本发明DNA构建物的DNA可以人工合成或来自任何哺乳动物。唯一要求是Rb和p53基因的遗传序列可在原核和真核生物中进行功能性表达。较佳的是人工合成的DNA。
编码本发明DNA构建物的重组DNA分子可用本领域的一般技术人员熟知的任何技术转化宿主。
已知用于制备融合的、可操作连锁的基因并在细菌中表达这些基因的方法。例如美国专利No.4,366,246，该专利在此引用作为参考，其中描述的遗传构建物和方法可被用于构建本发明的DNA构建物和在原核或真核宿主中的转染。
原核宿主可以包括革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、粘质沙雷氏菌和枯草杆菌。真核宿主可以包括酵母菌例如畜牧毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)或哺乳动物细胞。
一般地，含有提高插入的DNA片段转录效率的启动子序列的表达载体与宿主结合使用。典型地，表达载体含有复制起始点、启动子、终止子以及能够提供对转化的细胞进行表型筛选的特异基因。可用本领域已知的方法发酵和培养转化的细胞，获得最适宜的细胞生长。
能用于本发明的启动子例子包括(但不局限于)人β肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、SV40复制起始点、小鼠乳腺瘤病毒长末端重复序列启动子(MMTV LTR启动子)和鼠白血病病毒长末端重复序列启动子(MuLV LTR启动子)。能用于本发明的一些质粒和噬菌体例子列于Maniatis等人的《分子克隆》(Cold spring Har-bor Laboratories，1982)中。其它方面内容为本领域的技术人员所知道，能容易地确定。
一个基因是一段DNA序列，通过它的模板或信使RNA可编码一段特定肽特有的氨基酸序列。术语cDNA包括去除间隔序列的基因。术语“重组DNA”(rDNA)指包括一种通过在体外拼接cDNA或基因组DNA序列而重组的分子。
克隆载体是质粒或噬菌体DNA或其它的DNA序列，它能够在宿主细胞中复制，其特征在于具有一个或少部分内切酶识别位点，可以确定方式切割这样的DNA序列，而不丢失DNA的基本生物学功能，并且这一克隆载体含有一个适用于鉴定转化细胞的标志。例如这些标志是四环素抗性或氨苄青霉素抗性。“载体”一字有时就指克隆载体。
表达载体类似于克隆载体，但能够在宿主中表达给定的结构基因，这通常是在一些调控序列的调控下进行。
术语“个体”指包括动物和人。
术语增殖细胞生长的“生物抑制”或“抑制”指包括部分或全部的生长抑制，同时也包括细胞增殖或生长速率的减慢。通过在组织培养中评估测试因子对恶性或异常增殖细胞生长的靶效应以及评估动物和细胞培养中的肿瘤生长或通过其它本领域的一般技术人员知道的方法，确定本发明中突变型的生物抑制剂量。
本文中所用术语“保守的同源区域”指Rb和p53之间同源的氨基酸区域，显示于表1中。
施用本发明的蛋白质的途径可以是皮肤表面的、眼内的、非肠道的、口服的、鼻内的、静脉的、肌内的、皮下的或任何其它合适给药的方法。治疗眼疾的较佳施用方法是眼内或眼周的注射。治疗皮肤细胞增殖疾病的较佳施用方法是皮肤表面施用或皮下注射。
在本发明的另一个例子中，本发明的DNA构建物可以直接到达增殖性疾病的病灶处。就眼增殖疾病来说，本发明的DNA构建物可直接注射入眼睛。本发明的DNA构建物可以直接到达内脏器官、体腔等疾病病灶部位，通过使用图像仪直接跟踪注射头至疾病部位。本发明的DNA构建物也可以通过手术时施用至疾病部位。
施用的DNA剂量依赖于个体的年龄、临床期、疾病程度、遗传倾向、部位、体重、同时治疗的类型，还有病理性或恶性情况的性质。在本发明方法中使用的有效的供给系统可以有这些形式，如用于口服的胶囊、药片、液体溶液、悬浮液或酏剂，或无菌的液体形式如溶液、悬浮液或乳剂。较佳地使用惰性载体如盐水、磷酸盐缓冲液，或在其中本发明方法使用的化合物具有合适的溶解性能的任何载体。
较佳地，对于眼内供药和供药给其他局部病灶，本发明方法中使用的供给系统可以是无菌的液体形式如溶液、悬浮液或乳剂。对于皮肤表面施用，可以使用油膏剂、霜剂或喷雾剂、优选使用惰性载体如盐水、磷酸盐缓冲液、或在其中本发明方法所用的化合物有合适溶解性能的任何载体。
对细胞的局部施用，可以使用本领域的技术人员知道的方法，包括(但不局限于)细胞的转染、电穿孔、微注射，或使用脂质体、脂质转染试剂(lipofectin)或裸露的DNA或RNA之类的载体。本发明的DNA可通过已知的基因送递系统进行供给，该系统有(但不局限于)反转录病毒载体(Gilboa(1982)J.Virology 44845；Hocke(1986)Nature 320275；Wilson et al.，Proc Natl Acad Sci USA 853014)、痘菌病素系统(Chakrabarty et al.，(1985)Mol.Cell Biol.53403)或其它有效的DNA送递系统(Yates et al.，(1985)Na-ture 313812)，本领域的技术人员知道这些系统。这些参考文献只是代表性的例子。为了特异性地送递或转染异常增殖和稀疏非分裂细胞，较佳地选用本领域技术人员知道的反转录病毒送递系统，因为宿主DNA复制对反转录病毒DNA的整合是必需的。由于反转录病毒缺少该病毒生活史必需的反转录病毒基因，因此不能自身复制。使用这样的反转录病毒送递系统，本发明可将所谓的抗增殖元件导向异常增殖细胞，而不干扰分裂正常细胞。
本发明的突变型蛋白可用任何生物学上有效的载体进行施用。具有生物学效应的载体包括反转录病毒、脂质体和其它能将外源蛋白导入细胞基因组中的转染机制。本领域技术人员知道这种转染机制。载体也可以包括任何试剂或溶剂，它们与本发明的构建物相容，并且当进行一定量的施用时，对个体或细胞是无毒的。
治疗病理性细胞增殖情况存在有广泛不同的病理性癌和非癌细胞增殖情况，本发明的方法对这些增殖情况具有治疗疗效。这些病理性情况可以发生在几乎所有能够异常增殖的细胞类型中。这些能够表现病理性或异常生长的细胞类型有(1)成纤维细胞、(2)血管内皮细胞和(3)上皮细胞。以上述可见，本发明的方法可用于治疗个体的几乎所有器官和组织系统中的局部或弥漫性病理情况。
例如，单就眼睛而言，本发明的方法可治疗广泛的病理性疾病，这些疾病由正常(良性)或恶性细胞或组织的异常增殖引起，其中包括(但不局限于)下述眼睛中纤维增殖、血管增殖和/或致瘤性疾病早熟视网膜病、增殖性玻璃体视网膜病、增殖性糖尿病视网膜病、毛细血管瘤、脉络膜新生血管网、视网膜下新生血管网、视网膜下新生血管化、角膜新生血管化引起的老年黄斑退化、上视网膜膜增殖引起的黄斑皱褶、核性硬化引起的成年人白内障、创伤或手术后的纤维性向内生长、视神经胶质瘤、多发性血管瘤视网膜、新生血管性青光眼、海绵状血管瘤、虹膜发红、镰形细胞增殖视网膜病、眼睛手术或受伤后上皮细胞向下生长、后发性白内障膜、乳头状瘤、地中海贫血伴视网膜新生血管化、弹性假黄瘤引起的视网膜下新生血管化以及I型和II型多发性神经纤维瘤、视网膜细胞瘤、眼色素层黑素瘤和眶假瘤。可应用本发明的其它良性细胞增殖疾病包括(但不局限于)牛皮癣、鳞癣、乳头状瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌和Stevens-John-son综合。
一般地，本发明可应用于所有形式的癌肿，其中包括(但不局限于)涉及Rb基因和/或p53基因失活的癌肿，如骨肉瘤、软组织肉瘤、黑素瘤、纤维肉瘤、成视网膜瘤、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌和前列腺癌。
发现决定着Rb和p53之间保守性结构域的构象本发明公开了一个保守性同源结构域，其控制二个肿瘤抑制基因产物Rb和p53的构象，因此，产生了这些基因的突变型及使用它们的方法。所以，本发明提供一种分离的DNA分子，所述分子是一个突变的生长抑制基因。本发明的突变生长抑制基因可以是任何抑制细胞增殖的基因。在本发明一个较佳的例子中，突变的生长抑制基因是突变的Rb基因。在本发明另一个较佳的例子中，突变的生长抑制基因是突变的p53基因。
为了了解pRb和其细胞靶目标之间的相互作用，产生了针对Rb蛋白各亲水性区域的抗体。因为Rb蛋白的不同区域可以与不同的蛋白质相互作用，所以必需产生针对许多不同区域的抗体，这样，才能使一些抗体可以与Rb蛋白和其靶之间形成的蛋白复合体结合而不干扰它们的相互作用。在一组针对相应于各种亲水性区域的人工合成肽的多克隆抗Rb抗体中，有两种抗体(Rb1-Ab18和Ab20)除了与Rb蛋白结合以外，始终与一个分子量为53KD的蛋白结合(图1A，道1、2、8和9)。这两种抗体被证实是针对同一种人工合成肽p5。53KD蛋白的出现对针对p5的抗血清是特异的。针对其它区域的抗血清，例如Rb1-AbB(图1，道4-5)和Rb1-AbC(图1，道6-7)尽管能识别Rb蛋白，但不与53KD蛋白发生免疫沉淀作用。因为53KD蛋白的分子量与p53相似，这表明它就是p53蛋白本身。细胞株与针对p53的单克隆抗体Pab122发生免疫沉淀显示p53的确与53KD蛋白具有完全相同的分子量(道10)。进一步地，如果p53先用Pab122从细胞裂解物中去除，则Rb1-Ab18或Rb1-Ab20都不能免疫沉淀出，虽然它们仍能与Rb蛋白发生沉淀反应(道11)。为了进一步证实53KD蛋白的确就是p53，用无外源p53和/或Rb蛋白表达的一些细胞株进行免疫沉淀反应。在所有的例子中(道12-20)，抗体能识别p53蛋白的情况与这些细胞株中有无p53基因状况确实相符合。进一步地，p53的免疫沉淀作用不依赖于有无Rb蛋白，这暗示没有形成一种复合物，并且p53蛋白是被抗体直接识别的。
为了确切地显示p53蛋白与Rb蛋白具有共同的抗原结构域，便开始寻找相应于Rb蛋白p5区域的p53蛋白氨基酸序列。如果在这两种蛋白质和P5肽中保留有三维结构信息，则可能在p53蛋白中有一个相应区域。进一步地，含有这一保守性抗原区域的肽会阻止RB1-Ab18或RB1-Ab20与p53的免疫沉淀反应。在有不同量的这些肽的存在下进行Rb1-Ab18与Rb和p53蛋白的免疫沉淀反应(图2A)。一种p53肽F19，在测试的最低浓度(10μg/ml)下，完全阻止Rb1-Ab18与p53的免疫沉淀反应(图2A，道12-14)。这也就是用于阻止沉淀作用的Rb肽p5的同样浓度(道1和2)。相反地，甚至在比使用的浓度高50至100倍时(道3-11)，所有其它的p53肽也不能阻止Rb1-Ab18与p53的免疫沉淀反应。
p5和F19区域不是显示Rb和p53蛋白之间结构同源性的唯一区域。根据目测和计算机寻找，至少鉴定出另外二个区域。Rb和p53同源区域的比较见表I表I
(P1区域) (67％同源)Rb…EINSALVLK(184-192)P53… ELNEALELK(343-351)(P3区域) (67％同源)Rb…RRGONRSAR(245-262)P53… KKGOSTSRH(372-380)(P5区域) (62％同源)Rb…KKLRFDIEG--SD(873-886)P53… KKLMFKTEGPDSD(381-393)虽然这些区域可能显得较短，但是在pRb和p53之间同源的这些氨基酸也是p53中进化上最保守的(没有得到不同物种中Rb序列的数据)。这两种生长抑制蛋白之间高度的同源性揭示这些区域在功能上的重要性。pRb和p5同源区域位置的示意图显示在图2B中。在p53中，所有三个区域位于蛋白的C末端。在pRb中，区域1和3位于N末端的一半处，而p5区域位于C末端的一半处。然而，在p53和pRb中，这三个区域都位于已知对蛋白质的抑制功能具有重要性的结构域外侧。如果这些区域不负责与其抑制靶目标之间的物理相互作用，则可能它们担负着相互作用过程中的调控作用。正如要有活性R6和p53蛋自来抑制不期望的细胞生长一样，也需要有一种方式来负调控它们的活性以使细胞可以增殖，这也是同样重要的。这两种生长抑制基因产物中保守性结构域的存在保证了它们的协同调控。下述可见，其实这些同源区域会形成一个决定两种蛋白质构象的结构域。具体地，通过在这三个区域任一区域中的保守性氨基酸残基(上述表I下划线处)的突变，使这一结构域破坏，则会赋于两种蛋白一种活跃的构象。相反地，这些区域的非保守性氨基酸的突变不产生效应。
P1、P3、P5区域控制p53的构象及其结合DNA的能力p53激活转录的能力与结合DNA能力紧密相关。在癌细胞株中发现的突变型p53不能结合DNA也不能激活转录。p53蛋白在有抗体Pab421存在时能与特异的DNA序列结合。仔细检查Pab421的表位，发现它与P3区域重叠。被Pab421识别的表位(见图3)是P3区域中最后四个氨基酸残基。用抗体(Pab421)封闭整个P3区域足以改变的蛋白质构象，使p53蛋白能结合特异DNA序列。DNA的结合测定提供一种方便地测试P3和其它同源区域P1和P5在控制p53蛋白构象中所起作用的手段。如图3显示，尽管野生型p53不能结合特异的DNA序列(道1)，但在抗体Pab421存在下却能结合(道2)。当p53的P1(道3)、P3(道5和7)或P5(道9)区域中保守性氨基酸突变时，产生的p53突变型蛋白甚至在无Pab421时也能结合DNA。一旦与Pab421的结合形成的复合物便高迁移(P1、P3和P5分别为道4、8和10)。这种高迁移(Supershift)表明这些突变型中的P3区域仍能与抗体结合，并且在无Pab421时，突变型能与DNA结合并非由于P3区域的突变。事实上，位于这些C末端结构域之外的抗体Pab1801的结合也产生高迁移的复合物。道7和8中的突变型是P3区域前面4个氨基酸残基的突变，明显不影响Pab421与蛋白质的结合。道5和6中的突变型是P3区域最后4个保守性氨基酸残基的突变，则Pab421不能与蛋白质的结合。非保守性氨基酸的突变显示无改变的效应，其蛋白质行为基本上类似野生型。因此，当同源区域通过突变而破坏时，突变型p53蛋白质的构象使转变成活性形式。
同源区域突变的Rb蛋白的磷酸化控制的改变有几种方法可区分pRb蛋白的活性和非活性构象。活性Rb蛋白低磷酸化，能抑制细胞的生长。非活性Rb蛋白高磷酸化。如果同源结构域影响pRb的活性和非活性构象，则P1、P3、P5区域的突变会影响蛋白质抑制细胞生长和其磷酸化的能力。分别地在pRb的P1、P3和P5区域中的保守性氨基酸残基处突变，然后检测突变型抑制细胞生长的能力。所有的突变型能抑制转染细胞的生长。在P5区域保守性氨基酸处突变的Rb突变型m89-0抑制正常和癌细胞生长的能力显示在下述的二个实施例中，因为pRb的活性由磷酸化调控，如果保守区域用于维持pRb的非活性构象，则P5区域的突变将对突变型pRb的磷酸化有抑制效应，从而使该蛋白具有活性。有一些缺乏pRb表达的细胞株，这是由于RB-1的双等位基因突变引起，这些细胞株同时也引起其它的突变，而这些突变使得它们对转染的Rb基因的抑制效应具有抗性。宫颈癌细胞株C33A和Saos-2亚群是二种这样的细胞株。因此，这些细胞株能表达突变型蛋白且细胞仍能生存，从而可以提取丰富量的蛋白质以检测磷酸化状况。在P5区域保守性氨基酸残基处突变的将P5突变型HuβAcPr-1-neo-P5C转染入这些细胞，并且通过单细胞纯化获得稳定的细胞株。将从纯化的突变型细胞株Saos-2#89中分离到的突变型pRb的磷酸化格局与从野生型Rb转染和纯化的细胞株Saso-2#84中分离到的野生型pRb的磷酸化格局相比较，来自S期Ssao-2#84(野生型)和Saos-2#89(突变型)的pRb免疫沉淀反应显示，野生型pRb高磷酸化，而突变型pRb则低磷酸化。这提示P5突变型pRb甚至在细胞处于S期时，仍呈活性构象。因此，P5突变型呈现出能抵抗特定位置磷酸化的构象。应注意到，该蛋白在其它功能上不重要的位置仍是磷酸化的。
因为SDS-PAGE的一维格局分析只显示蛋白质的低磷酸化，而不能显示低磷酸化的性质，所以用二种蛋白水解酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对23P标记的pRb进行二维磷酸肽分析。二维图谱比较显示，与野生型相比，突变型中有二个始终处于未磷酸化的位点S10a和S10b(图4A)。为了表明磷酸化格局的差异是由于蛋白质构象中内在的差异而不是体内酶特异性的变异造成的，比较蛋白质的体外磷酸化格局。用含有细胞周期蛋白(cyclin)关联激酶的激酶制剂对野生型和突变型pRb进行磷酸化。体外标记依赖于细胞周期蛋白关联激酶，而针对激酶的抗体会阻止磷酸化，通过二维肽图分析体外磷酸化的pRb，结果见图4B，没有在突变型中使用同样的磷酸化位点。因而，甚至在提供充足量的酶和在适宜的磷酸化条件下，在该条件下野生型pRB磷酸化完全，而突变型pRb完全抵抗在S10a和S10b位点的磷酸化。因此S10a和S10b磷酸化的变异是由于野生型和突变型蛋白构象中内在的差异、而不是体内酶特异性的变异造成的。
揭示在同源区域突变的Rb蛋白呈活性形式(A)S10a和S10b位点的磷酸化与pRb活性的相关性下述数据揭示，S10a和S10b位点的磷酸化变异与pRb与SV40大T抗原的结合能力相关。为了体外研究磷酸化作用，从用重组Rb-杆状病毒感染的Sf9细胞中分离Rb蛋白，该重组Rb-杆状病毒中的多角体蛋白基因部分地被Rb基因替代。在高感染滴度条件下，虽然大多数提取的Rb蛋白通过磷酸化不能结合SV40大T抗原，但小部分Rb蛋白仍能结合大T抗原。该结合显示在图5中。从用相应的杆状病毒感染的35S标记的SF9细胞中得到Rb蛋白和SV40大T抗原并体外磷酸化。道1显示提取的Rb蛋白由低磷酸化和高磷酸化形式组成，和一些蛋白与大T抗原结合。大T抗原仅与RB蛋白的低磷酸化形式结合(道2和3)。用不同量的Rb激酶对大T抗原Rb复合物进行磷酸化(道3至6)，可使大多数Rb蛋白从与大T抗原的结合中释放下来。这种RB蛋白形式被称为RB-E(E＝暴露关键位点)。然而，约20-30％Rb蛋白(称为RB-H)(H＝隐蔽关键位点)仍紧密地与大T抗原结合，并且整个复合物能与抗大T抗原的抗体结合。最重要的是，虽然增量的Rb激酶能使Rb蛋白磷酸化，使之成为最慢的迁移形式(比较道4至6和道8至10)，但是高磷酸化的Rb蛋白仍结合着大T抗原。这些Rb蛋白的沉淀作用不是由于对蛋白A琼脂糖的非特异吸附造成的，这可以比较道6和道2而得出。约70％和Rb蛋白从大T抗原上释放下来。释放的Rb蛋白不是由于蛋白的非特异降解造成的。这可以通过一事实来说明，即如果反应是与抗Rb抗体的沉淀反应，则所有的Rb蛋白都应沉淀(见道8、9和10)。Rb蛋白的各种形式与大T抗原的结合能力见道8、9和10，其中较少量的大T抗原与Rb蛋白结合。
这些结果与Rb蛋白存在有二类磷酸化位点一致，一类对Rb蛋白的失活是关键的，因此不能结合大T抗原，另一类能被磷酸化而不影响其结合。对Rb激酶复合物来说，存在有17个潜在的磷酸化位点(S/TPXX)。为了揭示这些磷酸化位点对Rb蛋白失活的重要性，对仍能结合SV40大T抗原的Rb蛋白(RB-H)以及磷酸化后从SV40大T抗原上游离出的Rb蛋白(RB-H)进行二维图谱分析。如果Rb从大T抗原上的解离是磷酸化造成的。那么在Rb蛋白的这二种形式之间一定存在着磷酸化位点的差异。如图6所示，仍结合着大T抗原的pRb的S10a和S10b没有被磷酸化。
P5区域保守性氨基酸的突变使得蛋白质具有活性构象。在S10a和S10b位点的磷酸化是细胞周期中一个功能步骤，与细胞能够增殖相关。
(B)pRb S10a和S10b位点的磷酸化与细胞生长状况相关下述数据揭示，S10a和S10b位点磷酸化的变异受到一种依赖细胞周期的方式的调控。
已有充分报道揭示，正常的或癌细胞暴露于TGFβ常导致生长抑制。前面已描述过的细胞生长抑制中pRb的作用。为了了解TGFβ在pRb的磷酸化中的作用，运用能通过TGFβ处理而产生生长抑制的乳腺癌细胞株MDAMB31。通过含氚胸腺嘧啶的摄入以及由二维肽图进行分析的32P标记的pRb磷酸化格局，监测该细胞的增殖状况。有意义的是，来自因TGFβ处理而生长抑制的细胞中pRb在S10a和S10b位点未磷酸化(图7)。然而，当细胞从TGFβ释放时，S10a和S10b重新磷酸化。因此，生长抑制的细胞中具有活性的pRb蛋白在S10a和S10b位点未磷酸化。这种可逆的磷酸化并不是特异地针对TGFβ的生长抑制效应。这是因为在从因缺少血清而生长抑制的细胞中分离的pRb具有相似的S10a和S10b磷酸化格局。重新供给血清或生长因子，S10a和S10a便重新磷酸化。此外，从因视黄酸处理而生长抑制的细胞中分离的pRb中S10a和S10b未磷酸化。因此，pRb蛋白中功能性关键的S10a和S10b位点在不同的生长条件下经历可逆的磷酸化。
Rb基因和p53基因的突变型对pRb和p53来说，同源区域的突变导致蛋白质呈现出使其具有活性的构象。Rb和p53在构象上呈现活性的突变型例子以及它们在细胞生长抑制中的应用在下面给出。就Rb蛋白而言，有二类突变型(1)在调控或同源区域的突变型和(2)在磷酸化位点的突变型。就p53蛋白而言，描述了同源区域的突变型。
Rb基因的突变型高磷酸化的Rb蛋白的磷酸氨基酸分析显示，丝氨酸和苏氨酸被磷酸化。Rb蛋白中有79个丝氨酸和55个苏氨酸残基。在这些残基中，发现17个呈(S/TPXX)模式(motif)，这是cdc2激酶的潜在磷酸化位点。已知cdc2激酶和相关的激酶能对Rb蛋白进行磷酸化。
Rb蛋白有二类磷酸化位点，一类对Rb蛋白的失活是关键的，因此不能结合大T抗原，另一类能被磷酸化而不影响其结合。对Rb激酶复合物来说，因为存在至少17个潜在磷酸化位点(S/TPXX)，所以有一些可能对Rb蛋白的失活是重要的。这17个磷酸化位点是T005、S230、S249、T252、T356、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821、T826，其中T和S分别表示苏氨酸和丝氨酸，其后数字表示Rb蛋白中氨基酸残基位置。
突变的成视网膜细胞瘤基因较佳地由二种不同方法中的一种进行突变。二种方法都能影响蛋白质被磷酸化的能力。第一种方法是改变Rb基因保守同源区域中的氨基酸而突变基因。较佳地，Rb基因保守同源区域选自本文描述的由P1、P3和P5组成的组。编码突变Rb蛋白的突变Rb基因的代表例显示在Seq.ID.No.1和2中。了解保守同源结构域对蛋白质磷酸化起重要作用后，本领域普通技术人员能容易地构建其它编码所需突变Rb蛋白的突变Rb基因。
第二种方法能阻止Rb蛋白的磷酸化和失活，这是通过改变所述基因磷酸化位点处氨基酸而突变。较佳地，磷酸化位点选自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826组成的组。在上述磷酸化位点的缩写中，S指丝氨酸，T指苏氨酸，数字指Rb蛋白序列中氨基酸的位置。在本文公开的磷酸化突变型中，每一苏氨酸或丝氨酸在各个质粒中被突变成丙氨酸。如前所述，至少存在二类磷酸化位点，一类在功能上对pRb的失活是重要的。上述产生的一种或多种突变型能阻止突变型pRb的磷酸化和并防止失活。
在本发明的其它例子中，也提供了含有编码突变Rb蛋白的DNA的质粒。此外，也提供了适合于在重组细胞中表达的质粒，其含有编码Seq.ID.No.1突变Rb蛋白的DNA和在细胞中cDNA表达所必需的调控元件，同时提供了另一种适合在重组细胞中表达的质粒，其含有编码Seq.ID.N 0.2突变Rb蛋白的DNA和在细胞中cDNA表达所必需的调控元件。
p53基因的突变型在本发明的另一例子中，突变的生长抑制基因是突变p53基因。较佳地，p53基因通过改变其保守同源区域的氨基酸而突变(上述表1中带下划线的氨基酸)。类似地，p53基因的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。突变型可以是P1、P3或P5的单独突变或任何组合突变(包括所有三个区域的突变)。此外，C末端氨基酸残基295-393缺失的突变型在结合特异DNA序列方面仍具有活性。
运用pRb和p53突变型抑制细胞生长本发明也提供新的转染细胞，例如含有权利要求1所述的能编码突变Rb蛋白的分离DNA分子的转染细胞。也提供了稳定转染的细胞，其表达编码突变Rb蛋白的突变Rb基因。较佳地，本发明的转染细胞含有突变的Rb基因，该基因含有一段编码显示于Seq.ID.No.1或Seq.ID.No.2中的突变Rb蛋白的核酸序列。此外，本发明也提供一种稳定转染的细胞，其表达编码突变p53蛋白的突变p53基因。
本发明也提供了一种治疗病理性细胞增殖疾病的方法，包括对非癌增殖细胞施用突变生长抑制基因的DNA分子。在一个例子中，施用的分子是突变的Rb或p53基因。Rb基因通过改变其保守同源区域氨基酸而突变或所述基因通过改变磷酸化位点处氨基酸而突变。保守同源区域和磷酸化位点同上所述。
一般地，这一方法可用于治疗任何细胞增殖性疾病。非癌细胞增殖性疾病包括牛皮癣、良性增殖的皮肤疾病、鳞癣、乳头状瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、纤维增殖疾病、血管增殖疾病和皮肤增殖疾病。
本发明也提供了治疗个体恶性细胞疾病的方法，包括施用突变Rb或p53基因的DNA分子进入增殖的癌细胞中。这些突变基因如上构建。
一般地，治疗恶性细胞疾病的方法类似于治疗非癌细胞增殖性疾病。由增殖的癌细胞引起的疾病，其代表性例子包括(但不局限于)骨肉瘤、纤维肉瘤、成视网膜细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌和前列腺癌。
根据本发明的方法，人们能通过导入突变的Rb或p53蛋白来调控细胞增殖过程以阻止或抑制许多细胞增殖性疾病中的异常*P1319×增殖。控制增殖过程可以通过向靶增殖细胞导入编码突变Rb和p53蛋白的DNA构建物来达到。
本发明也提供了治疗病灶性细胞增殖疾病的方法，包括对增殖的细胞施用突变的Rb或p53基因。一般地，增殖的细胞可以引起这些代表性的疾病如眼睛中的纤维增殖、血管增殖和致瘤性疾病。
在另一个例子中，Rb基因的磷酸化位点在导入细胞前被诱导突变。在Rb蛋白中存在17个潜在磷酸化位点。Rb cDNA编码序列中的丝氨酸或苏氨酸突变成丙氨酸或缬氨酸或其它氨基酸，将导致产生具有永久活性的Rb蛋白，其不能通过磷酸化而失活。也就是说，宿主细胞不能通过磷酸化来失活Rb蛋白。将突变的Rb基因导入细胞会导致生长抑制。所有这些突变型已亚克隆至人β-肌动蛋白启动子载体中。为了亚克隆Rb cDNA，将整个开放阅读框在5′端与含有Bam HI位点的人工合成接头(CGGATCCGCGTC)连接，在3′端与含有ATTAAA和BamHI位点的人工合成接头连接，产生的BamHI片段亚克隆至载体的BamHI位点，并且挑选出具有方向正确的克隆。
实施例1
制备p5突变型m89-0和m88-0为了制备m89-0突变型，合成一对包含有要被突变的‘P5’区域的DNA寡核苷酸引物(Pm1和Qm1)和一对位于‘P5’区域两侧的寡核苷酸(P3和Q3)，合成是根据制造商的说明，在AB1 PCR-mate寡核苷酸合成仪上进行。以野生型Rb cDNA作为模板，用P3和Qm1引物进行40次循环的聚合酶链反应(PCR)。在第二个管中，用Pm1和Q3引物进行40次循环的PCR。反应完成后，从第一个管中取出少量反应产物在过量P3引物存在下进行80次循环的PCR。类似地，从第二个管中取出少量反应产物在过量Q3引物存在下进行80次循环的PCR。混合从该二管中获得的大量单链反应产物，再进行20次循环的链延伸。产生的双链产物含有突变的P5区域，被亚克隆至Rb表达质粒HuBAcpr-1-neo-PQ(m89-0)的MIul和Hind3位点。产生的质粒有一个突变的P5区域，下图显示突变的氨基酸(下划线部分)。K870和H890分别指Rb蛋白中870和890位置的赖氨酸和组氨酸残基。m88-0以类似方法产生。野生型Rb- K870PLKKLRFDIEGSDEADGSKH890突变型m89-o Rb- K870PLKKLRFDIEASAEVDASIH890突变型m88-o Rb- K870LLIKPRYDTEGSDEADGSKH890实施例2转染的质粒对人成纤维细胞株的影响当突变型m89-o转染入正常人成纤维细胞株WS1时，观察RbcDNA对细胞生长的影响。SV40大T抗原基因被用作转染的对照。用含有SV40大T抗原基因和新霉素基因的质粒pPVUO-Neo进行转染以监测转染效率。此外，一种非活性的Rb基因突变型形式“HuBAcpr-1-neo-P16”被用作对照。转染时，将100μg的每一种质粒DNA与107个指数生长的WS1细胞混合，该混合是在含有RPM1 1640培养基(Gibco)和10％FCS、终体积为0.8ml的电穿孔槽装置Cell-PoratorTM(BRL)中进行。电穿孔条件为200伏特和1180微法。电穿孔的细胞在室温复苏10分钟，用RPM1 1640和10％胎牛血清(FCS)稀释，涂布在60毫米培养皿上，细胞密度为2×104细胞/平方厘米。细胞在同样的培养基中附着并生长两天。然后，培养基换成RPM1 1640＋10％FCS＋15微克/毫升G418(G1BCO)。每三天取相同培养皿，用兔多克隆抗Rb蛋白抗体RB1-ABA1(图8A)或鼠单克隆抗SV40大T抗原抗体Pab101(图8B)进行组织免疫化学染色。从图8A看到，转染后13天并用G418培养基选择，表达转染的Rb cDNA质粒m89-0的WS1细胞可高强度地结合抗Rb蛋白抗体。然而，表达Rb蛋白的细胞仍为单个的细胞，没有分裂。相反地，表达转染的SV40大T抗原(SVLT)的细胞继续分裂形成集落，如同图8B中与鼠抗SVLT抗体阳性结合的细胞群所示。因此，细胞中m89-0 Rb cDNA的过量表达导致正常细胞WS1生长的完全抑制。用非活性的Rb HuβAcpr-1-neo-P16形成转染的细胞没有受到抑制而分裂形成集落。
实施例3转染的质粒对人膀胱癌细胞株TCCSUP的影响用上述描述的同样程序，将突变型m89-0和HuβAcpr-1-neo-P16质粒转染至无外源Rb蛋白的人膀胱癌细胞TCCSUP中。使用的质粒、转染的方法和免疫染色方法与上述描写的一致。
图9A显示，表达转染的m89-0cDNA的细胞不能分裂。相反地，表达转染的HuBA cpr-1-neo-P16的细胞分裂形成集落(图9B)。m89-0RbcDNA的过量表达导致体外肿瘤细胞生长的严重阻滞。
实施例4除了Rb和p53同源区域的突变型外，还有在p53蛋白中的突变。表II列出野生型p53和制备的保守氨基酸突变型的部分氨基酸序列。此外，表II列出对应于突变型氨基酸序列的DNA序列。为了制备突变型，合成二条引物，与模板链一起退火。PCR反应同上。如上所述，P1、P3和P5区域的改变导致p53蛋白的构象改变，从而能直接结合其靶DNA序列。
表IIp53突变型P1野生型ELNEALELK保守氨基酸突变型(P53-ConP1)KLYEDFEIE(1)5′GC TCC GAG ATG TTC CGA AAG CTG TAT GAG GACTTG GAA ATC GAG GAT GCC CAG GCT GGG 3′(2)3′CG AGG CTC TAC AAG GCT TTC GAC ATA CTC CTGAAC CTT TAG CTC CTA CGG GTC CGA CCC 5′P3 野生型 KKGQSTSRH保守氨基酸突变型(P53-ConP3)NEWFSTARD(1)5′AGC CAC CTG AAG TCC AAC GAG TGG TTC TCT ACCGCC CGC GAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG AC 3′(2)3′TCG GTG GAC TTC AGG TTG CTC AGG AAG AGATGG CGG GCG CTA TTT TTT GAG TAC AAG TTC TG 5′P5 野生型 KKLMFKTEGPDSD保守氨基酸突变型(P53-ConP5)NEVMWKTKWPDAH(1)5′GTCTACCTCCCGCCAT AACGAA GTCATG TGGAAGACAAAA TGGCCT GACGCA CAC TGACATTCTC-CACTTCTT 3′(2)3′CAGATGGAGGGCGGTA TTGCTT CAGTAC ACCTTCTGTTTT ACCGGA CTGCGT GTG ACTGTAAGAGGT-GAAGAA5′实施例5产生含有突变型Rb基因的重组反转录病毒将含有整个突变型Rb#89编码区域的HindIII/BamHI片段亚克隆入反转录病毒载体的HindIII/BgIII位点。将重组质粒载体转染入细胞株Psi-2。用培养转染细胞的培养基去感染另一细胞株PA317。产生重组病毒的细胞用G418选择，并且从培养基中收集到的反转录病毒浓缩后通过蔗糖梯度纯化。p53基因的突变型以同样方式测试。
实施例6G1NaSvRb89病毒对眼睛中细胞增殖的影响通过注射兔成纤维细胞以及产生局部损伤来诱导兔实验增殖性玻璃体视网膜病(PVR)。这一程序包括在缘处诱导一损伤以及在全身麻醉下向玻璃体注射2×105的兔成纤维细胞。术后，兔接收含有抗生素的局部软膏。
突变型Rb或p53基因重组反转录病毒在动物全身麻醉下注射入玻璃体(2×105细胞/兔)。起初，通过评估病毒的最大剂量(使用的病毒浓度和注射病毒的体积)测试病毒的局部耐受程度。反转录病毒已用于在鼠中进行视网膜下注射，未报道有副作用(Turner和Cep-ko，Nature 328132,1987)。不会产生副作用的最大剂量将用于所有随后的治疗。
通过照相透视来监测体内细胞的生长。视网膜脱离的程度要与对照相比较，对照只注射含有1-半乳糖苷酶基因的反转录病毒。此外，通过用溴脱氧尿苷(BrdU)标记活体来监测体内细胞的生长。在兔安死术前一小时，静脉注射50毫克/千克BrdU以标记增殖细胞。安死术后，通过用针对BrdU的抗体的免疫染色，分析细胞中BrdU掺入DNA情况。同时，用抗Rb或p53蛋白或1-半乳糖苷酶蛋白的抗体对细胞进行免疫染色以评估感染效率。
PVR诱导后，在不同时间内注射病毒来评估反转录病毒抑制注射的细胞生长的最适时间。也测定玻璃体对感染兔成纤维细胞效率的影向。也测定对兔成纤维细胞增加这些病毒的时间延迟。还测定对用成纤维细胞生长因子刺激以增加生长速率的兔成纤维细胞增加这些病毒的时间延迟。
本说明书中提及的现有专利和出版物表示与本发明相关的领域中技术人员的水平。所有的专利和出版物在此以同等程度引用作为参考，如同每篇出版物特定地和单独地被指明作为参考文献一样。
本领域的技术人员将容易地知道本发明非常适合实现其目标，并且获得上述的结果和优越性及其内在的其他好处。此处描述的实施例及其中的方法、程序、治疗、分子和特殊的化合物是目前较佳例子的代表性体现，也是示范性的，并不用于限定本发明的范围。本领域中技术人员所想到的围绕本发明精神的改变和其它用途，落于权利要求书所限定范围。
权利要求书按照条约第19条的修改根据条约第19条修改时的声明这是对1994年12月14日发出的国际检索报告的答复。
所附的是替换页第41页，用于替换上述国际申请的权利要求书中的相应部分。
权利要求1、3、5、6、和8被修改。
权利要求4和7未改动。
权利要求2被删去。
按权利要求修改格式，下面列出了被修改的
权利要求
1.(修改)一种分离的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的突变〔生长抑制〕Rb基因，该基因编码一种突变的有活性功能的成视网膜瘤蛋白。
3.(修改)如权利要求〔2〕1所述的分子，其特征在于，该基因通过改变编码Rb基因保守同源区域中氨基酸的核苷酸而突变。
5.(修改)如权利要求〔2〕1所述的分子，其特征在于，所述基因编码一种氨基酸序列，该序列选自由在Seq.ID.Nos.1和2中显示的序列组成的组。
6.(修改)如权利要求〔2〕1所述的分子，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb蛋白磷酸化位点处氨基酸的核苷酸序列而突变。
8.(修改)〔如权利要求1所述的分子〕一种分离的DNA分子，其特征在于，所述〔基因〕分子是合成的突变p53基因，该基因编码一种突变的有活性功能的p53蛋白。
1.一种分离的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的突变Rb基因，该基因编码一种突变的有活性功能的成视网膜瘤蛋白。
2.(取消)3.如权利要求1所述的分子，其特征在于，该基因通过改变编码Rb基因保守同源区域中氨基酸的核苷酸而突变。
4.如权利要求3所述的分子，其特征在于，所述Rb蛋白的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
5.如权利要求1所述的分子，其特征在于，所述基因编码一种氨基酸序列，该序列选自由在Seq.ID.Nos.1和2中显示的序列组成的组。
6.如权利要求1所述的分子，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb蛋白磷酸化位点处氨基酸的核苷酸序列而突变。
7.如权利要求6所述的分子，其特征在于，所述磷酸化位点选自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826组成的组。
8.一种分离的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的突变p53基因，该基因编码一种突变的有活性功能的p53蛋白。
9.如权利要求8所述的分子，其特征在于，该基因通过改变编码p53基因保守同源区域中氨基酸的核苷酸而突变。
l0.如权利要求9所述的分子，其特征在于，所述p53蛋白的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
11.一种质粒，其特征在于，含有如权利要求2所述的DNA。
12.一种质粒，其特征在于，含有如权利要求8所述的DNA。
13.一种适合在重组细胞中表达的质粒，其特征在于，含有编码
权利要求
1.一种分离的DNA分子，其特征在于，所述分子是合成的生长抑制基因。
2.如权利要求1所述的分子，其特征在于，该基因是突变的Rb基因，它编码突变的成视网膜细胞瘤蛋白。
3.如权利要求2所述的分子，其特征在于，该基因通过改变编码Rb基因保守同源区域中氨基酸的核苷酸而突变。
4.如权利要求3所述的分子，其特征在于，所述Rb蛋白的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
5.如权利要求2所述的分子，其特征在于，所述基因编码一种氨基酸序列，该序列选自在Seq.ID.Nos.1和2中显示的序列。
6.如权利要求2所述的分子，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb蛋白磷酸化位点处氨基酸的核苷酸序列而突变。
7.如权利要求6所述的分子，其特征在于，所述磷酸化位点选自由T005、S230、S249、T252、T373、5567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826组成的组。
8.如权利要求6所述的分子，其特征在于，所述分子是突变的p53基因。
9.如权利要求8所述的分子，其特征在于，该基因通过改变编码p53基因保守同源区域中氨基酸的核苷酸而突变。
10.如权利要求9所述的分子，其特征在于，所述p53蛋白的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
11.一种质粒，其特征在于，含有如权利要求2所述的DNA。
12.一种质粒，其特征在于，含有如权利要求8所述的DNA。
13.一种适合在重组细胞中表达的质粒，其特征在于，含有编码Seq.ID.No.1氨基酸序列的cDNA和在细胞中表达cDAN所必需的调控元件。
14.一种适合在重组细胞中表达的质粒，其特征在于，含有编码Seq.ID.No.2氨基酸序列的cDNA和在细胞中表达cDNA所必需的调控元件。
15.一种治疗病理性细胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括对非癌增殖细胞施用如权利要求1所述的DNA分子。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述分子是一个突变Rb基因。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb基因保守同源区域中氨基酸的核苷酸序列而突变。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述Rb基因的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因编码一种氨基酸序列，该序列选自在Seq.ID.No.1和2中显示的序列组成的组。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb蛋白磷酸化位点处氨基酸的核苷酸序列而突变。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述磷酸化位点选自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、S780、S788、S795、S807、S811、T821和T826组成的组。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基因是一个突变p53基因。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述基因通过改变编码p53蛋白保守同源区域氨基酸的核苷酸序列而突变。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述p53蛋白的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
25.如权利要求1 5所述的方法，其特征在于，所述非癌增殖细胞疾病选自由牛皮癣、良性增殖皮肤疾病、鳞癣、乳头状瘤、基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、纤维增殖疾病、血管增殖疾病和皮肤增殖疾病组成的组。
26.一种治疗个体恶性细胞疾病的方法，其特征在于，包括施用如权利要求1所述的DNA分子进入增殖的癌细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述分子是一个突变Rb基因。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb基因保守同源区域氨基酸的核苷酸序列而突变。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述Rb基因的保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因编码一种氨基酸序列，该序列选自由在Seq.ID.No.1和2中显示的序列组成的组。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述基因通过改变编码Rb蛋白磷酸化位点处氨基酸的核苷酸序列而突变。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述磷酸化点选自由T005、S230、S249、T252、T373、S567、S608、S612、T773、8780、S788、S795、S807、S811、T821和T826组成的组。
33.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述分子是一个突变p53基因。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述基因通过改变编码p53蛋白保守同源区域氨基酸的核苷酸序列而突变。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述p53保守同源区域选自由P1、P3和P5组成的组。
36.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述增殖性癌细胞引起了某一种疾病，该疾病选自由卵巢癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、纤维肉瘤、成视网膜瘤、黑素瘤、软组织肉瘤、骨内瘤、结肠癌、肾癌和胰腺癌组成的组。
37.一种治疗病灶性细胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括对增殖细胞施用突变Rb基因。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述增殖细胞引起某一种疾病，该疾病选自由眼睛中纤维增殖、血管增殖和瘤形成疾病组成的组。
39.一种治疗病灶性细胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括对增殖细胞施用突变p53基因。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述增殖细胞引起某一种疾病，该疾病选自由眼睛中纤维增殖、血管增殖和瘤形成疾病组成的组。
41.一种突变的成视网膜瘤蛋白，其特征在于，由如权利要求2所述的基因产生。
42.一种突变的p53蛋白，其特征在于，由如权利要求8所述的 基因产生。
43.一种治疗病理性细胞增殖疾病的方法，其特征在于，包括对非癌增殖细胞同时或连续地施用突变Rb基因和突变p53基因。
44.一种治疗个体恶性细胞疾病的方法，其特征在于，包括同时或连续地施用突变Rb基因和突变p53基因进入增殖的癌细胞。
全文摘要
本发明提供Rb和p53基因的突变型以及运用这些突变型进行治疗的方法。与突变Rb基因和p53基因一起，本发明提供含有突变的Rb基因或p53基因的质粒。此外，本发明提供用本发明中的质粒转染的细胞。而且，本发明提供治疗一系列病理生理性细胞增殖疾病的方法。
文档编号A61K48/00GK1133595SQ94193949
公开日1996年10月16日 申请日期1994年9月1日 优先权日1993年9月3日
发明者恽凯峰 申请人:研究发展基金会