专利名称：一种由枯草芽孢杆菌j18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用。
背景技术：
目前，我国水果采后腐烂损失严重，造成了巨大经济损失。采后病原微生物的侵染是造成采后腐烂损失的最主要原因。但是在水果保鲜中大量使用化学杀菌剂给水果的食用安全造成了很大的影响，如何减少水果保鲜中化学杀菌剂的使用成为公众十分关注的食品安全问题。枯草芽抱杆菌Bacillus subtil is (Ehrenberg) Cohn是自然界中广泛的一种非致病细菌，能够分泌多种抗菌物质，其中抗菌蛋白或抗菌肽具有抑菌广谱性和高效性，对环境无污染、对人畜无毒无害、不产生抗药性等优点，在研究开发新型生物农药制剂中有广阔的利用价值。目前市场上的生物农药主要是以活菌体生物制剂为主，其在使用时常出现见效缓慢、防效也不稳定、易受紫外线影响等现象，并且在储藏过程中有效期较短，对储藏环境要求严格等。而抗菌蛋白或抗菌肽等生物农药则避免了外界环境对活菌体保存产生的影响，并且防效稳定、见效快。因此，抗菌蛋白或抗菌肽生物生物制剂比活菌体制剂更具有优势和应用前景。抗菌蛋白或抗菌肽的研究还能够为抗菌蛋白基因的克隆、转基因工程菌的构建，以及培育新的抗病品种打下良好的基础。
李智洋等利用硫酸铵沉淀法从枯草芽孢杆菌代谢物中沉淀出抗软腐菌的抗菌蛋白。黄保全等利用硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析等方法从枯草芽孢杆菌ElR-j发酵液中分离纯化出抗菌蛋白jl。San-Lang Wang等也从枯草芽孢杆菌W-18中提取出几丁质酶，分子量为20. 6kD,能够强烈抑制Fusariumoxysporum生长的作用。Wiehitra L.等从枯草芽孢杆菌NSRS89-24中分离纯化出β -1, 3-葡聚糖酶，β -1, 3-葡聚糖酶可以催化β -1, 3-葡聚糖多聚体水解，而达到抑制真菌生长的目的。
发明内容
本发明为解决现在技术中的问题，提供一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用，它对果实和农作物病害也都有显著的防治效果，是一种广谱高效的蛋白制品。本发明采用以下技术方案予以实现所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No. 3665，菌种名称枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis) J18。本发明一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白的制备方法，它包括以下步骤；J18抗菌蛋白的制备；
种子活化将枯草芽孢杆菌J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30°C、150-250rpm培养18h，得J18菌悬液；取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，于25°C培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，于30°C、150-250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30°C振荡培养，转速为150_250rpm ;得活化的菌悬液。种子培养将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150-250r/min，30°c摇床培养 16h。发酵培养使用30L发酵罐进行分批发酵；装料系数O. 6(18L)，接种量5%，发酵温度30°C，通气量O. 5m3/h，搅拌转速150_250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，PH 6. 8^7. 2，不流加调节pH值的酸碱性物质。发酵培养基配方为淀粉3g、蔗糖5g、硫酸锰30. 8mg/kg的溶液2mL、磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾1. 5g、豆柏30g，水1000mL。发酵周期34±2h。取菌株J18发酵上清液经O. 22 μ m孔径的细菌过滤器过滤制成无菌滤液；取无菌滤液，采用(NH4) 2S04沉淀法提取，在硫酸铵梯度40-70%下，4°C下沉淀过夜，8，000r/min离心20min,沉淀用O. 05mol/L磷酸缓冲液(pH 7. O)悬浮，SepherdexG-25层析除盐,真空冷冻干燥，获得J18抗菌蛋白。所述LB液体培养基的组分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg和水IOOOmLo
所述LB固体平板培养基的组分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼月旨15g和水IOOOmL0使用上述制备的J18抗菌蛋白制备的蛋白制品，所述蛋白制品为被膜剂或抗菌保鲜纸。所述被膜剂的制备方法包括以下步骤将J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6. O的壳聚糖溶液复配成浓度为O. 05mg/mL的被膜剂，即蛋白制品。所述抗菌保鲜纸的制备方法包括以下步骤按照J18抗菌蛋白溶液体积与氧化淀粉溶液体积5:4的比例，取浓度为O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均匀，得混合液，然后用毛刷将混合液均匀涂布于保鲜纸或普通包装纸上，室温下晾干，得抗菌保鲜纸，即蛋白制品。所述氧化淀粉溶液的配制称取160g可溶性淀粉，O. 96g高锰酸钾，Sg氢氧化钠，加入800mL水，加热至90-95°C，持续搅拌20_30min，冷却即得氧化淀粉溶液。所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治果实和农作物病害中的应用。所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治梨轮纹病、葡萄灰霉病和黄瓜镰刀霉中的应用。所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治梨采后黑斑病的应用。本发明中使用的壳聚糖具有高效抑制病原微生物繁殖和生长的作用，作为一种病原激发子可以提高果实自身的抗病性，作为一种生理调节剂具有延缓果实衰老等功能特性，对多种果实病害具有良好的防治效果。同时壳聚糖具有良好的自发成膜性，其所形成的选择性半透膜可以阻止O2的进入，限制CO2的排出，降低果蔬呼吸强度，同时半透膜允许果实在贮存期间乙烯透过；并且可以阻碍果蔬的蒸腾作用，从而减少果蔬的失重。壳聚糖包膜处理也能够显著地抑制果皮色泽的转变，减少果实腐烂发生与水分散失，保持果实较高硬度和VC含量，降低果实的失重率，延缓乙烯产生和呼吸代谢，降低果蒂部位病害发生。因此，壳聚糖包膜处理一方面在果实表面形成一层天然的屏障作用，避免或减少病原菌的浸染；另一方面可以通过调节果实生理代谢延迟果实贮藏期间的衰老，降低果实病害的发生。将J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6. O的壳聚糖溶液复配成浓度为O. 05mg/mL的被膜剂，浸果使用。本发明与现有技术相比具有的显著效果为本发明对果实和农作物病害有显著的防治效果，是一种广谱高效的蛋白制品，应用范围广等优点。，尤其对梨采后黑斑病的防治有显著效果，同时结合壳聚糖和保鲜纸的应用使防治更加有效。对梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病、黄瓜镰刀霉、棉花黄萎病、小麦赤霉病、玉米小斑病、辣椒疫霉病等果实和农作物病害也都有显著的防治效果，是一株广谱高效的拮抗菌株。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No. 3665，菌种名称枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis) J18。本发明一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白的制备方法，它包括以下步骤； J18抗菌蛋白的制备；种子活化将枯草芽孢杆菌J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基(其组分为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠IOgjJc IOOOmL)中，于30°C、150_250rpm培养18h，得J18菌悬液。取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，水IOOOmL)中，25°C培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，30°C、150-250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30°C振荡培养，转速为150-250rpm ;得活化的菌悬液。种子培养将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150-250r/min，30°C摇床培养 16h。发酵培养使用30L发酵罐进行分批发酵；装料系数O. 6 (18L)，接种量5%，发酵温度30°C，通气量O. 5m3/h,搅拌转速150_250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，PH 6. 8^7. 2，不流加调节pH值的酸碱性物质。发酵培养基配方为淀粉3g、蔗糖5g、硫酸锰30. 8mg/kg的溶液2mL、磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾1. 5g、豆柏30g，水1000mL。发酵周期34±2h。
取菌株J18发酵上清液经O. 22 μ m孔径的细菌过滤器过滤制成无菌滤液。取无菌滤液，采用(NH4)2SO4沉淀法提取,在硫酸铵梯度40-70%下，4°C下沉淀过夜,8，000r/min离心20min,沉淀用O. 05mol/L磷酸缓冲液(pH 7. O)悬浮，SepherdexG-25层析除盐,真空冷冻干燥，获得J18抗菌蛋白。被膜剂的制备。J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6. O的壳聚糖溶液复配成浓度为O. 05mg/mL的被膜剂，即蛋白制品。应用时将梨果浸入被膜剂中5min后拿出，室温下晾干。抗菌保鲜纸的制备按照J18抗菌蛋白溶液体积与氧化淀粉溶液体积5:4的比例，取浓度为O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均匀，得混合液，然后用毛刷将混合液均匀涂布于保·鲜纸或普通包装纸上，室温下晾干，得抗菌保鲜纸，即蛋白制品。所述氧化淀粉溶液的配制称取160g可溶性淀粉，O. 96g高锰酸钾，Sg氢氧化钠，加入800mL水，加热至90-95°C，持续搅拌20_30min，冷却即得氧化淀粉溶液。应用时将抗菌保鲜纸包装单个梨果或其它果品。J18抗菌蛋白制剂对梨采后黑斑病的防效采收后的梨果在O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白与成膜性良好，具有很好保鲜效果的1%壳聚糖复配的溶液中浸果后，对梨黑斑病的防效达到87. 7%，且增加了果实表面的光泽，提高了梨果硬度，减少了果实长时间放置的失水现象，延长了梨果的货架期。梨果包装上涂布有O. 05mg/mL的J18抗菌蛋白的保鲜纸后，对梨黑斑病的防效为79. 25%，在一定程度上保证梨果的品质，因此抗菌粗蛋白保鲜纸的应用也具有一定使用价值。同时J18抗菌蛋白制剂对梨轮纹病、葡萄灰霉病、黄瓜镰刀霉等都有显著的防治效果，其中被膜剂和抗菌保鲜纸对梨轮纹病的防效分别为80. 37%和78. 58%，对葡萄灰霉病的防效分别为78. 94%和77. 41%，对黄瓜镰刀霉的防效分别为76. 37%和74. 4%。
权利要求
1.一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白的制备方法，所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No. 3665，菌种名称枯草芽孢杆菌(Bacillussubstilis) J18，其特征是它包括以下步骤； J18抗囷蛋白的制备； 种子活化将枯草芽孢杆菌J18菌株从保存的甘油菌转接于LB液体培养基中，于30°C、150-250rpm培养18h，得J18菌悬液；取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到LB固体平板培养基中，于25°C培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于LB液体培养基试管中，于30°C、150-250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL LB液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30°C振荡培养，转速为150_250rpm ;得活化的菌悬液； 种子培养将活化的菌悬液接种到LB液体培养基中，150-250r/min，30°C摇床培养16h ； 发酵培养使用30L发酵罐进行分批发酵；装料系数O. 6 (18L)，接种量5%，发酵温度30°C，通气量O. 5m3/h，搅拌转速150_250r/min，溶氧(DO)保持在75%左右，流加食用豆油消泡，pH 6. 8^7. 2，不流加调节pH值的酸碱性物质； 发酵培养基配方为淀粉3g、蔗糖5g、硫酸锰30. 8mg/kg的溶液2mL、磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾1. 5g、豆柏30g，水IOOOmL ； 发酵周期34±2h； 取菌株J18发酵上清液经O. 22 μ m孔径的细菌过滤器过滤制成无菌滤液；取无菌滤液，采用(NH4)2S04沉淀法提取，在硫酸铵梯度40-70%下，4°C下沉淀过夜，8，000r/min离心20min,沉淀用O. 05mol/L磷酸缓冲液(pH 7. O)悬浮，SepherdexG-25层析除盐,真空冷冻干燥，获得J18抗菌蛋白； 所述LB液体培养基的组分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠IOg和水IOOOmL ； 所述LB固体平板培养基的组分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、琼脂15g和水 IOOOmL。
2.使用权利要求1中J18抗菌蛋白制备的蛋白制品，其特征是所述蛋白制品为被膜剂或抗菌保鲜纸。
3.如权利要求2所述的J18抗菌蛋白制备的蛋白制品的方法，其特征是所述被膜剂的制备方法包括以下步骤 将J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6. O的壳聚糖溶液复配成浓度为0. 05mg/mL的被膜剂，即蛋白制品。
4.如权利要求2所述的J18抗菌蛋白制备蛋白制品的方法，其特征是所述抗菌保鲜纸的制备方法包括以下步骤 按照J18抗菌蛋白溶液体积与氧化淀粉溶液体积5:4的比例，取浓度为0. 05mg/mL的J18抗菌蛋白溶液300mL加入240mL氧化淀粉溶液混合均匀，得混合液，然后用毛刷将混合液均匀涂布于保鲜纸或普通包装纸上，室温下晾干，得抗菌保鲜纸，即蛋白制品； 所述氧化淀粉溶液的配制称取160g可溶性淀粉，0. 96g高锰酸钾，Sg氢氧化钠，加入800mL水，加热至90-95 °C，持续搅拌20_30min，冷却即得氧化淀粉溶液。
5.权利要求1或2所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治果实和农作物病害中的应用。
6.权利要求1所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治梨轮纹病、葡萄灰霉病和黄瓜镰刀霉中的应用。
7.权利要求1所述的由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的蛋白制品在防治梨采后黑斑病的应用。
全文摘要
本发明涉及一种由枯草芽孢杆菌J18分离纯化的抗菌蛋白、蛋白制品、制备方法及应用，所述枯草芽孢杆菌J18菌种编号为CGMCC No.3665，菌种名称枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)J18，所述蛋白制品的制备方法为将J18抗菌蛋白与1%的用醋酸调至pH6.0的壳聚糖溶液复配成浓度为0.05mg/mL的被膜剂，用于浸果，也可将J18抗菌蛋白溶液与氧化淀粉溶液混合后涂于保鲜纸，制成抗菌保鲜纸用于包果，本发明它对果实和农作物病害有显著的防治效果，尤其对梨采后黑斑病的防治有显著效果，是一株广谱高效的拮抗菌株。
文档编号C12P21/02GK103045704SQ20121045483
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者宋水山, 宋聪, 贾振华, 黄亚丽, 马宏, 李惠荣 申请人:河北省科学院生物研究所