一种野生型p53蛋白的分离纯化方法

专利名称：一种野生型p53蛋白的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于生物医药制品以及临床检测等相关领域，具体涉及一种野生型p53蛋白分离纯化的新方法。
背景技术：
p53基因是迄今为止发现与人类肿瘤相关性最高的基因，约半数以上的人类肿瘤存在P53基因的改变。人类p53基因定位于17pl3. 1，含11个外显子和10个内含子，编码分子量为53KD的核磷酸蛋白，故称之为p53。p53基因分为野生和突变两种类型。野生型 P53蛋白半衰期很短(20 30min)，在组织内不易积累，所以正常人体内的p53水平较低。 在肿瘤患者体内，P53基因发生突变，突变型p53蛋白半衰期长达20 40h，可在肿瘤组织中积累，同时大量P53蛋白释放到血液中，导致p53水平上升。按照p53基因其一级结构的特点，可以将其分为3个区域第一、带电荷的酸性N端区包含前部75 80aa，其结构类似转录因子酸性区。第二、亲水的富脯氨酸区人此区域为80 150aa，小鼠为75 150aa， 其结构类似转录因子的富脯氨酸区。第三、带电荷的碱性C端区。人的为319 393aa，小鼠为276 390aa，形成中级两性螺旋结均，能与DNA专一顺序结合。p53有5个进化保守区，分别位于第13-19、第117-142、第171-181、第236-258和第270-288号氨基酸残基。这些保守区的存在与P53蛋白的功能密切相关，可能是P53蛋白生物学活性的关键部位。p53基因作为体内的抑癌基因，主要在机体内发挥着如下重要的作用第一、参与细胞周期控制细胞内p53对各种可能引起肿瘤的异常情况起零耐受作用，能有效地防止细胞的恶性转化。DNA遭受各种损害均可激活p53，不同的蛋白激酶修饰P53不同的DNA结合活性，诱导激活不同的p53靶基因，导致细胞停顿于特定的周期位点ο第二、参与DNA的损伤应答一系列的研究表明，野生型p53并非为所有细胞的凋亡过程所必需，但对DNA损伤而诱发的细胞凋亡却是必不可少的。当DNA由于各种原因损伤后，野生型P53首先诱导细胞进入G期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。一旦DNA 不能被修复，野生型P53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。第三、p53与衰老流性病学研究表明，p53在预防肿瘤中具有重要作用，然而p53 过量表达对宿主是致死的。研究人员研究了 p53与衰老的关系以及p53抑制肿瘤但不加速衰老的可能性，结果表明虽然在某些条件下，P53可能加速衰老，但p53激活仍然不失为一条肿瘤治疗和预防的好策略。第四、参与细胞凋亡p53调节一些与凋亡有关的基因，这些基因有的编码控制线粒体的完整性的蛋白质，有的编码细胞膜的死亡受体蛋白质。细胞凋亡可能主要存在三条信号传导途径，即细胞凋亡的受体途径、线粒体途径和P53依赖的调控途径。大量的研究表明野生型的P53具有负调控细胞生长和诱导DNA损伤细胞走向细胞凋亡的功能。综上所述，p53是细胞应激的关键性调控分子之一，能整合多种细胞危急事件的信号，通过转录或非转录途径对这些信号作出包括生长抑制及凋亡在内的不同反应，监视细胞基因组的完整性。正常P53在体内扮演“分子警察”的角色，可以抑制肿瘤的发生。因此，检测人血清P53蛋白的水平，对肿瘤的早期诊断、判断愈后、监测复发、指导治疗以及高危人群筛查等都有一定的价值，血清P53蛋白水平是一种具有广阔应用前景的肿瘤生物学指标，可作为诊断肿瘤是否发生的一种候选辅助手段。为了更好地研究p53基因的功能，首先需要得到高浓度和高纯度的P53蛋白。以往的研究几乎都是通过原核表达系统，从诱导表达裂解的菌体沉淀的包涵体中通过变性而后复性的方式得到目的蛋白。这种方法虽然能使得原核表达的蛋白部分活性恢复，但是若需将此目的蛋白应用于BIAC0RE分子互作或是进行一些体内实验则还是存在一定的问题。

发明内容
本发明的目的是提供一种高效简便的生产高浓度、高纯度P53蛋白的新方法，尤其涉及一种野生型P53蛋白分离纯化的方法。本发明提供了一种野生型p53蛋白的分离纯化方法，包括P53基因的克隆、构建重组表达质粒和蛋白诱导表达及纯化，基于原核系统诱导表达，超声裂解菌体，利用镍柱亲和层析来分离纯化所得裂解上清中的P53蛋白。本发明所述p53蛋白的在ncbi 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的 GeneID 为:71570所述的构建重组表达质粒是将克隆获得的ρ53基因PCR产物，经双酶切后，与原核载体连接，连接产物转化大肠杆菌，再从转化的平板上挑取单克隆，抽提质粒。所述的诱导表达是重组表达质粒转化大肠杆菌后，加入LB培养液，37°C振荡培养过夜，然后在菌液中加入0. 05-0. 6mmol/L IPTG，在16°C _22°C这两种不同的温度下诱导表达，4-20小时。所述的蛋白纯化是预先用50%的Ni-NTA Slurry装柱，5倍柱体积的蒸馏水洗柱，而后用10倍柱体积的binding buffer平衡柱后，将离心得到的菌体上清过柱，收集流穿液，然后用10mM-50mM浓度的咪唑洗涤液和100mM-300mM洗脱液进行洗涤和洗脱，分步收集流出液，洗去非特异吸附的杂蛋白，收集特异性结合的P53蛋白。所述的重组表达质粒是pET-3h_p53。所述的p53基因的克隆是以人肝cDNA为模板PCR反应扩增获得p53基因的DNA 编码序列。所述的PCR反应退火温度为62°C。具体PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C 变性40s，62°C退火30s，72°C延伸1.5min，35个循环；最后72°C延伸IOmin0所述的PCR 反应的引物序列为 Tp53-A :5，-C CGA ATT CCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GATCC-3'和 Tp53-B 5' -AC GGA TCC TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TGT C_3，。本发明的最大的优势在于从原核系统诱导表达，超声裂解的菌体上清中利用镍柱亲和层析来分离纯化得到较大浓度的活性目的蛋白。本发明中没有进行包涵体的变性和复性，而是直接从超声裂解的上清中纯化蛋白，使得目的蛋白的活性得到了最大程度的保持，并通过优化诱导表达以及纯化方案使得目的蛋白的得率较之现有方法有了较大的提尚ο
具体实施例方式
实施例1ρ53蛋白的分离纯化一、材料与方法1.材料与试剂1. 1材料人肝cDNA，DH5a菌株，JM109感受态菌，H1299细胞由本实验室保存；真核表达载体pCMV-Myc，鼠(mouse)抗p53单克隆抗体购于Clontech公司；PCR扩增试剂盒； PCR产物纯化试剂盒购于Boehringer公司；细胞培养液及胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司；用^vitrogen脂质体转染试剂盒进行细胞瞬时转染；p53单克隆抗体(DOl) 购于SANTACRUZ公司所用引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。1. 2 试剂50XTAE :Tris 碱 242g加 ddH20 600ml 充分溶解，加冰乙酸 57. lml.O. 5M EDTA(pH 8. 0) 100ml，定容至 IL0琼脂糖凝胶1 % Agarose,以1 XTAE为溶剂。LB液体培养基(pH 7. 0)1% polyp印tone (DIFC0 公司产品)，0. 5% bacto-yeast extract (DIFC0 公司产品)，1% NaCl，121°C，高压湿热灭菌20min。氨苄青霉素(储存浓度100mg/ml) :0. 5g氨苄青霉素注入5ml灭菌ddH20充分溶解，分装于1. 5ml离心管中，-20°C保存。30%丙烯酰胺将^g丙烯酰胺和Ig亚甲双丙烯酰胺，溶于总体积为60ml的 ddH20中。加热至37°C溶解，补加水至终体积100ml，查证该溶液pH值应不大于7. 0，置棕
色瓶中保存于室温。10%过硫酸胺lg过硫酸胺溶解于IOml的ddH20中，4°C保存。1. 5mol/L Tris (pH 8.8) :50ml ddH20 中溶解 18. 16g Tris碱，加浓盐酸调节pH至 8. 0，加 ddH20 定容至 100ml。lmol/L Tris (pH 6. 8) :80ml 水中溶解 12. Ilg Tris 碱，加入浓盐酸调 pH。SDS-PAGE 胶配方
12%分离胶(20 ml)
5%浓缩胶(10 ml)H2O6.6 ml6.8 ml
30%丙稀酰胺8.0 ml1.7 ml
Tris-HCl 5.0 ml(1.5 Μ, pH8. 8) 0.25 ml (1.0 Μ, pH6. 8)
10%SDS0.2 ml0.1 ml
10%APS0.2 ml0.1 ml
TEMED8 ul10 μ 1 5XTris-Gly 电泳缓冲液:Tris 碱 15. lg, Glycine 94g, 10% SDS 50ml，加 ddH20 至IL0转移缓冲液=Tris 5. 8g，甘氨酸2. 9g，定容到800ml后加200ml甲醇，4°C预冷。
IXTBS =Tris 12. lg, Nacl 9g，用 IOOml 水溶后调 pH 到 7. 4，定容到 IL0IXPBS =Na2HPO4. 12H20 1. 44g, KCl 0. 2g, NaCl 8. 0g, KH2P04 0. 24g。调节 pH 至 7. 4，加ddH20定容至1L，120°C高压蒸汽灭菌20min，备用。洗涤缓冲液(IXTBST)含0. 2% Tween-20 的 TBS0封闭缓冲液含5%脱脂奶粉的1XTBS。丽春红染色液0. 5g丽春红中加入Iml冰醋酸，溶解后再加入IOOml水。蛋白分离纯化试剂裂解缓冲液加入少量的溶菌酶(终浓度为100mg/ml)和1 %的Triton-xlOO于 20ml IXPBS溶液中搅拌均勻，置于冰上待用(同上配方)；母液IMTris-CKpH 8. 0) 250ml (Tris 30. ^g，加入 HCl 约 Ilml 调节 pH 值)，IM 咪唑 250ml (咪唑 17. 02g)，2M NaCl 500ml (NaCl 58. 5g)，0. 5M 甘油 200ml (100ml 的 H2O 中加入IOOrnl的丙三醇)；
之后一系列咪唑梯度的缓冲液(加入对应母液后用ddH20补齐)
IOmM咪唑缓冲液200ml (10ml IM Tris-Cl, 2ml IM咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0. 5M
20mM咪唑缓冲液200ml (10ml IM Tris-Cl,4ml IM咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0. 5M
甘油)
甘油)；50mM 咪唑缓冲液 200ml (10ml IM Tris-Cl, 10ml IM 咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0.5M甘油)；IOOmM 咪唑缓冲液 200ml (10ml IM Tris-Cl, 20ml IM 咪唑，30ml 2M NaCl，20ml 0.5M甘油)；200mM 咪唑缓冲液 100ml (5ml IM Tris-Cl, 20ml IM 咪唑，15ml 2M NaCl, 10ml 0.5M甘油)；300mM 咪唑缓冲液 100ml (5ml IM Tris-Cl, 30ml IM 咪唑，15ml 2M NaCl, 10ml 0. 5M甘油)。2.方法2. Ip53基因的克隆以人肝cDNA为PCR反应模板，扩增p53基因的ORF。所用引物为Tp53-A :5，_C CGA ATT CCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CC-3，； (SEQ ID N01)Tp53-B :5，_AC GGA TCC TCA GTC TGA GTC AGG CCC TTC TGT C_3，(SEQ ID N02)。PCR 反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 40s，62°C退火 30s，72°C延伸 1. 5min, 35个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶中电泳，验证PCR扩增结果。2. 2重组表达质粒pET-3h_p53的构建纯化后的PCR产物及载体pET_32a，经双酶切后，用DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α。从转化的平板上挑取单克隆，抽提质粒。经琼脂糖凝胶电泳验证。筛选得到的阳性重组质粒pET-32a-p53进行测序鉴定。2. 3重组p53蛋白诱导表达及纯化重组表达质粒pET_3h-p53转化大肠杆菌后， 以1 50的菌量加入25个装有5ml LB培养液的玻璃管中37°C，250rpm振荡培养至OD = 0. 6时，分别改变诱导的温度、IPTG浓度以及诱导的时间以摸索最佳诱导表达条件。在菌液中分别加入0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6mmol/L IPTG，在16°C和22°C这两种不同的温度下诱导
6表达，4h，8h，12h，16h和20h后分别取样进行SDS-PAGE分析。 小量诱导最佳条件得到后，进行大量诱导表达。离心6000rpm，5min/次来收集菌体。用配制的裂解缓冲液反复吹打溶解菌体，经优化的超声破碎条件处理后离心12000rpm， 30min。得到的菌体上清置于冰上。预先用50%的Ni-NTA Slurry装Iml柱，5倍柱体积的蒸馏水洗柱，而后用10倍柱体积的binding buffer平衡柱后，将离心得到的菌体上清过柱，收集流穿液。用不同咪唑浓度的洗涤液(分别是10mM，20mM，50mM)和洗脱液(lOOmM， 200mM, 300mM)进行洗涤和洗脱，分步收集流出液，洗去非特异吸附的杂蛋白，收集特异性结合的目的蛋白。 各取等量的样品进行12%的SDS-PAGE电泳分析。电泳条件质量分数为5%的浓缩胶，质量分数为12%的分离胶。电压80V，跑30min后换120V电压，大约两小时后电泳结
束。考马斯亮蓝染色观察结果。将收集得到的含单一条带的蛋白样品混合后放在半透膜中在透析液(1XPBS溶液，PH7.4)中4°C搅拌，每4- 更换一次透析液，透析Mh。次日吸出透析后的p53蛋白样品混勻进行蛋白定量并置于-80°C冰箱中保存备用。2. 4目的蛋白Wfestern Blot检测将经IPTG诱导的pET_32a-p53菌体总蛋白及纯化透析后的P53蛋白样品一起进行15%分离胶的SDS-PAGE电泳检测。再将凝胶上的纯化蛋白在转移液中转移至硝酸纤维素膜上，经鼠抗人P53单克隆抗体、辣根酶标记的羊抗兔二抗各在37°C摇床上温育lh，加显色液室温避光显色5min，定影液中浸泡以终止反应。2. 5蛋白定量(Bradford法)取适量体积的蛋白加入1. 5ml的印pendorf管中， 补加实验缓冲液至lOOul，加入Iml的Bradford工作液震荡混勻，5分钟后在UV3000分光光度仪上检测A595。同时用BSA作标准曲线，而后根据标准曲线计算蛋白的浓度。二、实验结果1. PCR扩增野生型的p53基因从cDNA文库中，利用设计的特定引物扩增p53基因。在大约1200bp处出现了一条特异性的DNA条带。将PCR纯化产物克隆到pCMV_Myc载体中构建pCMV-p53载体。测序证实载体中克隆了 p53基因的0RF，全长为1179bp。2.重组表达质粒pET-3h_p53的构建及鉴定P53cDNA与载体pET_3h进行末端连接，转化DH5 α，挑取克隆经双酶切后在1200bp左右处出现一条带，由电泳结果初步判断重组质粒构建成功。电泳鉴定后的重组质粒其测序结果与Gene Bank中报道的p53cDNA序列完全一致。3.重组p53蛋白诱导表达条件的优化重组表达质粒pET-3h_p53转化大肠杆菌后，以1 50的菌量加入25个装有5ml LB培养液的玻璃管中37°C，250rpm振荡培养至OD =0.6时，分别改变诱导的温度、IPTG浓度以及诱导的时间以摸索最佳诱导表达条件。在菌液中分别加入0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 6mmol/L IPTG，在16°C和22°C这两种不同的温度下诱导表达，4h，8h，12h，16h和20h后分别取样进行SDS-PAGE分析。4.小量诱导后，进行大量诱导表达。收集得到菌体后，用配制的IXPBS缓冲液反复吹打溶解菌体，而后按照Ig菌体中加入6-8ml的裂解缓冲液进行充分裂解。待裂解充分时(约30min)，可见菌体由絮状变为较透明澄清的粘稠液体。而后进行超声破碎，超声条件超声ls，间隔3s，共超声50次；超声处理后菌体更加透明澄清并不再粘稠。离心 12000rpm，30min。将得到的菌体上清在4°C环境中与事先已平衡好的镍柱缓慢旋转孵育池。将此混合液过柱，收集流穿液用作样品检测。之后用不同咪唑浓度的洗涤液(分别是 IOmM, 20mM, 50mM)和洗脱液(lOOmM，200mM，300mM)进行分级洗涤和洗脱，分步收集流出液， 待充分洗去非特异吸附的杂蛋白，收集特异性结合的目的蛋白。上述过程都需在冰上进行， 并且需要实时用G250蛋白显色液检测流出液中蛋白的浓度分布情况。5.重组p53蛋白的Wfestern Blot鉴定将经IPTG诱导的pET_32a-p53菌体总蛋白及纯化以及透析后的P53蛋白样品一起进行12%的SDS-PAGE电泳，并将凝胶上的纯化蛋白转移至硝酸纤维素上，而后用特异的P53抗体检测蛋白的特异性。6.蛋白定量(Bradford法)在UV3000分光光度仪上检测蛋白的A595，并作BSA 标准曲线。根据绘制出的标准曲线计算出目的蛋白的浓度约为180ng/ul。实施例2流式细胞仪测定p53重组蛋白对H1299肿瘤细胞凋亡的影响选用浓度为180ng/ul的p53重组蛋白诱导的H1299细胞，分别在12h、Mh、48h、 7 这四个时间点收集细胞，用IXPBS(pH7. 4)洗涤一遍，置于柠檬酸缓冲液Ih后，离心去掉上清。先后加入适量的胰酶消化液、胰酶抑制剂，并加入PI暗处染色15min后，待成单细胞悬液，上机检测。经P53重组蛋白作用四个时间梯度的H1299肿瘤细胞在流式细胞仪均能检测到凋亡峰，相对对照组来说凋亡率有极大的提高。可见，随着P53重组蛋白作用时间的延长，凋亡率明显增加。实验组细胞凋亡率与对照组细胞凋亡率比较，均有统计学意义(P < 0. 05)。实施例3利用BIAC0RE分子互作仪检测纯化得到的p53蛋白与小分子的互作BIAC0RE分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子之间的相互作用。由于无需任何的标记物，真实地反应了生物分子间的各种作用，近年来得到了研究者的广泛应用。利用BIAC0RE分子互作仪来检测p53重组蛋白与Hbx的相互作用。预先测定重组蛋白的浓度，达到一定的浓度要求时即可进行蛋白耦连。用PH 4.0，4.5，5.0和5.5的醋酸钠缓冲液分别将待分析的目的蛋白稀释至50ug/ml，然后进样，使上述蛋白稀释液先后流经CM5传感芯片表面。两次进样之间用NaOH溶液来洗涤芯片表面，除去预吸附的蛋白质。 记录预吸附值最高的PH条件用其来进行下一步的耦连实验。选用上述得到的最适PH的醋酸钠溶液稀释蛋白后，进行蛋白耦连。而将Hbx耦连至GM5传感芯片的第二、三通道上，第一通道用作对照表面。每个蛋白样品重复两次，进样流速需控制在40ul/min，进样体积为 50ul，温度保持在20°C。最后在分析软件中进行曲线拟合及数据整合分析。实施例4利用生物发酵罐诱导菌体大量表达目的蛋白为了大量表达含有目的蛋白的菌体，使得实验进行更加高效，本发明利用生物发酵罐来诱导表达大肠杆菌，并利用之前摸索出的最优化的诱导表达方案来扩大化培养菌体，以供今后大量纯化目的蛋白P53使用。发酵罐不同于普通摇床诱导表达的主要特点在于第一、空间体积大，能一次性诱导表达IOL或50L的菌液；第二、由于其外接了很多管道，所以可以定时定量地加入IPTG并适时改变罐内的温度、压强、空气密度等等。第三、如有特殊需要，也可加入一些适量的添加物以达到最优诱导表达的目的。基于生物发酵罐上述的三个优点，本发明可以广泛利用发酵罐来进行各类菌体的诱导表达。经发酵罐大量诱导表达的P53菌体较之前的菌体菌龄更年轻、目的蛋白p53的表达更快，而且量也更多，并且大多在裂解后的上清中，这为今后表达纯化P53蛋白提供了一条有利的线索。生物发酵罐不仅适用于大肠杆菌等原核表达载体的诱导表达，而且在毕
8赤酵母等真核表达载体的大量诱导表达中也发挥着越来越重要的作用。由此可见，发酵罐将在从实验室科学研究逐步发展到产业化的过程中扮演重要的角色。
权利要求
1.一种野生型P53蛋白的分离纯化方法，包括P53基因的克隆、构建重组表达质粒和蛋白诱导表达及纯化，其特征在于，基于原核系统诱导表达，超声裂解菌体，利用镍柱亲和层析来分离纯化所得裂解上清中的P53蛋白。
2.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的构建重组表达质粒是将克隆获得的P53基因PCR产物，经双酶切后，与原核载体连接，连接产物转化大肠杆菌，再从转化的平板上挑取单克隆，抽提质粒。
3.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的诱导表达是重组表达质粒转化大肠杆菌后，加入LB培养液，37°C振荡培养过夜，然后在菌液中加入0. 05-0. 6mmol/L IPTG，在16°C -22°C的温度下诱导表达4_20小时。
4.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的蛋白纯化是预先用50% 的Ni-NTASlurry装柱，5倍柱体积的蒸馏水洗柱，而后用10倍柱体积的binding buffer平衡柱后，将离心得到的菌体上清过柱，收集流穿液，然后用10mM-50mM浓度的咪唑洗涤液和 100mM-300mM洗脱液进行洗涤和洗脱，分步收集流出液，洗去非特异吸附的杂蛋白，收集特异性结合的P53蛋白。
5.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的重组表达质粒是 pET-32a-p53o
6.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的p53基因的克隆是以人肝 cDNA为模板PCR反应扩增获得p53基因的DNA编码序列。
7.如权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的PCR反应退火温度为62°C。
8.如权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的PCR反应的引物序列为 Tp53-A 5' -C CGA ATT CCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CC-3'禾口 Tp53_B 5' -AC GGA TCC TCAGTC TGA GTC AGG CCC TTC TGT C-3，。
全文摘要
本发明属于生物医药制品以及临床检测等相关领域，主要涉及一种野生型p53蛋白分离纯化的新方法。本发明的野生型p53蛋白的分离纯化方法，包括p53基因的克隆、构建重组表达质粒和蛋白诱导表达及纯化，基于原核系统诱导表达，超声裂解菌体，利用镍柱亲和层析来分离纯化所得裂解上清中的p53蛋白。本发明从原核系统诱导表达，超声裂解的菌体上清中利用镍柱亲和层析来分离纯化得到较大浓度的活性目的蛋白。本发明中没有进行包涵体的变性和复性，而是直接从超声裂解的上清中纯化蛋白，使得目的蛋白的活性得到了最大程度的保持，并通过优化诱导表达以及纯化方案使得目的蛋白的得率较之现有方法也有了较大的提高。
文档编号C07K1/22GK102212525SQ20101014475
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者王佳 申请人:复旦大学