用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及逆流色谱技术领域，特别涉及用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱和方法。
【背景技术】
[0002]随着基因组学和蛋白质组学的诞生和DNA重组技术的发展，使得生产具有特殊生物活性功能的蛋白质等生物大分子及纳米颗粒产品成为可能。这些生物大分子通常以复杂的形态存在于复杂的介质中，对这些功能性生物大分子的结构表征和功能认知，以及进一步的开发和利用，都需要有高效率的分离制备技术作为下游支撑。目前常用的蛋白质分离纯化技术，如离子色谱、体积排阻色谱、反相高效液相色谱等色谱技术，都存在由固体支撑相导致的蛋白质等生物大分子的吸附和变性以及制备量有限等问题。因此，当前国际上逆流色谱的发展趋势之一就是利用液-液分配色谱的优势，研制和开发更加适合生物大分子分离制备的高速逆流色谱技术和装备。
[0003]虽然逆流色谱是一种制备型分离技术，但目前这项技术在生物大分子分离纯化上并没有达到工业化的生产规模。由于该项技术需要以高速旋转而产生的离心力场来实现固定相的保留，在它的放大过程中有一些技术问题需要进一步的研宄和解决。
[0004]逆流色谱仪是由Ito发明，继而逐渐发展起来的液液两相色谱系统。该技术被广泛应用到天然产品的大量分离和清理过程。逆流色谱仪的系统是特殊的，不需要固定柱的存在，而是利用溶剂系统中的上相或下相液体充当固定相。正因如此，没有固体柱便具有了其他分离色谱所没有的许多优势，包括样品的耗损、失活及污染等。1970年，该方法在分离速度以及效率上得到了稳定发展。1980年初，出现了跨世纪的标志性突破，那就是高速逆流色谱仪的产生，它可以在较短时间内快速分离大量样品。由于其较突出的性能优势，当今逆流色谱技术几乎将研宄重点全部集中到高速逆流色谱仪上面。
[0005]柱型是逆流色谱仪的核心，也是本专利的核心创新点，其发展过程经历了环形柱-平面螺旋柱-锥度螺旋柱-三维盘旋柱四种模式，其中环形柱结构最为简单，分析也相对简单，可以作为简单模型进行各种分析研宄，但是其固定相保留低，不能在实际生产中普及开来。对于生物大分子目前使用最为普遍的仍然是平面螺旋柱。
[0006]因此，逆流色谱技术领域急需一种三维螺旋柱，负载量大，固液分离率高，利于工业化生产的用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱和方法。
【发明内容】
[0007]本发明提供了用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱和方法，技术方案如下:
用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱，包括:线轴和空心圆管；
空心圆管内径为3-10mm，壁厚l_3mm，以螺旋状形式缠绕在线轴上。
[0008]优选的，在上述用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中，空心圆管为不锈钢管。
[0009]优选的，在上述用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中，不锈钢管为内径5mm、夕卜径6mm的316型不锈钢管。
[0010]优选的，在上述用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中，不锈钢管通过缠绕在支撑柱上进行成型，形成不锈钢螺旋管，再将去除支撑柱的螺旋管缠绕在线轴上，形成三维不锈钢旋风柱。
[0011]优选的，在上述用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中，还包括:若干接头，每根不锈钢管之间通过接头相连接。
[0012]优选的，在上述用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中，还包括:2个齿轮，一个齿轮固定安装于线轴的中心轴线上，线轴的支撑件同轴位置装有一个尺寸、形状完全与固定齿轮相同的行星齿轮，并且相互咬合。
[0013]用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的测试方法，包括如下步骤: 步骤一，将用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱安装于支架上，制成压实度连续控制线圈，再将压实度连续控制线圈安装于加载装置和紫外吸收装置之间； 步骤二，将固定相装于储液瓶中，流动相装于注射器内，；
步骤三，打开计算机检测程序；
步骤四，当计算机程序显示在紫外吸收数据稳定后，将固定相和流动相充满到加载装置内；
步骤五，固定相和流动相在加载装置内充分混合后，流入逆流色谱柱内；
步骤六，通过逆流色谱柱分离后的流动相在紫外信号实时监测下，得到最终产品；
步骤七，当计算机程序显示在紫外吸收数据再次稳定后，说明检测结束，并对最终分离出的样品进行观察，计算机对得到的数据进行计算；
步骤八，得出如下结论:(I)减缓流动相流速和混合进样有助于固定相的保留；(2)提高转速或/和加快流动相流速能够提高分离度，有助于固定相的分离。
[0014]优选的在上述用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的测试方法中，步骤六中提高转速在800-1000rpm范围内会使分离度升高，但当转速超过100rpm后转速对分离度的影响很小。
[0015]本发明的有益效果是:
1.本发明通过将不锈钢管以螺旋状形式缠绕在线轴上制成逆流色谱柱，不易损坏泄漏，使用寿命长，稳定性更高。
[0016]2.本发明采用内径3-10_、壁厚1-3_的空心圆管作为承载容器，负载量大，每周产量达到了 Hg，约为现有报道的设备的21倍。
[0017]3.本发明通过三维螺旋管的高速旋转产生变化的离心力场使两相溶剂在螺旋管中呈现单相性的分布，使固定相保留率较高。
[0018]4.本发明流动相的流速达到了 20ml/min，为现有报道的设备中最高。
[0019]5.本发明中，上相和下相均可以作为流动相，使用粘度较低的下相，例如:磷酸盐相，作为流动相所获得的分离效果更好。
[0020]6.本发明通过大量的实验得出:减缓流动相流速和混合进样有助于固定相的保留；提尚转速或/和加快流动相流速能够提尚分尚度，有助于固定相的分尚的结论，有利于根据实际需要，设置合适的流速，进而提高样品分离度，能够用于实验室中酶的开发和研宄，利于公斤级蛋白质制剂的工业化生产。
【附图说明】
[0021]下面结合附图和【具体实施方式】来详细说明本发明:
图1是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中不锈钢螺旋管的制作过程结构示意图。
[0022]图2是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的结构示意图。
[0023]图3是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的旋转方式及其支撑件结构示意图。
[0024]图4是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱安装于分离纯化实验检测系统内的结构示意图。
[0025]图5-7表示改变进样方式和流动相流速对蛋白分离实验结果的影响色谱图。
[0026]图8-11表示不同转速对12.5%双水相系统(ATPS)的蛋白分离实验结果的影响色谱图。
[0027]图12-14表示不同转速对14%ATPS相系统的蛋白分离实验结果的影响色谱图。
[0028]图15-16表示改变固定相流速对12.5%ATPS相系统下的二肽分离实验的影响色谱图。
[0029]其中，图1-16中的附图标记与部件名称之间的对应关系为:
线轴1，不锈钢管2，齿轮31、32，支撑柱4。
【具体实施方式】
[0030]本发明的核心为提供一种用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱和方法，解决了负载小，工业化实现困难的问题。
[0031]为了使本发明技术实现的措施、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
[0032]图2是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的结构示意图。
[0033]如图2所示，本发明提供了用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱，包括:线轴I和空心圆管2 ;空心圆管2内径为3-10_，壁厚1-3_，以螺旋状形式缠绕在线轴I上。
[0034]本实施例中，空心圆管2位不锈钢管，优选为内径5mm、外径6mm的316型不锈钢管。
[0035]图1是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱中不锈钢螺旋管的制作过程结构示意图，如图1所示，本实施例中，不锈钢管2通过缠绕在支撑柱4上进行成型，形成不锈钢螺旋管，再将去除支撑柱4的螺旋管缠绕在线轴I上，形成三维不锈钢旋风柱。
[0036]优选的，还包括:若干接头，每根不锈钢管2之间通过接头相连接。
[0037]图3是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的旋转方式及其支撑件结构示意图，如图3所示，本发明还包括:2个齿轮，一个齿轮31固定安装于线轴I的中心轴线上，线轴I的支撑件同轴位置装有一个尺寸、形状完全与固定齿轮相同的行星齿轮32，并且相互咬合。
[0038]图4是本发明用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱安装于分离纯化实验检测系统内的结构示意图。
[0039]如图4所示，用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱的测试方法，包括如下步骤:
步骤一，将用于大分子及纳米颗粒产品分离纯化的逆流色谱柱安装于支架上，制成压实度连续控制线圈，再将压实度连续控制线圈安装于加载装置和紫外吸收装置之间；步骤二，将固定相装于储液瓶中，流动相装于注射器内，；
步骤三，打开计算机检测程序；
步骤四，当计算机程序显示在紫外吸收数据稳定后，固定相和流动相通过蠕动泵或其它泵充满到加载装置内；
步骤五，固定相和流动相在加载装置内充分混合后，流入逆流色谱柱内；
步骤六，通过逆流色谱柱分离后的流动相在紫外信号实时监测下，得到最终产品；
步骤七，当计算机程序显示在紫外吸收数据再次稳定后，说明检测结束，并对最终分离出的样品进行观察，计算机对得到的数据进行计算；
步骤八，得出如下结论:(I)减缓流动相流速和混合进样有助于固定相的保留；(2)提高转速或/和加快流动相流速能够提高分离度，有助于固定相的分离。
[0040]进一步的得出，步骤六中提高转速在800-1000rpm范围内会使分离度升高，但当转速超过100rpm后转速对分离度的影响很小。
[0041]流体动力学平衡体系中，螺旋管的高速旋转产生变化的离心力场使两相溶剂在螺旋管中呈现单相性的分布。其中轻的一相总是倾于占据首