大小受控的大分子的制作方法

专利名称：大小受控的大分子的制作方法
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发明领域本发明涉及高度分支的大分子领域。本发明涉及与大分子结合的功能性基质领域。本发明还涉及大小受控的功能性树状分子(dendrimer)和锥形分子(dendron)领域，这些树状分子和锥形分子以其一端结合功能性基质，另一端结合靶标特异性配体。本发明还涉及组合化学、特异蛋白质检测方法、特异核酸或核酸/肽杂交检测方法领域，这些方法使用与高分枝聚合物结合的功能性基质，所述的聚合物与探针生物分子相连。
相关领域描述自首次报道(Fodor等，Nature 364，555-556(1993)；Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6230-6234(1986))以来，DNA微阵列已吸引了大量的注意力，因为其允许高通量分析DNA序列、遗传变异及基因表达。已知该方法学需要改进人类基因诊断的标准化和应用所必需的精确度、重现性及点均匀性(Hackett等，Nature Biotechnology 21，742-743(2003))。这些缺点主要是由表面性质及分子层间结构的差异远不理想引起。同样地，高通量靶检测体系领域包括使用固定的生物活性分子及生物分子的生物测定。
我们在此表明，制备在纳米级受控表面的DNA微阵列分辨单一错配碱基对，与在溶液中的DNA一样有效。该方法提供一种理想的DNA微阵列，其中各探针DNA链有足够空间与加入的靶标DNA以最小的位阻相互作用。显著增加的分辨效率确保人类基因诊断十分可靠。此外，该方法普遍应用于使用固定的生物活性分子及生物分子进行的各种生物测定。
亲和纯化法是用于分离和鉴别与配体结合的蛋白质的一种众所周知的技术(Cuatrecasas等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1968，61，636-643)。与不溶基质共价连接的配体与互补靶标蛋白之间的独特相互作用提供了从复杂混合物中分离生物分子所需的特异性。然而，其广泛使用受到选择有限以及不稳定的传统基质的影响。蛋白质与许多固相载体的显著非特异性结合已成为建立新基质的许久以来的难题(Cuatrecasas，P.J.Biol.Chem.1970，245，3059-3065)。因此，需要找到新的基质，其在特异性方面可与传统基质相当，且具有环境稳定性、界限分明、易与配体准确连接。
最初用于肽固相合成的氨基丙基控孔玻璃(或AMPCPG)似乎具有许多理想特征。然而，控孔玻璃(或CPG)表面是极性的，即使被覆盖也保留部分负电荷(Hudson，D.J.Comb.Chem.1999，1，403-457)。该特点在蛋白质的显著非特异性结合中起关键作用。因此，在亲和层析和肽固相合成中的应用皆有限。一旦将这些障碍消除，这些材料就有望得到广泛的使用。
配体的可接近程度是决定结合能力的关键因素。传统方法为引入间隔分子、提高配体的浓度以更好地暴露表面上的配体(Rusin，等，Biosensors &Bioelectronics 1992，7，367-373；Suen等，Ind.Eng.Chem.Res.2000，39，478-487；Penzol等，Biotechnol and Bioeng.1998，60，518-523；Spinke等，J.Chem.Phys.1993，99，7012-7019)。该方法在一定程度上可以使用，但配体间的间隔不足以及俘获分子在表面的随机分布问题仍未解决(Hearn等，J.Chromatogr.A.1990，512，23-39；Murza等，J.Chromatogr.B.2000，740，211-218；Xiao等，Langmuir 2002，18，7728-7739)。迄今已用两种方法来改善这些缺点。一种方法是利用大分子如蛋白质作为占位分子。将蛋白质偶联在基质上，再将该占位分子裂解下来并洗脱。在此方法中，留在基质上的连接分子之间可以获得一定的间距。然而，必须为各种不同的情形精心选择占位分子的以及设计脱保护途径(Hahn等，Anal.Chem.2003，75，543-548)。另一种方法是产生高度有序的自组装单层的锥形的锥形分子并在其顶部使用活性官能团(Xiao等，Langmuir 2002，18，7728-7739；Whitesell等，Langmuir 2003，19，2357-2365)。
此处我们提出以锥形分子对AMPCPG进行修饰，进一步将GSH连接至锥形分子的顶部以及与GST蛋白质结合的表面材料的特征。已将末端具有三或九个羧酸基团以及顶部具有一个胺基特征的锥形分子引入至基质中。羧基与固体表面共价连接。鉴于对谷胱甘肽S-转移酶(或GST)基因融合体系的深入的了解及广泛使用，将其选作配体连接在以锥形分子处理的基质上。基质与GST和两种融合蛋白(GST-PXP47，GST-Munc-18)的配体结合特性已进行了研究(Smith等，Gene 1988，67，31-40；Sebastian等，Chromatogr.B.2003，786，343-355；Wu等，Chromatogr.B.2003，786，177-185；De Carlos等，J.Chromatogr.B.2003，786，7-15)。
发明概述本发明提供了一种基质，其上结合大小受控的，优选与配体连接的锥形分子结合。
本发明提供了一种基质，包括有规则地间隔的、大小受控的大分子的分子层，所述的大分子包括含分枝区域和线性区域的聚合物，其中分枝区域的许多(plurality)末端与基质结合，线性区域的末端被官能化。在基质上，大分子可以规则的间隔隔开。具体地，大分子可在线性官能团之间以约0.1nm至约100nm的规则间隔隔开。具体地，大分子可以约10nm的规则间隔隔开。
在上述基质中，分枝区域末端可以-COZ、-NHR、-OR’或-PR”3官能化，其中Z可为离去基团，其中R可为烷基，其中R’可为烷基、芳基或醚，以及R”可为H、烷基、烷氧基或O。具体地，COZ可为酯、活化酯、酰卤(acidhalide)、活化酰胺或CO-咪唑基(imiazoyl)，R可为C1-C4烷基，以及R’可为C1-C4烷基。进一步地，在上述基质中，聚合物可为锥形分子(dendron)。再进一步地，聚合物的线性区域可包括间隔基团区域(space region)。以及间隔基团区域可通过第一官能团与分枝区域连接。该第一官能团可为，但不限于，-NH2、-OH、-PH3、-COOH、-CHO或-SH。再进一步地，间隔基团区域可包括与第一官能团共价结合的连接基团区域(linker region)。
在上述基质中，连接基团区域可包括取代的或未被取代的烷基、链烯基、链炔基、环烷基、芳基、醚、聚醚(polyether)、酯或氨基烷基基团。再进一步地，间隔基团区域可包括第二官能团。第二官能团可包括，但不限于-NH2、-OH、-PH3、-COOH、-CHO或-SH。第二官能团可位于线性区域的末端。并且保护基团可结合至线性区域的末端。该保护基团可对酸或碱不稳定。
在本发明的另一个实施方案中，在上述基质中，靶标特异性配体可结合至线性区域的末端。具体地，靶标特异性配体可为化合物、DNA、RNA、PNA、适体(aptamer)、肽、多肽、糖、抗体、抗原、仿生物质(biomimetics)、核苷酸类似物或其组合。进一步地，结合到大分子的线性区域的靶标特异性配体之间的距离可为约0.1至约100nm。
在本发明的另一个实施方案中，上述基质可由半导体、合成有机金属、合成半导体、金属、合金、塑料、硅、硅酸盐、玻璃或陶瓷制成。具体地，该基质可为，但不限于片状物(slide)、颗粒、珠状物(bead)、微孔或多孔材料。多孔材料可为膜、明胶或水凝胶。再具体地，珠状物可为控孔珠状物(controlled pore bead)。
本发明提供了一种制备有规则地间隔的、大小受控的大分子的分子层的方法，所述的大分子包括含分枝区域和线性区域的聚合物，其中分枝区域的多个末端与基质结合，线性区域的末端被官能化，所述的方法包括(i)使基质官能化以便其与大分子的末端发生反应；以及(ii)使大分子与基质接触使其末端与基质成键。
在该方法中，基质可由，但不限于半导体、合成有机金属、合成半导体、金属、合金、塑料、膜、硅、硅酸盐、玻璃或陶瓷制成。基质可为片状物、珠状物、微孔或多孔材料。多孔材料可为水凝胶、明胶或膜。珠状物可为控孔珠状物。
进一步地，在上述方法中，将靶标特异性配体固定在线性区域的末端，包括以下步骤i)从基质上的大分子的线性区域的末端脱除保护基团；以及ii)将靶标特异性配体或连接靶标特异性配体的连接分子与基质上的大分子的线性区域的末端接触，使配体或连接分子与末端形成键，其中连接分子为具有两种相同或不同官能团的连接分子。
在该方法中，基质上大分子的存在使靶标特异性配体与线性末端的结合受到的干扰最小。进一步地，在该方法中，基质上大分子的存在使靶标特异性配体特异性的靶标检测受到的干扰最小。再进一步地，靶标特异性配体可以规则的间隔隔开。具体地，可将靶标特异性配体以低密度置于基质上。在上述方法中，靶标特异性配体可为化合物、DNA、RNA、PNA、适体、肽、多肽、酶、糖、多糖、抗体、抗原、仿生物质、核苷酸类似物或其组合。
在另一个实施方案中，本发明还提供了一种用于检测基因中突变的诊断体系，其包括上述基质，其中线性区域的末端以靶标特异性寡核苷酸固定。这些寡核苷酸可特异地针对癌症相关基因。具体地，癌症相关基因可为p53。
在另一个实施方案中，本发明还提供了一种用于检测基因中突变存在的方法，其包括将上述基质与含有待分析基因的样品相接触，其中将线性区域的末端固定有靶标特异性寡核苷酸。在该方法中，基因可为癌症相关基因。进一步地，基因可为p53。
本发明的这些及其它目标将从本发明的下列描述、引用的图以及后面的权利要求中得到更全面的了解。
附图概述从后续详述及图将对本发明的了解更为全面，图仅作为示例，并不是对本发明的限制，并且其中

图1显示式I，其为分枝/线性聚合物或大小受控的大分子。
图2显示产生锥形分子的反应方案。X表示保护基团。
图3a-3c显示锥形分子修饰表面的检测。图3a显示表面修饰及杂交的方案。图3b显示使用的锥形分子的分子结构。图3c显示探针及靶标DNA链的DNA序列。探针寡核苷酸包括探针15’-NH2-C6-CAT TCC GNG TGTCCA-3’(SEQ ID NO1)及探针25’-NH2-C6-(T)30-CAT TCC GNG TGTCCA-3’(SEQ ID NO2)。靶标核苷酸包括靶标15’-Cy3-TGG ACA CTCGGA ATG-3’(SEQ ID NO3)及靶标25’-Cy3-CCT ACG AAA TCT ACTGGA ACG AAA TCT ACT TGG ACA CTC GGA ATG-3’(SEQ ID NO4)。
图4a-4b显示紫外光谱分析。(a)显示每步反应后的紫外光谱。EG/GPDS及锥形分子表示将锥形分子引入到乙二醇修饰的基质上前后获得的光谱，以及Deblock表示脱保护后的光谱。(b)显示稳定性测试。在室温下DMF中搅拌1天后的光谱表示为“洗涤”。
图5显示锥形分子修饰表面的敲击模式原子力显微(tapping modeatomic force microscopy，AFM)图像。使用了配备有“E”型扫描仪的NanoscopeIIIa AFM(Digital Instruments)。扫描面积为1.0×1.0μm2。
图6a-6d显示杂交后的荧光图像。6a-6b显示在锥形分子修饰表面上(a)探针1与靶标1之间或(b)探针1与靶标2之间杂交后获得的图像。6c-6d显示在APDES修饰表面上(c)靶标1与探针1或(d)靶标1与探针2之间杂交后记录的图像。
图7a-7f显示匹配的与内部错配的寡核苷酸对之间的强度差异。上图(a-c)为4×4阵列荧光图像，下图(d-f)显示来自该16点的一个样品点。(a)和(d)为具有DSC连接分子的以锥形分子修饰的微阵列，(b)和(e)为具有PDITC连接分子的以APDES修饰的微阵列，以及(c)和(f)为具有DSC连接分子的以APDES修饰的微阵列。具有DSC连接分子的以锥形分子修饰的微阵列及具有PDITC连接分子的以APDES修饰的微阵列的荧光图像显示，变异系数(CV)值小于10％，并且在单一点中的荧光信号均匀。另一方面，具有DSC连接分子的以APDES修饰的微阵列的荧光图像显示的点小得多，CV值大于20％，以及在单一点中的荧光信号不均匀。各像素大小为10×10μm2。
图8a-8b显示用于检测p53中单点突变的p53特异寡核苷酸探针与靶标DNA样品杂交后的荧光图像(a)[9]-酸锥形分子；及(b)[27]-酸锥形分子。
图9a-9b显示同时检测p53基因的7个热点hotspot。
图10显示以AMPCPG基质上的锥形分子制备样品E1(Fmoc-(3)酸)及E3(Fmoc-(9)酸)，以含20％哌啶的DMF溶液去除Fmoc保护基团再引入谷胱甘肽的示意图。
图11显示使用三种类型的珠状物与纯化的GST及GST裂解物相结合。M标记。为了比较，将GST裂解物直接电泳(泳道1)。作为对照，测试了纯化的GST对基质(A、E1及E3)的结合性(泳道2、3、4)。最后，检测了细胞裂解物的结合性以研究基质(A、E1及E3)的效率(泳道5、6、7)。
图12显示保护的第一代官能化的锥形分子(E1，Fmoc-(3)酸)，以及保护的第二代官能化的锥形分子(E3，Fmoc-(9)酸)。
图13显示源自细胞裂解物的GST对两种对照珠状物CL和CS的结合性，与E1和E3相比。M标记；泳道1CL；泳道2CS；泳道3E1；泳道4E3。
图14显示将三种融合GST蛋白(GST(28kDa)、GST-PXp47(41kDa)及GST-Mucnc18(98kDa))用于检测结合能力的变化。三种基质的相对结合能力以密度计测定。将所有基质对GST的结合能力设为100％。琼脂糖凝胶-4B(实心圆点)；E1(实心正方形)；E3(空心三角形)。
优选实施方案详述本申请中，“一种”用于指对象的单数和复数。
此处使用的″适体(aptamer)″指单链、部分单链、部分双链或双链的核苷酸序列，尤其是可便利复制的核苷酸序列，其能以非Watson-Crick碱基配对或三链形式的机制特异性分辨选择的非寡核苷酸分子或分子群体。
此处使用的″双功能团的″、″三功能的″及″多功能的″，当针对合成的聚合物或多价的同聚物或异聚物杂合结构而言的时候，指二价、三价或多价，或包括两种、三种或多种特异分辨元素、确定的序列片段或结合位点。
此处所用的″仿生物质″指模仿生物分子、分子基团、结构的分子、基团、分子结构或方法。
此处所用的“树枝状分子”为一种呈规则树状分枝的分子，其从中心出发或向中心通过分枝层连续或代代增加而形成。
此处所用的“″树枝状聚合物(dendritic polymer)″为一种呈规则树状分枝的聚合物，其从中心出发或向中心通过分枝层连续或代代增加而形成。术语树枝状聚合物包括以一个中心、至少一个内部分枝层及一个表面分枝层为特征的树状分子(dendrimers)(参见，例如Petar等Pages 641-645，Chem.inBritain，(August 1994)。″锥形分子″为一系列具有从焦点衍生的树状分子，该焦点或直接或通过一个连接部分与中心相连形成树状分子。许多树状分子包括两或多个与共同中心相连的锥形分子。然而，术语树状分子可广泛地用于包括单个锥形分子。
树枝状聚合物包括，但不局限于对称的和不对称的分支的树状分子、级联分子(cascade molecules)、树状物(arborols)等。在优选实施方案中，分枝臂可等长。例如，分枝通常出现在，但不限于位于前代分枝末端-NH2基团的氢原子上。然而，也包括还可使用不对称的树状分子。例如，基于赖氨酸的树状分子是不对称的，其分枝臂不等长。一个分枝出现在赖氨酸分子的ε氮原子上，而另一个分枝出现在与活性的羧基相邻的α氮原子上，该羧基将分枝连接在前代分枝上。
进一步地，已知即使不通过各分枝层的规则连续增加形成，高分枝聚合物，如高分枝多羟基化合物也可相当于树枝状聚合物，其分枝模式的规则程度接近于树状分子的规则程度。
此处所用的“高分枝的”或“分枝的”用来描述大分子或锥形分子结构，指具有多个能与基质共价结合或通过离子作用结合的末端的多种聚合物。在一个实施方案中，预先制备包括分枝或高分枝结构的大分子，然后将其与基质结合。因此，本发明的大分子不包括美国专利No.5,624,711(Sundberg等)中公开的聚合物交联方法。
此处所用的“固定的”指不溶或包括不溶的，连接于或共同结合于部分不溶的、胶状的、颗粒状的、分散的、悬浮的和/或脱水的物质，或分子或固相，其包括固体载体的或与固体载体相连。
此处所用的“库”指分子、材料、表面、结构形状、表面特征或，任选地且不限于，各种化学实体、单体、聚合物、结构、前体、产物、变异体、衍生物、物质、构象、形状或特征的随机或非随机的混合物、群或类。
此处所用的“配体”指能以基于包括互补碱基的配对的亲和性作用而与另一种分子特异结合的选择性分子。配体包括，但不局限于核苷酸、各种合成化学物质、受体激动剂、部分激动剂、混合激动剂、拮抗剂、诱导反应的分子或刺激分子、药物、激素、信息素、递质、内分泌物、生长因子、细胞因子、辅基、辅酶、辅因子、底物、前体、维生素、毒素、调节因子、抗原、半抗原、糖、分子类似物、结构分子、效应分子、可选择的分子、生物素、地高辛、交叉反应物、类似物、竞争物或及这些分子的衍生物，还包括从库中挑选的非寡核苷酸分子，其能与选择性靶标特异结合以及通过将这些分子中的任一种与第二种分子结合形成的络合物。
此处所用的“连接分子”及“连接物”指将大小受控的大分子的分枝部分，如分枝/线性聚合物与保护基团或配体连接的分子。连接分子，例如包括但不限于，间隔分子，例如，能将配体与锥形分子结合的选择的分子。
此处所用的“低密度”指约0.01至约0.5个探针/nm2，优选约0.05至约0.2，更优选约0.075至约0.15，最优选约0.1个探针/nm2。
此处所用的“分子模拟物”和“模拟物”为天然或合成的核苷酸或非核苷酸分子，或分子被设计、选择、制备、修饰或加工成具有等价于另一种分子或分子群体的结构或功能，如天然存在的生物或选择性分子的结构或功能。分子类似物包括分子及多分子结构，能起着天然的、合成的、可选择的或生物分子的代替物、备选对象、优化物、改善物、结构类似物或功能类似物。
此处所用的“核苷酸类似物”指能用来代替核酸合成和加工，优选酶合成及化学合成和加工过程中天然存在的碱基，尤其是能与碱基配对的被修饰的核苷酸以及不包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或稀有碱基的任选合成碱基。该术语包括，但不局限于被修饰的嘌呤和嘧啶、微量碱基、可转变的核苷、嘌呤和嘧啶的结构类似物、标记的、衍生的及被修饰的核苷和核苷酸、偶联的核苷和核苷酸、序列修饰物、末端修饰物、间隔基团修饰物以及具有骨架修饰的核苷酸，这些修饰包括，但不局限于核糖被修饰的核苷酸、亚磷酰胺酯(Phosphoramidate)、硫代磷酸酯、亚磷酰胺(phosphonamidites)、磷酸甲酯、磷酰胺甲酯(phosphoramidite)、亚磷酰胺甲酯、5′-β-氰基乙基亚磷酰胺、亚甲基磷酸酯(methylenephosphonate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、肽核酸、无手性的和中性的核苷酸间连接以及非核苷酸桥，如聚乙二醇、芳香族的聚酰胺及脂质。
此处所用的“聚合物”或”分枝/线性聚合物”指在分子一端具有分枝结构且在另一端具有线性部分的分子，以便分枝部分与基质结合，并且线性部分与配体、探针或保护基团结合。
此处所用的“多肽”、”肽”及”蛋白质”可替换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于下述氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物，该术语也适用于天然存在的氨基酸聚合物。该术语还可包括传统肽连接的变异体，该连接将氨基酸连接起来形成多肽。
此处所用的“保护基团”指与分子上的反应基团(如羟基或胺)相连的基团。在一或多步化学反应中选择保护基团以防止特定基团的反应。通常选择的具体保护基团允许随后将其去除，以恢复反应基团，不改变分子中存在的其它反应基团。根据所保护的具体基团的功能及其将要暴露的化合物选择保护基团。保护基团的选择已为本领域技术人员所熟知。例如，见Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis，2nd ed.，John Wiley & Sons，Inc.Somerset，N.J.(1991)，在此全部引入以供参考。
此处所用的“保护的胺”指已与氨基保护基团反应的胺。氨基保护基团防止当线性顶部的官能团为氨基时在分枝末端连接到固体载体的过程中形成酰胺的反应。随后可将氨基保护基团去除，恢复氨基，而不改变存在于分子中的其它反应基团。例如，环外的胺可与二甲基甲酰胺乙缩醛反应，形成二甲基氨基亚甲基氨基官能团。氨基保护基通常包括氨基甲酸酯、苄基、脒(imidate)以及本领域技术人员已知的其它基团。优选的氨基保护基包括，但不局限于对硝基苯基乙氧基羰基或二甲基氨基亚甲基氨基。
此处所用的“规则的间隔”指大小受控的大分子顶部之间的间隔，距离为约1nm至约100nm，以允许在靶标特异性配体与靶标之间具有空间无位阻地充分相互作用的空间。因此，基质上的大分子层不太密集以便可能发生特异性分子相互作用。
此处所用的“固体载体”指一种组合物，其包括固定的基质，例如但不局限于不溶物质、固相、表面、基质、层、涂层、纺织或非纺织纤维、基质、晶体、膜、不溶的聚合物、塑料、玻璃、生物的或生物相容性或生物溶蚀材料或可生物降解的聚合物或基质、微粒或纳米颗粒。固体载体，例如包括但不限于，单层、双层、商品化的膜、树脂、基质、纤维、分离介质、层析载体、聚合物、塑料、玻璃、云母、金、珠状物、微球体、纳米球体、硅、砷化镓、有机及无机金属、半导体、绝缘体、微观结构及纳米结构。微观结构和纳米结构可包括不限于微型化的纳米级和超分子探针、尖、棒、钉、塞、杆、套、丝、线及管。
此处所用的“间隔分子”指一或多个核苷酸和/或非核苷酸分子、基团或间隔基臂，精选或设计间隔基臂用于连接两个核苷酸或非核苷酸分子，并优选地用来改变或调节两个核苷酸或非核苷酸分子之间的距离的此处所用的“特异性结合”指配体与其特异性结合伴侣之间或确定的序列片段与选择的分子或选择的核酸序列之间的吸引地可测量及可重现的程度。吸引的程度不必最大化至最佳程度。微弱的、中等的或强烈的作用可适于不同的应用。在这些相互作用中出现的特异性结合已被本领域技术人员所熟知。当用于指合成的确定序列片段时，指合成的适体、合成的异聚体、核苷酸配体、核苷酸受体、形状分辨元素及特别是指能够产生吸引的表面。术语”特异性结合”可包括结构形状和表面特征的特异性分辨。此外，特异性结合明确指两种分子(如特异性结合伴侣)之间特异的、可饱和的、非共价的相互作用，其可被第三分子(如竞争物)竞争性抑制，第三分子与特异性结合伴侣之一具有共同的化学特性(如一或多个同样的化学基团)或分子分辨特性(如分子结合特异性)。例如，竞争物可为抗体或其抗原的、配体或其受体的或适体或其靶标的交叉反应物或类似物。例如，抗体与其抗原之间的特异性结合可被交叉反应性抗体或被交叉反应性抗原竞争性抑制。术语”特异性结合”可便利地用于近似或简化一组特异性分辨，既包括特异性结合也包括结构形状分辨。
此处所用的“基质”，当用于指一种物质、结构、表面或材料的时候，指一种组合物，其包括非生物的、合成的、无生命的、平面的、球形的或平的表面，迄今为止还不为人所知道地包括特异性结合、杂交或催化分辨位点或多个不同分辨位点或一些不同分辨位点，超过包括该表面、结构或材料的不同分子种类的数目。基质，例如但不限于，可包括半导体、合成(有机)金属、合成半导体、绝缘体及掺杂剂；金属、合金、元素、化合物及矿物；人造的、裂解的、风化的、石印的、印刷的、机械制造的及微观制备的片、设备、结构及表面；工业化的聚合物、塑料、膜；硅、硅酸盐、玻璃、金属及陶瓷；木材、纸、纸板、棉、羊毛、布、纺织及非纺织的纤维、材料及织物；纳米结构及微观结构，未通过分枝/线性聚合物将探针分子固定进行修饰。
此处所用的“靶标-探针结合”指两或多种分子，至少一种为选择的分子，以一种特异的方式相互连接。通常，第一种选择的分子可与第二种分子结合，或是间接地，如通过介于其间的间隔基臂、基团、分子、桥、载体或特异性分辨伴侣，或是直接地，即无介于其间的间隔基臂、基团、分子、桥、载体或特异性分辨伴侣，以直接结合更有利。选择的分子可通过杂交与核苷酸特异性结合。核苷酸与非核苷酸结合的其它非共价方式包括，例如，离子键、疏水相互作用、配体-核苷酸结合、螯合剂俭属离子对或特异结合对如亲和素/生物素、链亲和素/生物素、抗荧光素/荧光素、抗2，4-二硝基酚(DNP)/DNP、抗过氧化物酶/过氧化物酶、抗地高辛/地高辛，或更常见为受体/配体。例如，将其与选择的分子或选择的核酸序列结合例如用于标记目的的报告分子如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、荧光素酶、若丹明、荧光素、藻红蛋白、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶鎓酯或荧光微球体，，使用亲和素/生物素、链亲和素/生物素、抗荧光素/荧光素、抗过氧化物酶/过氧化物酶、抗DNP/DNP、抗地高辛/地高辛或受体/配体(即优于直接或共价结合)，可通过特异性结合对的方式与选择的分子或选择的核酸结合。
大分子聚合物通式图1的图可描述本发明的聚合物。各R、T、W、L及X基团变量标明在图1中。本发明的大分子聚合物可包括任何分枝的或高分枝的、对称的或不对称的聚合物。聚合物的分枝末端可优选以多个末端结合在基质上。聚合物的线性末端可以官能团结束，保护基团或靶标特异性配体可与该官能团结合。在基质上的多个聚合物中，探针之间的距离可为约0.1nm至约100nm，优选约1nm至约100nm，优选约2nm至约70nm，更优选约2nm至约60nm，最优选约2nm至约50nm。
R-基团参照图1中所示的式I，聚合物通常包括分枝部分，其中多个末端被官能化与基质结合。在此分枝部分中，第一代分枝基团Rx(R1、R2、R3)通过官能团W与第二代分枝基团Rxx(R11、R12、R13、R21、R22、R23、R31、R32、R33)连接。分枝的第二代基团通过官能团W与第三代分枝基团Rxxx(R111、R，112、R113、R121、R122、R123、R131、R132、R133、R211、R212、R213、R221、R222、R223、R231、R232、R233、R311、R312、R313、R321、R322、R323、R331、R332、R333)连接。以及进一步地，第四代基团可以同样的方式与第三代分枝连接。末端R基团被官能化以使其能与基质结合。
各代的R基团可相同或不同。通常，R基团可为重复单位、线性或分枝的有机部分，例如但不局限于烷基、链烯基、链炔基、环烷基、芳基、醚、聚醚、酯、氨基烷基等。然而，还应当理解为，不是所有R基团都必须为相同的重复单位。也不是R基团的所有价位都必须以重复单位填充。例如，在第一代分枝Rx，即R1、R2、R3中，该分枝水平上的所有R基团均可为相同的重复单位。或者，R1可为重复单位，且R2和R3可为H或任何其它化学实体。或者，R2可为重复单位，且R1和R3可为H或任何其它化学实体。同样地，对于第二和第三代分枝来说，任何R基团可为重复单位、H或任何其它化学实体。
因此，可以此方式构成各种聚合物形状，例如，若R1、R11、R111、R112及R113为相同的重复单位，且所有其它R基团为H或一些小的中性分子或原子，则构成了具有分枝的相当细长的聚合物，其分枝具有三个官能团末端R111、R112及R113。也可能为其它各种任选的化学结构。因此，可能获得约3至约81个具有能与基质结合的官能团的末端。末端的优选数目可为约3至约75、约3至约70、约3至约65、约3至约60、约3至约55、约3至约50、约3至约45、约3至约40、约3至约35、约3至约30、约3至约27、约3至约25、约3至约21、约3至约18、约3至约15、约3至约12、约3至约9或约3至约6。
T-末端基团末端基团T为具有足够活性进行加成反应或取代反应的官能团。这类官能团的实例包括但不限于，氨基、羟基、巯基、羧基、链烯基、烯丙基、乙烯基、酰氨基、卤素、脲、环氧乙烷基(oxiranyl)、吖丙啶基、噁唑啉基、咪唑啉基、磺酸根合(sulfonato)、磷酸根合(phosphonato)、异氰酸根合、异硫氰酸根合、硅烷基及卤素。
W-官能团在图1的式I中，W可为可将聚合物与另一种聚合物(或任何其它二价有机部分)连接的任何官能团，如但不局限于醚、酯、酰胺、酮、脲、氨基甲酸乙酯、酰亚胺、碳酸酯、羧酸酐、碳二亚胺、亚胺、偶氮基团、脒、硫代羰基、有机硫化物、二硫化物、聚硫化物、有机亚砜、亚硫酸酯、有机砜、磺胺、磺酸酯、有机硫酸酯、胺、有机磷酸基团、烯、环氧烷烃、烯胺等。
L-间隔基团或连接基团在图1中，聚合物的线性部分可包括间隔基团区域，该区域由任选由散布于期间的与官能团连接的连接基团区域组成。连接基团区域可包括各种聚合物。连接基团区域的长度可取决于各种因素，包括与基质结合的分枝官能团的数目、与基质的结合力、所用的R基团的类型，具体为所用的重复单位的类型、与聚合物线性部分顶部连接的保护基团或靶标特异性配体的类型。因此，应当理解，连接基团区域不局限于任何具体的聚合物类型或任何具体的长度。然而，一般而言，连接基团区域的长度可为约0.5nm至约20nm，优选约0.5nm至约10nm，以及最优选约0.5nm至约5nm。
连接基团区域的化学结构可包括但不限于，线性或分枝的有机部分，例如但不局限于取代的或未被取代的烷基、链烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基、醚、聚醚、酯、氨基烷基、聚亚烷基二醇等。连接基团区域可进一步包括官能团，如上述官能团以及那些不局限于任何具体结构的官能团。
在顶部官能化的连接基团可包括保护基团。因此，一方面，本发明涉及一种与多重分枝/线性聚合物结合的基质，这些聚合物包括与保护基团连接的线性顶部。该基质可以化学反应脱掉保护基团，以靶标特异性配体取代。因此，在本发明体系的功能用途上，提供了与多重分枝/线性聚合物结合的基质，所述的聚合物连接了各种靶标特异性配体。
X-保护基团保护基团的选择取决于众多因素，如对酸或碱不稳定的要求。因此，本发明不局限于任何具体的保护基团，只要其发挥防止官能团与另一化学实体反应的保护功能，并且在所需的特定条件下能将其脱离。优选地，保护基团易于脱离。可用于本发明的这些保护基团的实例包括但不限于，以下基团氨基酸保护基团甲基、甲酰基、乙基、乙酰基、叔丁基、甲氧苯基、苄基、三氟乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺、叔丁氧基羰基、苯甲酰基、4-甲基苄基、Thioanizyl、Thiocresyl、苄氧基甲基、4-硝基苯基、苄氧基羰基、2-硝基苯甲酰基、2-硝基苯基亚磺酰基(sulphenyl)、4-甲苯磺酰基、五氟苯基、二苯基甲基(Dpm)、2-氯苄氧基羰基、2，4，5-三氯苯基、2-溴苄氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基、三苯基甲基、2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氢吡喃-6-磺酰基、邻苯二甲酰、3-硝基邻苯二甲酰、4，5-二氯邻苯二甲酰、四溴邻苯二甲酰、四氯邻苯二甲酰。
醇的保护基团对甲氧苄氧甲基(p-AOM)、苄氧基甲基(BOM)、叔丁氧基甲基、2-氯四氢呋喃(THF)、愈创木酚甲基(GUM)、(1R)-薄荷氧基氧甲基(MM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、甲氧乙氧基甲基(MEM)、甲氧基甲基(MOM)、邻硝基苄氧基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEM)。
DNA、RNA保护试剂2′-OMe-Ac-C-CE亚磷酰胺、2′-OMe-Ac-RNACPG、2′-OMe-I-CE亚磷酰胺、2′-OMe-5-Me-C-CE亚磷酰胺、Ac-C-CE亚磷酰胺、Ac-C-RNA 500、dmf-dG-CE亚磷酰胺、dmf-dG-CPG 500、2-氨基-dA-CE亚磷酰胺(M.P.Reddy，N.B.Hanna，and F.Farooqui，Tetrahedron Lett.，1994，35，4311-4314；B.P.Monia，等，J.Biol.Chem.，1993，268，14514-14522)。
有机合成中的常用保护试剂(二甲基-叔丁基甲硅烷基氧)甲基氯化物(SOMCl)、乙氧基乙基氯化物(EECl)、-氯醚、邻硝基苄氧基甲基氯化物、b，b，b-三氯乙氧基甲基氯化物(TCEMCl)，(-)-Menthyl酯、(P)-苄基酯、1，1，1，3，3，3-六氟-2-苯基-2-丙基醚、1，1，3，3-四甲基-1，3，2-二硅氮烷(disilazane)、1，2，4-二噻唑烷-3，5-二酮、1，2-二溴化物、1，2-二氯化物、1，2-二醇单-4-甲氧基苄基醚、1，2-二醇单-叔丁基醚、1，2-二醇单乙酸酯、1，2-二醇单烯丙基醚、1，2-二醇单苯甲酸酯、1，2-二醇单苄基醚、1，2-二醇单甲苯磺酸酯、1，3-苯并二硫戊烷、1，3-苯并二硫戊烷-2-基醚、1，3-二醇单-4-甲氧基苄基醚、1，3-二醇单苯甲酸酯、1，3-二醇单苄基醚、1，3-二噁烷、1-(2-(三甲氧基甲硅烷基)乙氧基)乙基醚、1-金刚烷基酯，1-苯甲酰-1-丙烯-2-基胺、1-乙氧基乙基醚、1-甲氧基亚乙基缩醛、1-甲基-1-甲氧基乙基醚、1-苯基-3，5-二-叔丁基环己二烯-4-酮胺、1-苯基乙基酯、2，2，2-三氯乙氧基甲基醚、2，2，2-三氯乙基碳酸酯、2，2，2-三氯乙基酯、2，2，2-三氯乙基磷酸酯、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺胺、2，2-二甲基-4-戊烯酸酯、2，3，6-三甲基-4-甲氧基苯磺胺、2，4，6-三甲基苯磺酰胺、2，4-DNP腙、2，5-二氯苯基磷酸酯、2，5-二甲基吡咯、2-(2-甲氧基乙氧基)乙基酯、2-(4-硝基苯基)乙基醚、2-(4-硝基苯基)乙基磷酸酯、2-(4-甲苯磺酰基)乙基酯、2-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-(三甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯、2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯、2-(三甲基甲硅烷基)乙基醚、2-苯磺酰基乙基硫醚，2-溴乙基酯、2-氯乙基酯、2-氯苯基磷酸酯、2-氰基乙基磷酸酯、2-甲氧基乙基酯、2-硝基苯磺酰胺、2-硝基苯磺胺、2-噁唑啉、2-苯基乙基酯、2-吡啶基二硫化物、2-四氢吡喃基胺、4-氯苯甲酸酯、4-氯丁基酯、4-甲氧基苯甲酰胺、4-甲氧基苯甲酸酯、4-甲氧基苄基胺、4-甲氧基苄基酯、4-甲氧基苄氧基甲基醚、4-硝基苯甲酰胺、4-硝基苯甲酸酯、4-硝基苄基酯、4-硝基苄基醚、4-硝基苄基磷酸酯、4-硝基苯基酯、4-硝基苯基腙、4-甲苯磺胺、4-甲苯磺酸酯、9-芴基甲基碳酸酯、9-芴基甲基酯、烯丙基碳酸酯、烯丙基酯、苯磺胺、苯磺酸酯、苄基碳酸酯、苄基酯、BOM醚、DMTr醚、MEM醚、甲烷磺胺、甲烷磺酸酯、乙基碳酸酯、MMTr醚、MOM碳酸酯、MOM酯、MOM醚、MTHP醚、MTM酯、MTM醚、N-4-甲氧基苄基酰胺、N-4-甲苯基酰胺、N-苯磺酰基酰胺、N-苄基亚胺、正丁基酯、正丁基醚、O-4-甲氧基苄基氨基甲酸酯、O-9-芴基甲基氨基甲酸酯、苯基硫醚、苯基硫醇酯哌啶酰胺、PMB醚、SEM酯、SEM醚、琥珀酸酯、叔丁基碳酸酯、叔丁基酯、叔丁基醚、叔丁基磷酸酯、叔丁基硫醚、叔丁基硫醇酯、TBDMS酯、TBDMS醚、TBDPS醚、TES醚、THF醚、THP醚、TIPDS二醚、TIPS醚、TMS酯、TMS醚、TMS硫醚、甲苯磺酰基腙、TPS醚、三氟乙酰胺。
商品化的保护基团可在Sigma-Aldrich(2003)目录中找到，其中关于公开的保护基团的内容在此全部引入以供参考。
通常，在本发明的一方面，用于本发明的保护基团可为那些在将一或多个氨基酸或适合的保护氨基酸依次加至增长的肽链过程中使用的基团。通常地，第一个氨基酸的氨基或羧基受适合的保护基团的保护。
在一个特别优选的方法中，氨基功能受酸或碱敏感的基团保护。这些保护基团应具有下述特性，即在形成连接的条件下稳定，而在不破坏正在增长的分枝/线性聚合物的情况下易于被移去。这些适合的保护基团可为，但不限于，9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、叔丁基氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、二苯基异丙基-氧基羰基、新戊基氧基羰基、异龙脑基氧基羰基、(α，α)-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁基氧基羰基等。
特别优选的保护基团还包括2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmc)、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、金刚烷基氧基羰基、苄基、邻溴苄氧基羰基、2，6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、cyclophenyl及乙酰基(Ac)、1-丁基、苄基及四氢吡喃基、苄基、p-甲苯磺酰基以及2，4-二硝基苯基。
在加成方法中，线性/分枝聚合物的分枝末端与适合的固体载体连接。可用于上述合成的适合的固体载体为那些材料，其对逐步的缩合-脱保护反应的试剂及反应条件表现出惰性，且不溶于所用的介质。
保护基团如Fmoc自分枝/线性聚合物线性顶部的脱去可通过用仲胺，优选哌啶处理来完成。可将保护部分以3倍摩尔过量引入，偶联可优选在DMF中完成。偶联试剂可为，但不限于，O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，1当量)及1-羟基-苯并三唑(HOBT，1当量)。
聚合物可在连续或单一操作中脱保护。多肽的脱去及脱保护可在一次操作中完成，即通过裂解试剂例如茴香硫醚、水、乙二硫醇及三氟乙酸处理与基质结合的多肽。
下述表1列出各种类型的例证性化合物。然而，应当理解为，X、L、W、R及T的改变也包括在本发明中。
表1-代表性和例证性的大分子化合物
靶标特异性配体或探针与分枝/线性聚合物的线性末端结合的靶标特异性配体，也称为探针，可包括各种化合物，其包括化学物质、生物化学物质、生物活性化合物等。在这方面，配体可为核酸、寡核苷酸、RNA、DNA/PNA或适体。寡核苷酸可为天然存在的核酸或其类似物。因此，配体可为天然存在的氨基酸或合成的氨基酸组成的多肽。配体可为核酸、氨基酸、糖或任何其它化学物质的组合物，只要其能与分枝/线性聚合物的线性部分结合。特别是，配体也可为化学物质，如基于三嗪骨架的化学物质，其可作为组合化学库的一种成分，特别是三嗪标记的库。
基质基质可为任何固体表面，分枝/线性聚合物可通过共价键或离子键与之结合。基质可被功能化以与分枝/线性聚合物的分枝末端之间可发生结合。基质表面可为本领域技术人员需要的各种表面。若需要微阵列或生物芯片格式，则氧化的硅片、熔融石英或玻璃通常可为基质。优选地，基质可为玻片。其它基质可包括膜滤器，例如但不局限于硝基纤维素或尼龙。基质可为亲水的或极性的，且可在涂层之前或之后具有负电荷或正电荷。
微阵列为了改善DNA微阵列的性能，应考虑以下问题如探针设计、点样过程中的反应条件、杂交及洗涤条件、非特异性结合的抑制、生物分子与表面的距离，以及固定的生物分子之间的间隔。由于这些因素中的大多数与微阵列表面的性质有关，表面优化已成为微阵列研究中的主要目标之一。Whitesell和Chang表明，在间隔受控的金表面上固定寡肽倾向形成的α-螺旋构象(Whitesell等，Science 261，73-76(1993))。现在我们报道以锥形的锥形分子修饰的表面能使DNA微阵列提供的单核苷酸多态性(或SNP)分辨效率接近溶液值(1∶0.01)，同时减少DNA非特异性结合。
图2为锥形分子合成的方案。各种起始材料、中间化合物及锥形分子化合物，其中“X”可为任何保护基团，包括蒽甲基(A)、Boc、Fmoc、Ns等。图3显示以锥形分子修饰玻璃表面(图3b)以及以匹配的寡核苷酸探针与荧光物质标记的靶标寡核苷酸选择性杂交，同时可有效分辨出在锥形分子修饰的表面上错配的单碱基对。
可使用在分枝末端具有表面反应活性官能团的第二代分枝锥形分子，其可自组装并在末端间提供合适的间隔。先前的研究显示，玻璃基质上阳离子与锥形分子末端的阴离子羧酸盐之间的多种离子作用成功地产生了行为良好的单层，且保证了配体之间的间隔超过24_(Hong等，Langmuir 19，2357-2365(2003))。为了促进脱保护且增加脱保护的顶部胺的反应活性，我们按照图3b修饰了该结构。我们还观察到锥形分子的羧酸基团与表面羟基基团之间的共价键形成与离子引力一样有效，同时还提供了增强的热稳定性。此外，寡醚夹层可有效抑制非特异性寡核苷酸结合。
羟基化的基质以先前报道的方法制备(Maskis等，Nucleic Acids Res.20，1679-1684(1992))。包括氧化的硅片、熔融石英及玻片的基质以(3-缩水甘油醚基丙基)甲基二乙氧基硅烷(GPDES)和乙二醇(EG)修饰。在4-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，使用1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)，通过锥形分子的羧酸基团与基质的羟基基团之间的偶联反应将锥形分子引入上述基质(Boden等，J.Org.Chem.50，2394-2395(1985)；Dhaon等，J.Org.Chem.47，1962-1965(1982))。引入锥形分子后厚度增加11±2_，这与先前从离子键上观察到的值相当(Hong等，Langmuir 19，2357-2365(2003))。固定后，在257nm处观察到锥形分子的蒽部分产生的吸收峰。分子层足够稳定，在二甲基甲酰胺中搅拌1天，厚度和吸收特征均无变化(图4)。从敲击模式原子力显微镜(AFM)获得的拓扑学图像还显示了产生的层非常光滑和均匀，无任何聚集或孔(图5)。
为DNA微阵列作准备，通过脱保护过程将固定的锥形分子活化以产生伯胺基团。在1.0M三氟乙酸(TFA)中脱保护后(Kornblum等，J.Org.Chem.42，399-400(1977)，257nm处的吸收峰消失，未产生任何其它有损表面特性的变化(图4a)。此观测数据证明，保护基团被成功脱去而对层无化学损坏，而由于保护基团的移去，厚度轻微减小。
根据先前建立的方法(Beier等，Nucleic Acids Res.27，1970-1977(1999))以二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯(DSC)修饰后，在10,000级洁净度的环境中，使用Microsys 5100 Microarrayer(Cartesian Technologies，Inc.)，点样合适的胺基标记的寡核苷酸(20μM)的50mM碳酸氢钠缓冲液(10％二甲基亚砜(DMSO)，pH 8.5)，将探针寡核苷酸固定在活化的玻片表面。通常，对于具有活性的胺表面基团的基质，使用硫醇标记的寡核苷酸和具有异型双功能团的连接分子如琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺基丁酸酯(SMB)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SSMCC)(Oh等，Langmuir18，1764-1769(2002)；Frutos等，Langmuir 16，2192-2197(2000))。与此对应的是，由于锥形分子修饰的表面保证胺官能团间的一定距离，使用同型双功能团的连接分子如DSC不会遇到问题。因此，带胺的寡核苷酸可用来点样。除了节省费用外，能避免使用容易氧化的硫醇标记的寡核苷酸，虽然这些硫醇束缚的寡核苷酸可能在某些条件下有益。
制备DNA微阵列以评价互补对(A∶T)与三种内部碱基错配对(T∶T，G∶T，C∶T)之间的分辨效率。在4×4格式中并排点样探针寡核苷酸后，将微阵列在湿盒中(80％湿度)孵育12小时给予胺基束缚的DNA足够的反应时间。然后将玻片在37℃缓液(含有7.0mM十二烷基硫酸钠的2x SSPE缓冲液(pH 7.4))中搅拌3小时，再在沸水中搅拌5分钟以除去非特异性结合的寡核苷酸。最后，将DNA官能化的微阵列在氮气气氛下干燥用于下一步。为了直接比较，将不同种类的探针点样于同一块板中。
为了杂交，使用15个碱基的寡核苷酸(靶标1)或45个碱基的寡核苷酸(靶标2)(图3c)。在1小时内使用GeneTACTMHybStation(Genomic Solution，Inc.)于50℃上述涤缓冲液中完成杂交，该缓冲液中含有以Cy3荧光染料标记的靶标寡核苷酸(1.0nM)。在1分钟内将微阵列用37℃的缓冲冲洗4次以除去过量的靶标核苷酸，再以氮气干燥。各点上的荧光信号以ScanArray Lite(GSI Lumonics)测定，再以Imagene 4.0(Biodiscovery)分析。
在15个碱基的靶标寡核苷酸的情况下，图像显示匹配的与内在错配对之间的强度具有显著差异(图6a)。标准化的荧光信号比(或单碱基内在错配对与完全匹配对之间的强度比，即MM/PM)为0.005、0.008及0.006(T∶T、G∶T及C∶T内在错配对)(图6a及表2)。观察到的选择性比传统方法有明显改善，且与普通表面上的DNA微阵列相比选择性大大提高(20～82倍)(表2)。先前，我们还观察到，制备在包括混合的自组装单层(即混合的SAM)的各种胺表面上的微阵列的选择因子为1∶0.19-0.57(Oh等，Langmuir 18，1764-1769(2002))。此外，其他研究者通过修饰其表面及发明更好的检测方法改善了DNA微阵列的性能，但就采用荧光检测方法而言，无人达到这一明显改善的比率(Zhao等，J.Am.Chem.Soc.125，12531-12540(2003)；Chakrabarti等，J.Am.Chem.Soc.125，12531-12540(2003)；Benters等，Nucleic Acids Res.30，e10(2002)；Guschin等，AnalyticalBiochemistry 250，203-211(1997)；Taton等，Science 289，1757-1760(2000)；Wang等，Nucleic Acids Res.30，e61(2002))。例如，报道了三种成分杂交/检测体系(俘获物/靶标/探针)的成功分辨率为1∶0.07(Zhao等，J.Am.Chem.Soc.125，12531-12540(2003))。即使使用能提高选择性的肽核酸(PNAs)，其在金薄膜和金纳米颗粒上的选择性也分别仅为1∶0.14和1∶0.07(Chakrabarti等，J.Am.Chem.Soc.125，12531-12540(2003))。
表2
为了模拟一个更真实的体系，使用45个碱基的靶标寡核苷酸。T∶T、G∶T及C∶T内在错配对的MM/PM比为0.006、0.009及0.009(图6b和表2)。此结果显示，更长的靶标寡核苷酸获得显著的选择性。我们相信，该DNA微阵列的效力应归功于以锥形分子修饰的表面的特性及固定的DNA链之间的间距。
为了作比较，将DNA微阵列制备在以(3-氨基丙基)二乙氧基甲基硅烷(APDES)修饰的基质上(Oh等，Langmuir 18，1764-1769(2002))，该基质为用于DNA或蛋白质微阵列的代表性基质。除了使用1，4-苯二异硫氰酸酯(PDITC)连接分子以外，以锥形分子修饰DNA微阵列相同的方法和寡核苷酸测试其选择性。如Guo(Guo等，Nucleic Acids Res.22，2121-2125(1994))所述，使用胺基标记的寡核苷酸。观察到的T∶T、G∶T及C∶T碱基的MM/PM比为0.41、0.38及0.26(图6c和表2)。在以APDES修饰的基质上使用DSC连接分子产生了高变异系数(CV)值(＞20％)，该系数表示点与点之间的变异程度以及各点内不均匀的荧光强度。另一方面，PDITC连接分子保证了更好的变异系数(CV)值(＜15％)以及单点内均匀的荧光强度，与具有DSC连接分子的以锥形分子修饰的基质类似(图7)。
为进一步比较，将在寡聚物5′端具有额外(T)30的间隔分子的探针2寡核苷酸用于SNP分辨测试。在此过程中，将具有额外间隔分子的探针固定于以APDES修饰的表面。观察到的T∶T、G∶T及C∶T碱基的MM/PM比为0.17、0.18及0.12(图6d和表2)。与具有C6间隔分子的修饰的探针DNA相比，选择性明显增强，但仍远远比不上以锥形分子修饰的DNA微阵列。
在表面上进行杂交非常复杂，使精确控制和预测微阵列的筛选性能受到严重的挑战。除二链体的熔解温度(Tm)和二链体形成的吉布斯自由能以外，还应考虑非特异性结合、位阻效应和静电效应以及洗涤过程中的环境变化。在50℃时溶液中内在错配对(15个碱基的T∶T、G∶T及C∶T内在错配对)与完全匹配对的吉布斯自由能之差为2.67、1.75及3.05kcal/mol。吉布斯自由能以HYTHERTMSoftware(http//ozone2.chem.wayne.edu)计算。因此，理论的荧光比(MM/PM)分别为0.016、0.065及0.009。对用分子信标的液相研究也显示了SNP分辨比低至1∶0.01(Taton等，Science 289，1757-760(2000))。这些数据强有力地证明我们的以锥形分子修饰的DNA微阵列代表一种达到或甚至超过了热力学限制的理想情况。特别是，在G∶T的情况下，微阵列格式中的分辨效率优于液相的计算值。导致选择性提高的主要原因的因素仍在研究，但严格洗涤可能发挥了作用。
p53SNP检测在生物体系中，p53肿瘤抑制基因在细胞调节、基因转录、基因组稳定性、DNA修复及细胞凋亡中起关键作用(参见Velculescu等，1996，Clin.Chem.，42858-868，Harris等，1996，881442-1455，Sidransky等，Annu，Rev.Med.，1996，47285-301)。据报道，p53的野生型功能损失可引起癌症，且p53突变是人类癌症如结肠癌和肺癌的最常见遗传改变(Greenblatt，1994，544855-4878)。
将[9]-酸锥形分子修饰的基质上的DNA微阵列用于癌细胞系中p53肿瘤抑制基因的单点突变检测。包含175密码子的靶标DNA样品(～200-400个碱基)通过随机引物扩增基因组DNA模板制备，并使其与以锥形分子修饰的基质杂交，该基质上以10×1格式固定有18个碱基的探针寡核苷酸。A∶C、T∶C及C∶C内在错配对的MM/PM比为0.028、0.031及0.007(图8a)。此结果显示了其对实际的靶标DNA具有显著的选择性。
使用与上述检测p53肿瘤抑制基因的175位密码子单点突变的[9]-酸锥形分子相同方法制备以[27]-酸锥形分子修饰的基质上的DNA微阵列。A∶C、T∶C及C∶C内在错配对的MM/PM比为0.066、0.01及0.005(图8b)。此结果显示，以[27]-酸锥形分子修饰的基质上的DNA微阵列也显示出对实际靶标DNA的单点突变检测的显著选择性。
使用以单一锥形分子修饰的表面检测p53基因的7个热点突变。
将锥形分子修饰的基质应用于癌细胞系中p53肿瘤抑制基因的单点突变检测。将跨越7个热点密码子(175、215、216、239、248、273及282)的靶标DNA样品(200-400个碱基)以随机引物扩增从细胞系中提取的DNA，并使其与根据已固定的7个热点密码子设计的俘获探针(15～25个碱基的寡核苷酸)杂交(图9a和9b)。获得了优秀的SNP分辨效率。
通过提供探针DNA间距，我们成功地制备了可靠性最高的DNA微阵列，并且发现SNP分辨效率能被增强至达到或甚至超过溶液值。观察到的分辨效率将使该方法学广泛适用于非常可靠的高通量基因诊断。我们期望该策略可应用于使用固定生物分子的各种生物分析。
控孔玻璃珠天然的聚合物如葡聚糖和琼脂糖为最常用于亲和层析的层析载体。琼脂糖凝胶6B、4B及2B为由交联的琼脂糖组成的层析材料，其表现出极低的非特异性吸收。
尽管被广泛使用，琼脂糖凝胶，特别是珠状的琼脂糖凝胶具有一些缺点。例如，由于其柔软特性，其流动(或洗脱)速度中等，因为严重且基本不可逆转的收缩使其不能被干燥或冷冻，并且它们不能耐受一些有机溶剂(Cuatrecasas，P.J.Biol.Chem.1970，245，3059-3065；Kim等，Biochemistry2002，41，3414-3421)。相比之下，控孔玻璃(CPG)表现出适于作为载体的许多特殊的性质1)机械稳定性，2)具有固定的三维结构；环境改变时不会膨胀或收缩，3)在pH 1至pH 14之间的化学稳定性，4)对大范围的亲核和亲电子试剂表现出惰性，4)对热稳定，5)表现出优异的流动(或洗脱)特性，6)不易于吸附到容器表面。此外，修饰后，通过洗涤可迅速有效地除去反应物及副产物。所有这些特性使其可用于许多领域，如渗透层析、固相合成、亲和纯化等。
孔的大小CPG对被吸收分子的有效孔隙度取决于客体对主体表面的趋近性。最可能的是，CPG对客体的趋近性依赖于几何因素，这些因素与主体的孔与客体的相对大小有关。若客体的分子大小大于进入内表面的孔隙，吸收和相互作用仅发生在比研究的多孔材料内表面面积小得多的外表面(Poschalko等，J.Am.Chem.Soc.2003，125，13415-13426；Ottaviani等，J.Phys Chem.B.2003，107，2046-2053)。基于这些考虑，期望客体吸收在CPG上的程度和强度依赖于下述参数CPG的孔大小、主体的总表面积及其可趋近表面的化学组成。在我们的研究中，使用了三种GST融合蛋白(GST(28kDa)、GST-PXP47(41kDa)及GST-Munc18片段(98kDa))。GST-Munc18的分子大小应类似于100kDa的融合GST，即GST-DREF的大小(140×140×93_3)(Hirose等，J.Biol.Chem.1996，271，3930-3937；Zhan等，Gene 2001，218，1-9)。为达到孔大小与表面积之间的平衡，必须将载体的孔隙度针对各具体蛋白质优化。因为已知具有约50nm孔大小的CPG允许常在蛋白质中常见的全部分子亚单位的复合体进入，我们的研究使用50nm CPG进行。同时，对上述蛋白质而言，使用具有较大孔(300nm)的CPG进一步证明了以前的CPG的效力(Collins等，Anal.Biochem.1973，54，47-53；Haller，W.J.Chromatogr.1973，85，129-131)。
谷胱甘肽CPG的修饰(样品E1、E3、A、CS及CL)对亲和基质的最重要的考虑为非特异性结合(或NSB)的程度。这是在亲和纯化和固相合成中普遍存在的问题。通常，抑制非特异性结合的关键因素为避免氢键供体基团以及增加基质的亲水性(Sigal等，J.Am.Chem.Soc.1998，120，3464-3473；Chapman等，Langmuir 2000，16，6927-6936；Chapman等，J.Am.Chem.Soc.2000，122，8303-8304；Holmlin等，Langmuir 2001，17，2841-2850；Ostuni等，Langmuir 2001，17，6336-6343；Chapman等，Langmuir 2001，17，1225-1233；Ostuni等，Langmuir 2001，17，5605-5620)。CPG表面，甚至当以氨基烷基基团修饰时，是极性的，且保留了部分负电荷(Hudson，D.J.Comb.Chem.1999，1，403-457)。已报道用二环氧化物作间隔分子可使基质具有亲水特性，最小化非特异性结合(Suen等，Ind.Eng.Chem.Res.2000，39，478-487；Sundberg等，J.Chromatogr.B.1974，90，87-98；Shimizu等，Nature Biotechnology 2000，18，877-881)。因此，用1，4-丁二醇二缩水甘油醚(或BUDGE)修饰以得到样品E1和E3。BUDGE结合的重要特征包括产生防止水解的非常稳定的醚键，通过长的间隔基臂增强柔性及与表面间的全距离，以及一定程度上抑制非特异性结合。再一个优点是可以与聚乙二醇类似的结构基序解释。二环氧化物可用来连接具有亲核试剂如胺和硫醇的分子及表面。在开环过程中，产生稳定的碳-杂原子键和β-羟基基团。锥形分子修饰前后使用连接分子保证连接的GSH的自由性。修饰步骤概要描述于图10中。为了将锥形分子结合在基质上，使用了称为EDC和NHS的一般试剂。以锥形分子修饰后，将乙酸酐引入体系以阻断胺残基的功能性。最后，以20％哌啶处理基质30分钟以脱去锥形分子的Fmoc基团以进行进一步修饰，。再以BUDGE处理多于一次后，GSH通过硫醇与环氧化物反应被固定。
作为对照，制备样品A。依次以BUDGE、1，3-二氨基丙烷及BUDGE修饰，得到与E1和E3类似的表面材料，只是不具有锥形分子。如前，GSH通过环氧化物与硫醇之间的开环反应被固定。通过使用称为GMBS的具有异型双功能团的连接分子将GSH与AMCPG或LCAA-CPG连接制备其它对照珠状物(样品CL和CS)。然而，AMPCPG在表面具有由C3烃组成的短臂，LCAA-CPG具有C15脂肪链长臂。在允许形成具有GMBS的酰胺结构后，将珠状物以GSH处理。将硫醇基团加入马来酰亚胺基基团在碳原子与硫原子之间产生共价键。这两步处理产生以共价键固定的对照有孔玻璃珠GSH，即CS和CL。
配体密度测定由于难于直接测定固定的谷胱甘肽数量，因此使用间接方法，即通过测定脱保护步骤中释放的二苯并富烯的量决定配体的密度。锥形分子顶部的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团对酸稳定但易被多种碱裂解。在此研究中，使用含20％哌啶的DMF对Fmoc官能团脱保护。哌啶与二苯并富烯形成一种络合物，且该络合物在301nm处吸收(_ye等，J.Phys.Chem.B.2003，107，3496-3499)。另一方面，当以20％哌啶脱保护过程中收集的溶液吸收出现在301nm处时，表明脱保护如期进行。
以此方法获得的配体密度是E1为8.3μmol/g，E3为5.6μmol/g。当以F-moc(3)酸修饰时，密度减小11.1个因子，以及当使用较大的锥形分子时，该值进一步减小1.5个因子。因此，在本发明的具体实施方案中，在获得较高密度方面，较小的锥形分子比使用的较大锥形分子更有效。
GST结合分析样品A、E1及E3的结合特征使用纯化的GST和细胞裂解物检测(图11中的泳道2、3及4)。泳道1显示裂解物的成功制备。显然，三种基质有效地结合纯化的GST。当将细胞裂解物引入珠状物时(泳道5、6及7)，观察到A与E1或E3之间的明显差异。对于样品A，尽管结合了BUDGE连接分子，也观察到严重的非特异性结合。有趣的是，当将锥形分子引入到基质上时，非特异性蛋白质结合被有效抑制。值得注意的是，第一代锥形分子或第二代锥形分子的自组装有效抑制固体载体的非特异性结合，而锥形分子与GSH之间的间隔分子保留了束缚三肽的活性。
图12中，在本发明的一方面，醚及酰胺基团组成该结构的主要骨架，并且锥形分子的固定再次产生酰胺键。此外，锥形分子的高度覆盖也是成功的重要因素。
E1的配体密度是E3的配体密度的1.48倍。换言之，为E1记录了148％的配体浓度(表3)。为检测两种珠状物的结合效率，将样品的重量调节至在各种样品中具有相同量的GSH。显像密度计显示两种情况下配体的利用十分接近(29％、31％)。E3的较大间隔未增强GST的结合效率，可能因为检测的蛋白质总是大于E1和E3的间隔。
表3配体浓度及样品E1和E3的配体利用
对照试验我们发现，在CS时，GSH密度是为14.5μmol/g，在CL时为11.9μmol/g。为比较珠状物特异性结合GST的效力，分析了CS(5.7mg)和CL(7.0mg)珠状物俘获的蛋白质以及来自E1(10.0mg)和E3(14.8mg)珠状物的样品。将用量调节至具有大致相同量的GSH。显然，在层析中(图13)，CS和CL珠状物表现出低选择性和低结合能力。该结果再次证明锥形分子的重要性，不仅保证改善GST对固定GSH的趋近性，还保证有效抑制非特异性结合。
分子量依赖性。由于锥形分子修饰在固定配体之间产生间隔受控的表面，与各种分子量的蛋白质的结合能力是饶有兴趣的。特别是，已知第二代锥形分子的使用保证超过24埃的间隔(Cardona等，J.Am.Chem.Soc.1998，120，4023-4024)。为了进行具体的测试，制备了来自野生型裂解物的GST蛋白质(28kDa)、GST-PXp47(41kDa)及GST-munc-18片段(98kDa)。如图14所示，珠状物(E1、E3及琼脂糖凝胶4B)的结合能力随着蛋白质分子量的增加急剧降低。有意思的是，在三种不同情况下降低的程度保持相同。当将E1对GST的结合能力设为100％时，对GST-PXp47具有92％的相对结合能力以及对GST-munc18具有22％的相对结合能力。对于E3珠状物，前种蛋白质为85％且后种蛋白质为23％。蛋白质分子量上的这一强依赖性也在谷胱甘肽琼脂糖凝胶-4B上观察到。对于谷胱甘肽琼脂糖凝胶-4B，对GST-PXp47和GST-munc18的结合效力分别为104％和17％。该显著差异极大反映了此可商品化基质对GST和GST-PXp47的结合能力相当一致。该差异可反映出琼脂糖凝胶4B中不同种类的间隔。在此材料中，GSH间存在多种间隔以致基质结合融合的GST与结合原始的GST一样有效。对于大得多的蛋白质GST-munc18，间隔可能太小。在这点上，以锥形分子处理的珠状物结合能力的持续降低再次证实了GSH在表面上规则间隔。
简言之，以锥形分子修饰的基质证明选择性与商品化的基质(例如，琼脂糖凝胶4B)一样高，且分子量依赖性几乎与商品化产品的相同。锥形分子在AMPCPG基质上的结合不仅有效降低非特异性结合，还保留GSH的结合活性。观察到结合能力随着蛋白质分子量增加而持续降低，且此现象似乎与固定的GSH之间的规则间隔一致。除控制得很好的间隔以外，有利方面如机械稳定性、适应各种化学环境以及易于操作预示了应用潜力。
本发明不局限于此处描述的具体实施方案的范围。当然，本领域技术人员显然将可根据前述及图对本发明作除此处所述以外的各种修改。这些修改包括在后面的权利要求范围内。下述实施例例证性地说明本发明，并不是对本发明的限制。
实施例将编号方案用于全部实施例如化合物1、化合物2、I、II、III、IV、V等。然而，应当了解，化合物编号方案与所述的具体实施例部分一致并受其限制。例如，实施例2中所述的化合物1不一定相同于实施例3中发现的化合物1。
实施例1使用大小受控的大分子制备微阵列的方法实施例1中，名称I、II、III、IV及V指图2中所示的各种化合物及中间化合物。
实施例1.1材料.硅烷结合试剂，(3-缩水甘油醚基丙基)甲基二乙氧基硅烷(GPDES)和(3-氨基丙基)二乙氧基甲基硅烷(APDES)购自Gelest，Inc.。所有其它化学物质都是购自Sigma-Aldrich的试剂级产品。用于硅烷化作用的反应溶剂均为购自Aldrich的包装于Sure/Seal瓶中的无水溶剂。用于基质的所有洗涤溶剂均为购自Mallinckrodt Laboratory Chemical的HPLC级溶剂。UV级熔融石英板(30mm×10mm×1.5mm)购自CVI Laser Corporation。光滑的顶级Si(100)晶片(搀杂剂、磷；电阻率，1.5-2.1Ω·cm)购自MEMCElectronic Materials，Inc。玻片(2.5×7.5cm)购自Corning Co。所有寡核苷酸购自Metabion。超纯水(18MΩ/cm)从Milli-Q纯化系统(Millipore)获得。
实施例1.2设备。
膜厚度以椭偏仪(spectroscopic ellipsometer)测定(J.A.Woollam Co.Model M-44)。将紫外可见光谱在Hewlett-Packard二极管阵列8453分光光度计上记录。将敲击式AFM试验以配备有“E”型扫描仪的Nanoscope IIIaAFM(Digital Instruments)完成。
实施例1.3基质清洁。将基质如氧化的硅晶片、熔融石英板及玻片浸入Piranha溶液(浓度H2SO4∶30％H202＝7∶3(v/v))中，将含有该溶液及基质的反应瓶超声处理1小时。(注意Piranha溶液能氧化有机材料引起爆炸。避免与可氧化的材料接触)。超声处理后将熔融石英板以充裕的去离子水洗涤和彻底冲洗。干净的基质在真空室中干燥(30-40mTorr)用于后续步骤。
实施例1.4制备羟基化的基质。将上述干净的基质浸入含有1.0ml(3-缩水甘油醚基丙基)甲基二乙氧基硅烷(GPDES)的160ml甲苯溶液中10小时。自组装后，将基质以甲苯简单地洗涤，置于烤箱内，然后在110℃加热30分钟。将板依次于甲苯、甲苯-甲醇(1∶1(v/v))及甲醇中超声处理，每步洗涤3分钟。将洗净的板在真空室(30-40mTorr)中干燥。在80-100℃，将以GPDES修饰的基质浸入具有两或三滴95％硫酸的纯乙二醇(EG)溶液中8小时。冷却后，将基质依次于乙醇和甲醇中超声处理，每步3分钟。将洗净的板在真空室(30-40mTorr)中干燥。
实施例1.5制备以锥形分子修饰的基质。在存在4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.82mM)的情况下，将上述羟基化的基质浸入溶有锥形分子(1.2mM)和偶合剂1-[-3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)(11mM)的二氯甲烷溶液中。常温下3天后，将板依次于甲醇、水及甲醇中超声处理，每步3分钟。将洗净的板在真空室(30-40mTorr)中干燥以用于下一步。
实施例1.6制备以NHS修饰的基质。将以锥形分子修饰的基质浸入具有1.0M三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷溶液中。3小时后，将其再次浸入具有20％(v/v)二异丙基乙基胺(DIPEA)的二氯甲烷中10分钟。将板于二氯甲烷和甲醇中超声处理各3分钟。在真空室中干燥后，将脱保护基质于具有二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯(DSC)(25mM)和DIPEA(1.0mM)的乙腈溶液中孵育。在氮气气氛下反应4小时后，将板置于搅拌的二甲基甲酰胺溶液中30分钟，然后以甲醇简单地洗涤。将洗净的板在真空室(30-40mTorr)中干燥以用于下一步。
实施例1.7将寡核苷酸排列在以NHS修饰的基质上。将50mMNaHCO3缓冲液(pH 8.5)中的探针寡核苷酸以4×4格式一排排点样于NHS修饰的基质上。将微阵列于湿盒(80％湿度)中孵育12小时以给予胺标记的DNA足够的反应时间。然后将玻片于37℃杂交缓冲液(含有7.0mM十二烷基硫酸钠的2xSSPE缓冲液(pH 7.4))中搅拌1小时，再于沸水中搅拌5分钟以去除非特异性结合的寡核苷酸。最后，将DNA官能化的微阵列在氮气气氛下干燥以用于下一步。为了直接比较，将不同种类的探针点样于同一块板中。
实施例1.8杂交。于50℃下，使用GeneTACTM HybStation(GenomicSolutions，Inc.)在包含Cy3荧光染料标记的靶标寡核苷酸(1.0nM)的杂交缓冲液中杂交1小时。将微阵列以杂交缓冲液冲洗以去除过量的靶标寡核苷酸，然后以氮气干燥。各点上的荧光信号以ScanArray Lite(GSI Lumonics)测定，再以Imagene 4.0(Biodiscovery)分析。
实施例1.9锥形分子的合成实施例1.9.19-蒽基甲基N-(3-羧基丙基)氨基甲酸酯(I)-化合物I的制备。
将4-氨基丁酸(0.50g，4.8mmol，1.0当量)和三乙基胺(TEA)(1.0ml，7.3mmol，1.5当量)溶于N，N-二-甲基甲酰胺(DMF)中并在50℃下搅拌。在搅拌的同时将9-蒽基甲基对硝基苯基碳酸酯(1.81g，4.8mmol，1.0当量)缓慢加入。在50℃搅拌2小时后，将溶液蒸发至干，再将溶液以0.50N氢氧化钠(NaOH)溶液碱化。将该水溶液以乙酸乙酯(EA)洗涤，在冰浴中搅拌，再以稀盐酸(HCl)酸化。将产物以EA萃取后，将有机溶剂以无水MgSO4干燥，过滤、浓缩。得黄色粉末总重量为1.06g，产率为65％。
1H NMR(CDCl3)δ11.00-9.00(br，CH2COOH，1H)，8.41(s，C14H9CH2，1H)，8.31(d，C14H9CH2，2H)，7.97(d，C14H9CH2，2H)，7.51(t，C14H9CH2，2H)，7.46(t，C14H9CH2，2H)，6.08(s，C14H9CH2O，2H)，5.01(t，OCONH-CH2，1H)，3.23(q，NHCH2CH2，2H)，2.34(t，CH2CH2COOH，2H)，1.77(m，CH2CH2CH2，2H)。
13C NMR(CDCl3)δ178.5(CH2COOH)，157.9(OCONH)，132.1(C14H9CH2)，131.7(C14H9CH2)，129.7(C14H9CH2)，129.7(C14H9CH2)，127.3(C14H9CH2)，126.8(C14H9CH2)，125.8(C14H9CH2)，124.6(C14H9CH2)，60.2(C14H9CH2)，41.0(NHCH2CH2)，31.7(CH2CH2COOH)，25.6(CH2CH2CH2)。
实施例1.9.29-蒽基甲基N-{[(三{[2-(甲氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}丙基碳酸酯(II)-化合物II的制备。
将9-蒽基甲基N-(3-羧基丙基)氨基甲酸酯(0.65g，1.93mmol，1.5当量)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(0.37g，1.93mmol，1.5当量)以及1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)(0.261g，1.93mmol，1.5当量)溶于乙腈中并在室温下搅拌。在搅拌条件下将溶于乙腈的三{[(甲氧基羰基)乙氧基]甲基}氨基甲烷(0.49g，1.29mmol，1.0当量)加入。室温下搅拌12小时后，将乙腈蒸发。将粗产物溶于EA中，再以1.0N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。以无水MgSO4干燥后，过滤，然后浓缩，将粗产物负载到装入硅胶的柱子中。通过柱层析纯化(洗脱液∶乙酸乙酯∶己烷＝5∶1(v/v))产生粘性的黄色液体。该黄色液体的总重量为0.67g，以及产率为74％。
1H NMR(CDCl3)δ8.43(s，C14H9CH2，1H)，8.36(d，C14H9CH2，2H)，7.99(d，C14H9CH2，2H)，7.53(t，C14H9CH2，2H)，7.47(t，C14H9CH2，2H)，6.15(s，CONHC，1H)，6.08(s，C14H9CH2O，2H)，5.44(t，OCONHCH2，1H)，3.63-3.55(m，CH2OCH2CH2COOCH3，21H)，3.27(q，NHCH2CH2，2H)，2.46(t，CH2CH2COOCH3，6H)，2.46(t，CH2CH2CONH，2H)，1.81(m，CH2CH2CH2，2H)。
13C NMR(CDCl3)δ173.2(CH2CONH)，172.7(CH2COOCH3)，157.4(OCONH)，132.9(C14H9CH2)，131.5(C14H9CH2)，129.5(C14H9CH2)，129.4(C14H9CH2}，127.5(C14H9CH2)，127.0(C14H9CH2)，125.6(C14H9CH2)，124.7(C14H9CH2)，69.6(NHCCH2O)，67.2(C14H9CH2)，60.1(OCH2CH2)，59.4(NHCCH2)，52.1(OCH3)，40.8(NHCH2CH2)，35.1(OCH2CH2)，34.7(CH2CH2CONH)，26.3(CH2CH2CH2)。
计算值C36H46N2O12·0.5H2OC 61.18，H 6.65，N 4.03；实测值C61.09，H 6.69，N 3.96.
实施例1.9.39-蒽基甲基N-[({三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯(III)-化合物III的制备。
将9-蒽基甲基N-{[(三{[2-(甲氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}丙基-碳酸酯(0.67g，0.93mmol)溶于丙酮(30ml)和0.20N NaOH(30ml，6mmol)中。在室温下搅拌1天后，将丙酮蒸发。将水溶液以EA洗涤，在冰浴中搅拌，再以稀盐酸酸化。将产物以EA萃取后，将有机溶剂以无水MgSO4干燥，过滤，然后浓缩。在-20℃的丙酮和醚溶液中固化产生黄色粉末。最后的浅黄色粉末的总重量为0.54g，产率为88％。
1H NMR(CDCl3)δ11.00-9.00(br，CH2COOH，3H}，8.61(s，C14H9CH2，1H}，8.47(d，C14H9CH2，2H)，8.11(d，C14H9CH2，2H)，7.60(t，C14H9CH2，2H}，7.52(t，C14H9CH2，2H)，6.63(s，CONHC，1H)，6.36(t，OCONHCH2，1H)，6.12(s，C14H9CH2O，2H)。3.40-363(m，CH2OCH2CH2COOH，12H)，3.20(q，NHCH2CH2，2H)，2.52(t，CH2CH2COOH，6H)，2.17(t，CH2CH2CONH，2H)，1.75(m，CH2CH2CH2，2H)。
13C NMR(CDCl3)δ172.2(CH2COOH)，172.0(CH2CONH)，156.7(OCONH)，131.2(C14H9CH2)，130.7(C14H9CH2)，128.6(C14H9CH2)，128.4(C14H9CH2)，127.3(C14H9CH2)，126.2(C14H9CH2)，124.8(C14H9CH2)，124.0(C14H9CH2)，68.6(NHCCH2O)，66.5(C14H9CH2)，59.5(OCH2CH2)，58.0(NHCCH2)，40.0(NHCH2CH2)，34.0(OCH2CH2)，33.5(CH2CH2CONH)，25.8(CH2CH2CH2)。
计算值C33H40N2O12·1.5H2OC 57.97，H 6.34，N 4.10；实测值C 57.89，H 6.21，N 4.09.
实施例1.9.49-蒽基甲基N-[({三[(2-{[(三{[2-(甲氧基羰基)乙氧基]甲基}(甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯(IV)-化合物IV的制备。
将9-蒽基甲基N-[({三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯(0.54g，0.82mmol，1.0当量)、EDC(0.55g，2.87mmol，3.5当量)以及HOBT(0.39g，2.89mmol，3.5当量)溶于乙腈中并在室温下搅拌。在搅拌条件下将溶于乙腈的三{[(甲氧基羰基)乙氧基]甲基}氨基甲烷(0.96g，2.53mmol，3.1当量)加入。在室温下搅拌36小时后，将乙腈蒸发。将粗产物溶于EA中，并以1.0N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。以无水MgSO4干燥后，过滤，然后浓缩，将粗产物负载到装入硅胶的柱子中。柱层析纯化(洗脱液∶乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1(v/v))得到粘性的黄色液体。该黄色液体的总重量为1.26g，产率为88％。
1H NMR(CDCl3)δ8.47(s，C14H9CH2，1H)，8.39(d，C14H9CH2，2H)，8.02(d，C14H9CH2，2H)，7.53(t，C14H9CH2，2H)，7.47(t，C14H9CH2，2H)，6.60(s，CH2CH2CH2CONHC，1H)，6.13(s，OCH2CH2CONHC，3H)，6.11(s，C14H9CH2O，2H)，5.79(t，OCONHCH2，1H)，3.65-3.60(m，CH2OCH2CH2CONH，CH2OCH2CH2COOCH3，75H)，3.29(q，NHCH2CH2，2H)，2.50(t，CH2CH2COOCH3，18H)，2.36(t，OCH2CH2CONH，6H)，2.27(t，CH2CH2CH2CONH，2H)，1.85(m，CH2CH2CH2，2H)。
13C NMR(CDCl3)δ173.3(OCH2CH2CONH)，172.5(CH2CH2CH2CONH)，171.6(CH2COOCH3)，157.2(OCONH)，131.8(C14H9CH2)，131.5(C14H9CH2)，129.4(C14H9CH2)，129.3(C14H9CH2)，127.6(C14H9CH2)，127.0(C14H9CH2)，125.6(C14H9CH2)，124.7(C14H9CH2)，69.5(NHCCH2OCH2CH2COOCH3)，67.9(NHCCH2OCH2CH2CONH)，67.2(C14H9CH2)，60.3(OCH2CH2CONH)，60.2(OCH2CH2COOCH3)，59.2(NHCCH2OCH2CH2COOCH3，NHCCH2OCH2CH2CONH)，52.1(OCH3)，41.0(NHCH2CH2)，37.6(OCH2CH2CONH)，35.1(OCH2CH2COOCH3)，34.7(CH2CH2CH2CONH)，26.3(CH2CH2CH2)。
计算值C81H121N5O36·H2OC 55.31，H 7.05，N 3.98；实测值C55.05，H 7.08，N 4.04.
MALDI-TOF-MS1763.2(MNa+)，1779.2(MK+)。
实施例1.9.59-蒽基甲基N-({[三({2-[({三[(2-羧基乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]乙氧基}甲基)甲基]氨基}羰基)丙基氨基甲酸酯(V)-化合物V的制备。
将9-蒽基甲基N-[({三[(2-{[(三{[2-(甲氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基}氨基)羰基]丙基氨基甲酸酯(0.60g，0.34mmol)溶于丙酮(30ml)和0.20N NaOH(30ml)中。在室温下搅拌1天后，将丙酮蒸发。将水溶液以EA洗涤，在冰浴中搅拌，再以稀盐酸酸化。将产物以EA萃取后，将有机溶剂以无水MgSO4干燥，过滤，然后浓缩。最后的黄色粉末的总重量为0.37g，产率为68％。
1H NMR(DMSO)δ13.00-11.00(br，CH2COOH，9H)，8.66(s，C14H9CH2，1H)，8.42(d，C14H9CH2，2H)，8.13(d，C14H9CH2，2H)，7.62(t，C14H9CH2，2H)，7.54(t，C14H9CH2，2H)，7.12(t，OCONHCH2，1H)，7.10(s，OCH2CH2CONHC，3H)，7.06(s，CH2CH2CH2CONHC，1H)，6.06(s，C14H9CH2O，2H)，3.57-3.55(m，CH2OCH2CH2CONH，CH2OCH2CH2COOH，48H)，3.02(q，NHCH2CH2，2H)，2.42(t，CH2CH2COOH，18H)，2.32(t，OCH2CH2CONH，6H)，2.11(t，CH2CH2CH2CONH，2H)，1.60(m，CH2CH2CH2，2H)。
13C NMR(DMSO)δ172.8(CH2COOH)，172.2(CH2CH2CH2CONH)，170.5(OCH2CH2CO-NH)，156.5(OCONH)，131.0(C14H9CH2)，130.6(C14H9CH2)，129.0(C14H9CH2)，128.7(C14H9CH2)，127.6(C14H9CH2)，126.7(C14H9CH2)，125.4(C14H9CH2)，124.3(C14H9CH2)，68.3(NHCCH2OCH2CH2COOH)，67.4(NHCCH2OCH2CH2CONH)，66.8(C14H9CH2)，59.8(OCH2CH2COOH)，59.6(OCH2CH2CONH)，57.9(NHCCH2OCH2CH2CONH)，55.9(NHCCH2OCH2CH2COOH)，36.4(NHCH2CH2)，34.6(OCH2CH2COOH)，30.8(OCH2CH2CONH)，29.7(CH2CH2CH2CONH)，25.9(CH2CH2CH2)。
实施例2供选择的起始材料锥形分子大分子-Fmoc-间隔基团-[9]-酸的制备方法在实施例2中，所示的各种化合物指化合物1，2等。
首先，我们根据Lee，J.W.；Jun，S.I.；Kim，K.Tetrahedron Lett.，2001，42，2709的方法从1，6-二溴己烷合成了间隔分子6-叠氮基己基胺(1)。
该间隔分子通过不对称的脲形成与重复单位(2)连接，形成N3-间隔基团-[3]酯(3)。该重复单位通过TRIS与叔丁基丙烯酸酯缩合合成，这已在Cardona，C.M.；Gawley，R.E.J.Org.Chem.2002，67，141中报道。
该三酯通过水解转化为N3-间隔基团-[3]酸(4)，并在肽偶联的条件下与三酯(2)偶联，产生N3-间隔基团-[9]酯。经叠氮化物至胺的还原以及胺通过Fmoc基团的保护后，水解九元酯产生Fmoc-间隔基团-[9]酸(5)。
N-(6-叠氮基己基)-N′-三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}-甲基脲(3)。
将三光气(1.3g，4.3mmol)溶于无水CH2Cl2(20mL)。用7小时使用注射泵将6-叠氮基己基胺(1)(1.6g，12mmol)与N，N-二异丙基乙基胺(DIEA，2.4mL，13.8mmol)的无水CH2Cl2(35mL)溶液逐滴加入搅拌的三光气溶液中。进一步搅拌2小时后，加入(2)(6.4g，13mmol)与DIEA(2.7mL，15.2mmol)的无水CH2Cl2溶液(20mL)。将反应混合物在室温氮气下搅拌4小时，再以0.5M HCl和盐水洗涤。然后将有机层以无水MgSO4干燥，再通过抽空去除溶剂。以柱层析(硅土，1∶1 EtOAc/己烷)纯化得无色油(3.0g，40％)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.45(s，(CH3)3C，27H)；1.36-1.58(m，CH2CH2CH2CH2，8H)；2.46(t，CH2CH2O，J＝6.4Hz，6H)，3.13(m，CONHCH2，2H)，3.26(t，N3CH2，J＝6.9Hz，2H)，3.64-3.76(m，CCH2O和CH2CH2O，12H)；5.00(t，CH2NHCO，J＝6.7Hz，1H)，5.29(s，CONHC，1H)。
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ26.52，26.54，28.81，30.26(CH2CH2CH2CH2)；28.14((CH3)3C)；36.20(CH2CH2O)；39.86(CONHCH2)；51.40(N3CH2)；58.81(CCH2O)；67.16(CH2CH2O)；69.23(CCH2O)；80.58((CH3)3C)；157.96(NHCONH)；171.26(COOt-Bu)。
FAB-MS674.26(M+)。
N-(6-叠氮基己基)-N′-三{[2-羧基乙氧基]甲基}甲基脲(4)。将N3-间隔基团-[3]酯(3)(0.36g，0.56mmol)在6.6mL的96％甲酸中搅拌24小时。然后将甲酸在50℃负压下去除，得定量的无色油。
1H NMR(CD3COCD3，300MHz)δ1.34-1.60(m，CH2CH2CH2CH2，8H)；2.53(t，CH2CH2O，J＝6.4Hz，6H)，3.07(t，CONHCH2，J＝6.9Hz，2H)，3.32(t，N3CH2，J＝6.9Hz，2H)，3.67-3.73(m，CCH2O and CH2CH2O，12H)。
13C NMR(CD3COCD3，75MHz)δ27.21，29.54，31.02(CH2CH2CH2CH2)；35.42(CH2CH2O)；40.27(CONHCH2)；52.00(N3CH2)；59.74(CCH2O)；67.85(CH2CH2O)；70.96(CCH2O)；158.96(NHCONH)；173.42(COOH)。
FAB-MS506.19(MH+)。
N-(6-叠氮基己基)-N′-三[(2-{[(三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]-甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基脲(4.1)。
将HOBt(0.20g，1.5mmol)、DIEA(0.30mL，1.8mmol)以及EDC(0.33g，1.8mmol)加入5.0mL的无水乙腈中的(4)(0.25g，0.50mmol)。然后，将溶于2.5mL无水乙腈的胺(2)(1.14g，2.3mmol)加入，再将反应混合物在N2下搅拌48小时。在负压下去除溶剂后，将残余物溶于MC，再以0.5M HCl和盐水洗涤。然后将有机层以无水MgSO4干燥，在真空中去除溶剂，然后柱层析(SiO2，2∶1 EtOAc/己烷)得无色油(0.67g，70％)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.45(s，(CH3)3C，81H)；1.36-1.58(m，CH2CH2CH2CH2，8H)；2.40-2.47(m，CH2CH20 gen.1 & 2，24H)，3.13(m，CONHCH2，2H)，3.26(t，N3CH2，6.9Hz，2H)，3.62-3.69(m，CCH2O gen.1 & 2，CH2CH2O gen.1 & 2，48H)；5.36(t，CH2NHCO，J＝6.7Hz，1H)，5.68(br，CONHC，1H)，6.28(br，酰胺NH，3H)。
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ26.59，26.69，28.91，30.54(CH2CH2CH2CH2)；28.22((CH3)3C)；36.20(CH2CH2O gen.2)；37.43(CH2CH2O gen.1)；39.81(CONHCH2)；51.47(N3CH2)；58.93(CCH2O gen.1)；59.89(CCH2O gen.2)；67.15(CH2CH2O gen.2)；67.68(CH2CH2O gen.1)；69.23(CCH2O gen.2)；70.12(CCH2O gen.1)；80.57((CH3)3C)；158.25(NHCONH)；171.01(COOt-Bu)171.41(CONH酰胺)。
MALDI-MS1989.8(MNa+)，2005.8(MK+)。
N-(6-氨基己基)-N′-三[(2-{[(三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]-甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基脲(4.2)。
将九元-叔丁基酯(4.1)(0.37g，0.20mmol)在室温在H2气氛下于10％Pd/C(37.0mg)的乙醇(20.0mL)中搅拌12小时。以TLC检查反应完全后，将混合物以0.2μm Millipore滤器过滤。将滤纸以CH2Cl2冲洗后，将合并的溶剂在真空中去除，重新获得无色油。
N-{6-(9-芴基甲氧基羰基)氨基己基}-N′-三[(2-{[(三{[2-(叔丁氧基羰基)乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]甲基脲(4.3)。
将胺(4.2)(0.33g，0.17mmol)及DIEA(33μL，0.19mmol)溶于5.0mLCH2Cl2中，再在氮气气氛下搅拌30分钟。将2.0mL的9-芴基甲基氯甲酸酯(48mg，0.19mmol)的CH2Cl2溶液加入，再将反应混合物在室温下搅拌3小时。将溶剂在负压下去除，再以0.5M HCl和盐水洗涤。将残余物以柱层析(硅胶，EtOAc)纯化，得无色油(0.18g，64％)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.45(s，(CH3)3C，81H)；1.23-1.58(m，CH2CH2CH2CH2，8H)；2.37-2.47(m，CH2CH2O gen.1 & 2，24H)；3.10-3.22(m，CONHCH2，4H)；3.62-3.70(m，CCH2O gen.1 & 2，CH2CH2O gen.1 &2，48H)；4.22(t，CH(芴基)-CH2，J＝7.1Hz，1H)；4.36(d，芴基-CH2，J＝7.1Hz，2H)；5.27-5.35(m，CH2NHCO，2H)；5.67(br，CONHC，1H)；6.25(br，酰胺，3H)；7.28-7.77(芴基，8H)。
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ26.85，27.02，30.27，30.88(CH2CH2CH2CH2)；28.49((CH3)3C)；36.48(CH2CH2O gen.2)；37.73(CH2CH2O gen.1)；40.03，41.34(CONHCH2)；47.68(CH(芴基)-CH2)；59.22(CCH2O gen.1)；60.16(CCH2O gen.2)；66.87(芴基-CH2)；67.43(CH2CH2O gen.2)；67.98(CH2CH2O gen.1)；69.52(CCH2O gen.2)；70.42(CCH2O gen.1)；80.84((CH3)3C)；120.28，125.52，127.38，127.98，141.65，144.48(芴基)；156.88(OCONH)；158.52(NHCONH)；171.27(COOt-Bu)171.65(酰胺CONH)。
MALDI-MS2186.8(MNa+)，2002.8(MK+)。
N-{6-(9-芴基甲氧基羰基)氨基己基}-N′-三[(2-{[(三{[2-羧基乙氧基]甲基}甲基)氨基]羰基}乙氧基)甲基]-甲基脲(5)。
将具有保护基团的九元-叔丁基酯(4.3)(0.12g，72mmol)于10mL 96％甲酸中搅拌18小时。然后将甲酸在50℃负压下去除，得定量的无色油。
1H NMR(CD3COCD3，300MHz)δ1.23-1.51(m，CH2CH2CH2CH2，8H)；2.44-2.58(m，CH2CH2Ogen.1&2，24H)；3.15-3.18(m，CONHCH2，4H)；3.61-3.75(m，CCH2O gen.1&2，CH2CH2O gen.1&2，48H)；4.23(t，CH(芴基)-CH2，J＝7.0Hz，1H)；4.35(d，芴基-CH2，J＝7.0Hz，2H)；5.85，6.09(br，CH2NHCO，2H)；6.57(br，CONHC，1H)；6.88(br，酰胺NH，3H)；7.31-7.88(芴基，8H)。
13CNMR(CD3COCD3，75MHz)δ27.21，27.33，30.69，30.98(CH2CH2CH2CH2)；35.31(CH2CH2O gen.2)；37.83(CH2CH2O gen.1)；40.56，41.54(CONHCH2)；48.10(CH(芴基)-CH2)；59.93(CCH2O gen.1)；61.10(CCH2O gen.2)；66.86(芴基-CH2)；67.81(CH2CH2O gen.2)；68.37(CH2CH2O gen.1)；69.80(CCH2O gen.2)；70.83(CCH2O gen.1)；120.84，126.13，127.98，128.56，142.10，145.16(芴基)；157.50(OCONH)；159.82(NHCONH)；173.20(酰胺CONH)；173.93(COOH)。
实施例3其它锥形分子化合物应该注意的是，当具体的保护基团同大分子一起显示时，这些化合物不局限于所示的具体保护基团。此外，当将各链及间隔基团绘图显示精确的分子结构时，也可根据可接受的化学修饰方法作些改动，以获得基质表面上的密度受控的阵列，优选低密度阵列的功能。在这些化合物的简略描述中，最左边的字母多多个字母表示保护基团；括号中的数字表示分枝末端的数目；最右边的化学实体表示分枝末端上的化学组成。例如，“A-[27]-酸”表示蒽基甲基保护基团；27个末端以及末端为酸基团。
A-[27]-酸
Boc-[1]-酸 Boc-[3]-酯 Boc-[3]-酸
Boc-[9]-酯 Boc-[9]-酸
Ns-[9]-酯 Ns-[9]-酸
Fmoc-[9]-酯(R＝叔丁基) Fmoc-[9]-酸 AE-[1]-酸
AE-[3]-酸 AE-[9]-酸
A-[6]-酸
A-[8]-酸 A-[12]-酸
A-[16]-酸
A-[18]-酸
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K.L.Wooley J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1 1991，1059
实施例3.1-制备方法1.A-[3]-OEt(3) 将化合物1与NaC(CO2Et)32的C6H6/DMF溶液在80℃下反应。
2.A-[3]-OMe(5) 将A-[3]-OEt 3以LiAlH4或LiBH4的醚溶液还原，在t-BuOK/t-BUOH存在下与氯乙酸反应，然后以MeOH酯化。
3.A-[3]-OTs(7) 将A-[3]-OMe 5以LiAlH4的醚溶液还原，得三元醇化合物6，将其甲苯磺酰化得到化合物7。
4.A-[9]-OEt(8)
将A-[3]-OTs 7以NaC(CO2Et)3的C6H6-DMF溶液处理，得所需的九元酯(化合物8)5.A-[27]-OH(9) 在70℃将A-[9]-OEt 8以三(羟基甲基)氨基甲烷及K2CO3的DMSO溶液处理。
实施例3.21.Boc-[2]-OMe(3)
将化合物1与丙烯酸甲基酯2的甲醇溶液于低于50℃的温度下反应。过量的反应物和溶剂在低于55℃温度的高度真空下去除。
2.Boc-[4]-NH2(5) 将Boc-[2]-OMe 3与大量过量的乙二胺(EDA)4的甲醇溶液于低于50℃的温度下反应。过量的反应物和溶剂在低于55℃温度的高度真空下去除。
3.Boc-[8]-OMe(6) 将Boc-[4]-NH25与丙烯酸甲基酯2的甲醇溶液于低在50℃的温度下反应。将过量的反应物和溶剂在低于55℃温度的高度真空下去除。
实施例3.31.Boc-[2]-OH(3)
将化合物1、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)溶于乙腈中并在室温下搅拌。在搅拌的条件下将溶于乙腈的L-谷氨酸-二乙基酯(H2NCH(CO2Et)CH2CH2CO2Et)加入。在室温下搅拌12小时后，将乙腈蒸发。将粗产物溶于EA中并以1.0N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。以无水MgSO4干燥后，过滤，然后浓缩，将粗产物负载到装入硅胶的柱子中。柱层析纯化(洗脱液乙酸乙酯∶己烷)产生粘性的黄色液体。
将化合物2以NaOH溶液水解。在室温下搅拌1天后，将有机液体蒸发。将水溶液以EA洗涤，在冰浴中搅拌，再以稀HCl酸化。将产物以EA萃取后，将有机溶剂以无水MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。
2.Boc-[4]-OH(3) 将化合物3、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)溶于乙腈中并在室温下搅拌。在搅拌的条件下将溶于乙腈的L-谷氨酸-二乙基酯(H2NCH(CO2Et)CH2CH2CO2Et)加入。在室温下搅拌12小时后，将乙腈蒸发。将粗产物溶于EA中并以1.0N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。以无水MgSO4干燥后，过滤，然后浓缩，将粗产物负载到装入硅胶的柱子中。柱层析纯化(洗脱液乙酸乙酯∶己烷)得粘性的黄色液体。
将化合物4以NaOH溶液水解。在室温下搅拌1天后，将有机液体蒸发。将水溶液以EA洗涤，在冰浴中搅拌，再以稀HCl酸化。将产物以EA萃取后，将有机溶剂以无水MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。
3.Boc-[8]-OH(3) 将化合物5、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)溶于乙腈中并在室温下搅拌。在搅拌的条件下将溶于乙腈的L-谷氨酸-二乙基酯(H2NCH(CO2Et)CH2CH2CO2Et)加入。在室温下搅拌12小时后，将乙腈蒸发。将粗产物溶于EA中并以1.0N HCl和饱和碳酸氢钠溶液洗涤。以无水MgSO4干燥后，过滤，然后蒸发，将粗产物负载到装入硅胶的柱子中。柱层析纯化(洗脱液乙酸乙酯∶己烷)产生粘性的黄色液体。
将化合物6以NaOH溶液水解。在室温下搅拌1天后，将有机液体蒸发。将水溶液以EA洗涤，在冰浴中搅拌，再以稀HCl酸化。将产物以EA萃取后，将有机溶剂以无水MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。
实施例3.41.Boc-[2]-CN(3)
将化合物1在室温下溶于丙烯腈中。将冰醋酸加入，再将溶液回流加热24小时。将过量的丙烯腈在真空下蒸发掉，将残余物以氯仿萃取，然后加入至浓氨水溶液中。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
2.Boc-[2]-NH2(4) 将Boc-[2]-CN 3溶于甲醇中，然后将氯化钴(II)六水合物加入。将硼氢化钠分次加入。将产生的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地以浓盐酸酸化。将溶剂在真空下去除并浓缩。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
3.Boc-[4]-CN(5) 将Boc-[2]-NH24在室温下溶于丙烯腈中。将冰醋酸加入，再将溶液回流加热24小时。将过量的丙烯腈在真空下蒸发掉，将残余物以氯仿萃取，然后加入至浓氨水溶液中。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
4.Boc-[4]-NH2(6)
将Boc-[4]-CN 5溶于甲醇中，然后将氯化钴(II)六水合物加入。将硼氢化钠分次加入。将产生的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地以浓盐酸酸化。将溶剂在真空下去除并浓缩。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
5.Boc-[8]-CN(7) 将Boc-[4]-NH26在室温下溶于丙烯腈中。将冰醋酸加入，再将溶液回流加热24小时。将过量的丙烯腈在真空下蒸发掉，将残余物以氯仿萃取，然后加入至浓氨水溶液中。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
6.Boc-[8]-NH2(8)
将Boc-[8]-CN 7溶于甲醇中，然后将氯化钴(II)六水合物加入。将硼氢化钠分次加入。将产生的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地以浓盐酸酸化。将溶剂在真空下去除并浓缩。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
7.Boc-[16]-CN(9) 将Boc-[8]-NH28在室温下溶于丙烯腈中。将冰醋酸加入，再将溶液回流加热24小时。将过量的丙烯腈在真空下蒸发掉，将残余物以氯仿萃取，然后加入至浓氨水溶液中。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
7.Boc-[16]-NH2(10) 将Boc-[16]-CN 9溶于甲醇中，然后将氯化钴(II)六水合物加入。将硼氢化钠分次加入。将产生的混合物在室温下搅拌2小时，然后小心地以浓盐酸酸化。将溶剂在真空下去除并浓缩。将有机相分离，以水洗涤，然后以硫酸钠干燥。
实施例3.51.A-[3]-链烯(3) 将A-[1]-SiCl31与过量10％的烯丙基镁溴化物的乙醚溶液回流4小时，然后冷却至0℃，再以10％NH4Cl水溶液水解。将有机层以水洗涤，以MgSO4干燥，然后浓缩。
2.A-[3]-SiCl3(4)
将A-[3]-链烯3、HSiCl3及常用的基于铂的氢硅烷化催化剂，如H2PtCl6的2-丙醇溶液(Speier’s催化剂)或铂二乙烯基硅氧烷复合物(Karstedt’s催化剂)的混合物在室温下搅拌24小时。当反应完成后，将过量的HSiCl3在真空下去除。
3.A-[9]-链烯(5) 将A-[3]-SiCl34与过量10％的烯丙基镁溴化物的乙醚溶液回流4小时，然后冷却至0℃，再以10％NH4Cl水溶液水解。将有机层以水洗涤，以MgSO4干燥，然后浓缩。
4.A-[9]-SiCl3(6) 将A-[9]-链烯5、HSiCl3及普通的基于铂的氢硅烷化催化剂，如H2PtCl6的丙-2-醇溶液(Speier’s催化剂)或铂二乙烯基硅氧烷复合物(Karstedt’s催化剂)的混合物在室温下搅拌24小时。当反应完成后，将过量的HSiCl3在真空下去除。
实施例3.61.[1]-酸-[3]-三元醇(3)2.
(a)将三元醇1氰基乙基化得到腈化合物2。在110℃，将丙烯腈、nBu3SnH及偶氮二异丁腈加入至包括化合物1的PhCH3中。(b)在这些条件下如KOH、EtOH/H2O、H2O2、Δ，将腈化合物2水解得到纯净的具有羧基的化合物3。
2.A-[3]-三元醇(5) (c)使用1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)将[1]-酸-[3]-三元醇通过酰胺偶联反应与化合物4连接。
3.A-[3]-三溴化物(6)
(d)在100℃通过用HBr/H2SO4溴化将醇用于合成三溴化物。
4.[1]-CN-[3]-OBzl(8) (e)使用Me2SO和KOH将三元醇1以苄基氯化物处理，得到三元醚。(f)将三元醚8氰基乙基化得到腈化合物9。在110℃，将丙烯腈、nBu3SnH及偶氮二异丁腈加入至包括化合物8的PhCH3中。
5.[1]-OH-[3]-OBzl(11) (g)在这些条件下如KOH、EtOH/H2O、H2O2、Δ，将腈化合物9水解得到纯净的具有羧基的化合物10。(h)将具有羧基的化合物10以过量的1.0MBH3·THF溶液处理，将酸转化为醇。
6.[1]-炔-[3]-OBzl(13)
(i)将醇以过量的SOCl2和催化量的吡啶转化为氯化物(CH2Cl2)。(j)将氯化物与乙炔化锂乙二胺复合物的二甲基亚砜溶液在40℃下反应。
7.A-[3]-炔-[9]-OBzl(14) (k)在0-40℃将A-[3]-OBzl 6用4当量的末端炔模块13、六甲基磷酰三胺(HMPA)、二异丙胺基锂(LDA)及四甲基乙二胺(TMED)烷基化1.5小时。
实施例3.71.A-[9]-OH(15) 在60℃下，在包括10％Pd-C/H的EtOH和THF溶液中将A-[3]-炔-[9]-OBzl 14以Pd-C/H还原和脱保护4天，得A-[9]-OH 15。
2.A-[27]-COOH(17) 使用SOBr2的CH2Cl2溶液于40℃在12h内将醇平稳地转化为九元溴化物。然后将九元溴化物化合物用12当量的[1]-炔-[3]-OBzl 13烷基化，得49％的A-[9]-炔-[27]-OBzl 16。在60℃下，将包括10％Pd-C/H的EtOH和THF溶液中将A-[9]-炔-[27]-OBzl 16以Pd-C/H一步还原和脱保护4天，得89％的A-[27]-OH。将A-[27]-OH以NH4OH或(CH3)4NOH处理的RuO4氧化，得85％的A-[27]-COOH 17。
实施例3.81)[G1]-(OMe)2(3)
将化合物1(1.05mol当量)、3，5-二甲氧基苄基溴(1.00mol当量2)、碳酸钾(1.1mol当量)及18-c-6(0.2mol当量)的无水丙酮混合液在氮气下回流加热48小时。将混合物冷却并蒸发至干，然后将残余物在CH2Cl2和水之间分配。将水层以CH2Cl2(3×)萃取，然后将组合的有机层干燥并蒸发至干。以EtOAc-CH2Cl2作洗脱液将粗产物以快速层析纯化，得到化合物3。
2)[G1]-(OH)2(4) 将化合物3的甲基醚基团以BBr3的EtOAc溶液处理1小时脱保护，以MeOH-EtOAc作洗脱液将粗产物以快速层析纯化，得到化合物4。
3)[G2]-(OMe)4(5) 将[G1]-(OH)2(1.00mol当量4)、3，5-二甲氧基苄基溴(2.00mol当量2)、碳酸钾(2.1mol当量)及18-c-6(0.2mol当量)的无水丙酮混合液在氮气下回流加热48小时。将混合物冷却并蒸发至干，然后将残余物在CH2Cl2和水之间分配。将水层以CH2Cl2(3×)萃取，然后将合并的有机层干燥并蒸发至干。以EtOAc-CH2Cl2作洗脱液将粗产物以快速层析纯化，得到化合物5。
4)[G2]-(OH)4(6) 将化合物5的甲基醚基团以BBr3的EtOAc溶液处理1小时脱保护，然后以MeOH-EtOAc作洗脱液将粗产物以快速层析纯化，得到化合物4。
5)[G3]-(OMe)8(7) 将[G2]-(OH)4(1.00mol当量6)、3，5-二甲氧基苄基溴(4.00mol当量2)、碳酸钾(4.1mol当量)及18-c-6(0.2mol当量)的无水丙酮混合液在氮气下回流加热48小时。将混合物冷却并蒸发至干，然后将残余物在CH2Cl2和水之间分配。将水层以CH2Cl2(3×)萃取，然后将组合的有机层干燥并蒸发至干。以EtOAc-CH2Cl2作洗脱液将粗产物以快速层析纯化，得到化合物7。
6)[G3]-(OH)8(8) 将化合物7的甲基醚基团以BBr3的EtOAc溶液处理1小时脱保护，然后以MeOH-EtOAc作洗脱液将粗产物以快速层析纯化，得到化合物8。
实施例4锥形分子在基质上的组装将TMAC(N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基铵氯化物)在氧化玻璃而不是APDES上自组装。TMAC层上的树状分子层不必封闭残留胺。
以TMAC氨基硅烷化。将干净基质(玻片)置于TMAC(2mL)和丙酮(100mL)溶液中5小时。自组装后，将基质从烧瓶中取出，以丙酮洗涤。将基质置于烤箱内，然后在110℃加热40分钟。浸入丙酮后，将基质超声处理3分钟。将洗净的基质置于聚四氟乙烯容器中，然后置于具有O-环的大螺帽的玻璃容器中，最后将该容器抽空(30-40mTorr)以干燥基质。

TMAC(N-三甲氧基硅烷基丙基-N，N，N-三甲基铵氯化物)的结构。
Fmoc-间隔基团-[9]酸的自组装与CBz-[9]酸完成条件相同，除了以乙酸酐封闭残留胺以外。
Fmoc-间隔基团-[9]酸(5)的自组装。将一定量的Fmoc-间隔基团-[9]酸(5)溶于混合溶剂(DMF∶去离子水＝1∶1(v/v))中制得20mL溶液。将溶液加入聚四氟乙烯瓶中，然后将几片上述制备的氨基硅烷化的玻片置于溶液中。允许瓶子在室温下自组装的同时，1天后将各片基质从溶液中取出。取出后立即将其以大量的去离子水洗涤。将基质依次在去离子水、去离子水-甲醇(1∶1(v/v))及甲醇中超声处理，每步3分钟。超声处理后，将基质置于聚四氟乙烯瓶中，然后置于具有O-环的大螺帽的玻璃容器中，最后将该容器抽空(30-40mTorr)以干燥基质。
Fmoc从自组装的Fmoc-间隔基团-[9]酸(5)的脱保护。配制含有5％哌啶的DMF溶液的聚四氟乙烯瓶。将自组装的基质浸入瓶中，然后搅拌20分钟。各基质依次于丙酮和MeOH中超声处理3分钟，然后在真空室中抽空(30-40mTorr)。
实施例5锥形分子(9-酸和27-酸)修饰的表面上的p53微阵列将7个密码子，175、215、216、239、248、273及282选择用于本研究，这些密码子已知为具有显著高频率的错义突变热点。7个密码子中的密码子175、248、273及282取自国际TP53突变数据库(IARC，http//www-p53.iarc.fr/p53DataBase.htm)，以及其它三个密码子215，216和239取自Korean p53突变热点数据库。将7个密码子的俘获探针序列(固定在锥形分子修饰的表面上的DNA)以软件设计，其长度为15-23个碱基，这些碱基随密码子不同而变化，设定Tm为55℃左右。
实施例5.1使用以单一锥形分子修饰的表面检测p53基因的7个热点突变。将以锥形分子修饰的基质用于癌细胞系中p53肿瘤抑制基因的单点突变检测。跨越7个热点密码子(175、215、216、239、248、273及282)的靶标DNA样品(100-200个碱基)以随机引物扩增从细胞系中提取的DNA(见实施例5.8)，并允许其与根据已固定的相应于7个热点密码子设计的俘获探针(15～25个碱基的寡核苷酸)杂交。各杂交点的荧光强度以共聚焦激光扫描仪测定，计算SNP分辨效率。该研究显示用于检测实际靶标样品中的单点突变的以锥形分子修饰表面上的DNA微阵列的质量。
实施例5.2具有T30的探针寡核苷酸长度对杂交效率和SNP分辨的影响将俘获探针的长度对SNP分辨的影响通过改变具有T30的俘获探针的长度进行测试。通过连接特异序列的5′端和以锥形分子修饰表面上的末端伯胺基团，固定含有T30的密码子175和239的相应俘获寡核苷酸后，将p53靶标DNA杂交，然后测定荧光强度。该研究显示SNP分辨效率和信号强度对俘获探针长度的依赖性。
实施例5.3俘获探针浓度与强度；以及俘获探针浓度与SNP分辨的关系研究了信号强度和SNP分辨效率对俘获探针浓度的依赖性。将不同浓度的、位于以锥形分子修饰表面上的俘获探针与靶标DNA杂交，然后检测荧光强度及SNP分辨效率。确定p53俘获探针的最佳浓度。
实施例5.4靶标探针浓度与强度；以及靶标探针浓度与SNP分辨的关系研究了信号强度和SNP分辨效率对靶标探针浓度的依赖性。将不同浓度的靶标DNA用于杂交，然后检测荧光强度及SNP分辨效率。该工作提供以锥形分子修饰表面上的DNA微阵列的动态范围。
实施例5.5混合靶标样品中突变的检测靶标样品的点突变可被检测到，在这些样品中突变的靶标序列与正常序列相比只占小部分(5或10％)中。将含有两种靶标DNA的样品以不同的摩尔比制备，用于杂交以检测正常的和突变的靶标DNA混合物中某一密码子中的单点突变。该工作具有检测早期癌症的临床意义。
实施例5.6-10种未知结肠癌细胞系中突变的检测本发明体系用于检测未知癌细胞系中的突变。
实施例5.6.1细胞培养及基因组DNA提取。结肠癌细胞系SNU-C1、SNU-C5、COLO 201、COLO 205、DLD-1、LS 513、HCT-15、LS 174T、HCT 116及SW480购自KCLB(Korea Cell Line Bank，Seoul，Korea)。将细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)、100μg/ml链霉素及100U青霉素(GibcoBRL，Carlsbad，CA)的RPMI 1640培养基中，于37℃5％CO2中培养。收获结肠癌细胞(2×106个细胞)，按照制造商的用法说明以Invisorb_spincell mini kit(Invitek，Berlin，Germany)提取基因组DNA。从这些基因组DNA中，制备p53靶标DNA(见实施例5.8.2)，使用上述相同方法完成DNA微阵列试验。
实施例5.7靶标探针长度对杂交效率和SNP分辨的影响以几种不同方法，如随机引物扩增、PCR及DNA酶降解，通过制备不同长度的靶标DNA，研究了靶标探针长度对杂交和SNP分辨效率的影响。
实施例5.8试验方案实施例5.8.1基因组DNA样品SNU-细胞系(SNU-61、216、475、563、601、668、761及1040)的基因组DNA由Jae-Gab Park，College of Medicine in Seoul National University惠赠。提供的SNU-细胞系为来自个别的Korean患者的人癌细胞系。这些细胞系的特征先前已被描述并已用于各种研究中(Bae IS等，2000，Park JG等，1997，Kang MS等，1996，Yuan Y等，1997，378-87)。
实施例5.8.2-亚克隆及测序将各种细胞系p53基因，特别是外显子5和外显子8之间的片段，以2对已用于先前报道的合成寡核苷酸引物进行PCR扩增外显子5Fwd I，5’-CTG ACT TTC AAC TCT GTC TCC T-3’(SEQ ID NO5)；外显子5Fwd II，5’-TAC TCC CCT GCC CTC AAC AA-3’(SEQ ID NO6)；外显子8Rev I，5’-TGC ACC CTT GGT CTC CTC CAC-3’(SEQ ID NO7)；外显子8RevII，5’-CTC GCT TAG TGC TCC CGG G-3’(SEQ ID NO8)(Kang MS等，1996)。将各基因组DNA以10皮摩尔第一引物对(外显子5Fwd I和外显子8Rev I，与内含子4和内含子8对应)、250μM dNTP混合物、2.5U Taq聚合酶(NEB)的1x ThermoPol缓冲液(添加了Taq聚合酶)的20μl总反应体积在Multiblock System(Hybaid，UK)中扩增，使用以下设定聚合酶在95℃起始活化1分钟，然后在95℃30秒、58℃30秒、72℃90秒作20个循环，最后的延伸步骤为72℃5分钟。将第一次PCR产物稀释并用作第二次PCR的模板。将扩增的基因组DNA PCR产物稀释20倍并用于第二次嵌套式PCR，其条件与先前的步骤相同，除PCR是以10皮摩尔第二引物对(外显子5Fwd II and外显子8Rev II，与外显子5和外显子8对应)完成以及扩增循环增加至25个循环以外。最后的嵌套式PCR产物以凝胶提取方法纯化。将来自基因组DNA的PCR产物连接入pGEM T-easy载体(Promega)，然后转化DH5a细胞。将亚克隆质粒以QIAGEN Plasmid Min kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化用于测序分析。使用下述pUC/M13 Forward and ReverseSequencing Primer进行双向测序，该引物为M13 FWD 5’-GTT TTC CCAGTC ACG ACG TTG-3’(SEQ ID NO9)及M13 REV 5’-TGA GCG GATAAC AAT TTC ACA CAG-3’(SEQ ID NO10)。
实施例5.8.3-靶标探针的制备将跨越SNP位点的DNA靶标探针在Multiblock System(Hybaid，UK)中随机引物扩增和标记，使用50ng具有50U Klenow酶(NEB)的模板DNA、添加了Klenow酶的1x EcoPol缓冲液、6μg八碱基随机引物(由Bionics合成)、低ldT的dNTP混合物(100μM dA、G、CTP/50μM dTTP)以及50μM Cyanine3-dUTP(NEN)的20μl总反应体积于37℃扩增2小时。将未掺入的核苷酸以QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)分离。使用紫外/可见光分光光度计进行定量和定性(核苷酸的特异性、掺入荧光染料的核酸数目)分析后，将合格的产物用于杂交。
实施例5.8.4细胞培养及基因组DNA提取。结肠癌细胞系SNU-C1、SNU-C5、COLO 201、COLO 205、DLD-1、LS 513、HCT-15、LS 174T、HCT 116及SW480购自KCLB(Korea Cell Line Bank，Seoul，Korea)。将细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)、100μg/ml链霉素及100U青霉素(GibcoBRL，Carlsbad，CA)的RPMI 1640培养基中，于37℃5％CO2中培养。收获结肠癌细胞(2×106个细胞)，按照制造商的用法说明以Invisorb_spincell mini kit(Invitek，Berlin，Germany)提取基因组DNA。
实施例6将蛋白质探针固定于锥形分子上实施例6.1将NHS-生物素排列至以树状分子修饰的玻片。
在1mL 50mM碳酸氢钠缓冲液及DMSO(40％v/v)溶液中制备琥珀酰亚胺基D-生物素(1.0mg)的点样溶液。在10,000级洁净度的空间中使用Microsys 5100 microarrayer(Cartesian Technologies，Inc，USA)将NHS-生物素排列至树状分子修饰的玻片。排列后并在湿盒(～75％湿度)中孵育1小时，然后将生物素微阵列依次以DMF(50℃)、THF以及具有MBST(50mMMES、100mM NaCl、0.1％Tween-20，pH 6.0)的水洗液洗涤，每步2小时。将玻片以双蒸水冲洗，干燥，或者立即使用，或者于室温下贮存数天。
实施例6.2蛋白质/配体相互作用的检测。本方法根据Hergenrother，P.J.；Depew，K.M.；Schreiber，S.L J.Am.Chem.Soc.2000，122，7849，如下在加入Cy3标记的链亲和素溶液之前，将玻片以添加了3％牛血清白蛋白(BSA)的MBST封阻1小时。简单冲洗后，在室温下将玻片放入Cy3标记的链亲和素溶液中30分钟。通过以添加了1％BSA的MBST将适合的蛋白质贮存液稀释至1μg/mL的浓度制备该溶液。孵育后，将玻片以MBST冲洗一次，然后在12分钟内于MBST中温和搅动，期间MBST更换3次。将玻片干燥，然后使用商品化的共聚焦激光扫描仪ScanArray_Lite(GSI Lumonics)扫描。将定量微阵列分析软件ImaGene(BioDiscovery，Inc.)用于图像获取及荧光强度分析。
实施例7制备包括大小受控的大分子在内的控孔玻璃珠的方法结合氨基丙基基团的控孔玻璃珠(AMPCPG；80-120目；平均孔径，50nm或300nm)及以长链氨基烷基基团修饰的控孔玻璃珠(LCAA-CPG；80-120目；平均孔径，50nm)购自CPG，Inc。1，4-丁二醇二缩水甘油醚、1，3-二氨基丙烷、还原型谷胱甘肽(GSH)、N-(3-甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(9-芴基甲氧基羰基氧)氯化物(Fmoc-Cl)、哌啶、4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、磷酸缓冲盐片(PBS)获自Sigma-Aldrich。其它所有化学试剂为分析试剂级，无需进一步纯化使用。去离子水(18MΩ·cm)通过将蒸馏水通过BarnsteadE-pure 3-Module system获得。以Hewlett-Packard diode-array 8453分光光度计记录紫外可见光光谱。
实施例7.1将谷胱甘肽固定于以锥形分子修饰的CPG上(样品E1和E3)。(i)以Fmoc-(3)酸修饰使用玻璃滤器将AMPCPG(干重0.70g)以丙酮充分洗涤。在真空中干燥后，将1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1.0mL)和碳酸盐缓冲液(2.0mL，pH＝11)的混合物加至AMPCPG(表面容量91.8μmol/g，表面积47.9m2/g)。在室温下振摇24小时后，通过过滤将产生的珠状物自溶液中分离，再依次以去离子水和丙酮充分洗涤。然后将含有该样品的瓶以1，3-二氨基丙烷(1.0mL)和碳酸盐缓冲液(pH＝11)的混合物于室温下振摇24小时。充分洗涤后，将2-巯基乙醇(1.0mL)和碳酸氢钠水溶液(2.0mL，pH＝8.5)的混合物用于封阻表面上残留的环氧基团。然后，将溶有Fmoc-(3)酸(14mg，21.3μmol)、N-(3-甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(15mg，77μmol)及N-羟基琥珀酰亚胺(9.0mg，77μmol)的二甲基甲酰胺(30％DMF(v/v))水溶液加入含有珠状物的瓶中。在室温下振摇11小时后，将珠状物依次以去离子水和丙酮充分洗涤。(ii)封阻步骤将乙酸酐(1.0mL)的无水二氯甲烷(2.0mL)溶液与残留的胺在室温下反应过夜。(iii)脱保护步骤依次以二氯甲烷和丙酮洗涤珠状物后，将20％哌啶的DMF(3.0mL)溶液加入装有珠状物的瓶中，然后将瓶振摇30分钟。(iv)配体固定步骤再次将1，4-丁二醇二缩水甘油醚(1.0mL)和碳酸盐缓冲液(2.0mL，pH＝11)的混合物加入瓶中，然后将混合物于室温下再振摇24小时。将珠状物依次以去离子水和丙酮洗涤后，将还原型谷胱甘肽(GSH，5.4mg，17.6μmol)的碳酸氢钠溶液(3.0mL，pH 8.5)加入含有珠状物的瓶中，然后将瓶于室温下振摇12小时。洗涤珠状物后，将2-巯基乙醇(1.0mL)和碳酸氢钠水溶液(2.0mL，pH＝8.5)加入含有珠状物的瓶中。最后，将珠状物分离，洗涤，真空干燥并于4℃干燥的氮气气氛下贮存。随后以相同于上述的步骤严格制备样品E3，除使用Fmoc-(9)酸代替Fmoc-(3)酸以外。
实施例7.2制备其它固定GSH束缚的基质用于对照试验。(样品CS、CL及A)(i)样品CS和CL将GSH通过GMBS连接分子直接固定于AMPCPG和LCAA-CPG上。使用玻璃滤器将珠状物(0.10g)以丙酮充分洗涤。在真空中干燥后，将溶有4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS，3.0mg，11μmol)的DMF和碳酸氢钠缓冲液(1.0mL，3∶7(v/v)，pH＝8.5)的混合物加入含有珠状物的瓶中。在室温下振摇4小时后，通过过滤将产生的珠状物自溶液中分离，再依次以去离子水和丙酮充分洗涤。最后，将乙酸酐(1.0mL)的无水二氯甲烷(2.0mL)溶液与基质上残留胺基团反应。充分洗涤后，将谷胱甘肽(GSH，3.4mg，11μmol)的PBS缓冲液(1.0mL)加入含有珠状物的瓶中，然后将瓶于室温下振摇12小时。将2-巯基乙醇(1.0mL)用于封阻残留的马来酰亚胺基团后，将珠状物分离，洗涤，真空干燥。(ii)样品A采用与针对E1和E3相同的修饰步骤，以1，4-丁二醇二缩水甘油醚及1，3-二氨基丙烷修饰AMPCPG。以2-巯基乙醇封闭后，将1，4-丁二醇二缩水甘油醚用于产生环氧基团。最后，将谷胱甘肽固定，然后将2-巯基乙醇用于打开珠状物上的剩余环氧基团。
实施例7.3修饰的珠状物上的胺密度的测定将按照成E1或E3制备的被修饰珠状物或作为对照试验的珠状物(10mg)装入e管。平行地，将9-芴基甲基氯甲酸酯(Fmoc-Cl，1.75mg)和Na2CO3(1.45mg)放入单独的玻璃管，然后将混合溶剂(2∶1(v/v)1，4-二噁烷和水，2.5mL)加入以溶解反应物。将五分之一的溶液取出并转入含有珠状物的e管中。将管放入瓶中，然后将瓶于室温下振摇12小时。将珠状物以玻璃滤器分离，并将多孔材料依次以去离子水和丙酮洗涤。在真空中干燥后，将20％哌啶的DMF溶液(0.50mL)加入含有珠状物的e管中。将珠状物与哌啶反应30分钟。然后小心地将产生的溶液自管中转入新的e管中，并将珠状物以20％哌啶的DMF溶液(0.25mL)洗涤两次。将所有溶液加入先前的e管中。然后将溶液与一定体积的甲醇混合以调节吸光率。使用紫外可见光分光计测定在301nm处的吸光率以及将相应溶剂用于背景修正。为了提高可靠性，以五种不同样品进行测定。
为了校准，我们在20％哌啶的DMF中制备了一系列N-Fmoc-乙醇胺(或9-芴基甲基N-(2-羟基乙基)氨基甲酸酯)(30μM-70μM)的溶液。反应30分钟后，将含有二苯并富烯的溶液用于测定吸光率，并计算吸光系数。
实施例7.4GST融合蛋白裂解物的制备GST融合蛋白的制备如前Kim，J.H.；Lee，S.；Kim，J.H.；Lee，T.G.；Hirata，M.；Suh，P.-G.；Ryu，S.H.；Biochemistry 2002，41，3414-3421中所述，此处全部引入以供参考。为了大规模培养，将含有重组pGEX质粒的单克隆培养于200ml 2X YTA培养基中。长至对数期后，以IPTG再诱导基因表达6小时。随后，通过离心将细胞沉淀并以1X PBS洗涤。然后将E.coli于含有0.50mM PMSF的10mL低渗缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl、1.0mM MgCl2、1.0mM EGTA，pH7.4)中以超声破碎器裂解。通过去除不溶物质获得蛋白质。
实施例7.5结合分析(i)链长的影响将制备的珠状物CL(5.72mg)、CS(6.97mg)、E1(10.0mg)及E3(14.8mg)分别与混合液在4℃孵育1小时，该混合液包括GST裂解物在0.8mL孵育缓冲液(20mM Tris，150mM NaCl，1.0mM MgCl2，1.0mM EGTA，1％TX-100，0.10mM PMSF，pH 7.4，0.50mMPMSF)中形成的混合液，再以10倍体积的孵育缓冲液洗涤3次，然后加入100μL SDS-样品缓冲液。待管在95℃煮5分钟后，将20μL样品用于SDS-PAGE，并将凝胶以CBB G-250染色液染色。(ii)以锥形分子处理的基质的选择性将10mg样品A、E1和E3以及100μg纯化的GST或GST融合蛋白裂解物用于此试验。其它步骤与上述相同。
实施例7.6GST融合蛋白自谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B、E1和E3的洗脱将谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B、E1和E3作如”结合分析(i)”中所述处理。使用Image gauge V3.12(FUJI PHOTO FILM CO.，LTD.)测定结合到珠状物的蛋白质量。随后对p47phox的PX结构域和Munc-18片段裂解物采取相同的步骤(图13)。
此处将引用的所有参考文献全部引入以供参考。
本领域技术人员将认识到，或使用常规试验就能确定，此处明确地描述了本发明具体实施方案的许多等同物。这些同物等已包括在权利要求的范围内。
序列表<110>POSCO公司(POSCO)学校法人 浦项工科大学校(POSTECH FOUNDATION)<120>大小受控的大分子<130>opp20042241kr<150>PCT/KR03/01913<151>2003-09-18<150>PCT/KR03/02261<151>2003-10-24<150>US 60/567,844<151>2004-05-03<150>US 60/571,052<151>2004-05-14<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n可为a，t，g，或c.
<400>1ccattccgng tgtcca 16<210>2
<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<220>
<221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>n可为a，t，g，或c.
<400>2tttttttttt tttttttttt tttttttttt cattccgngt gtcca 45<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶标<400>3tggacactcg gaatg 15<210>4<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>靶标<400>4cctacgaaat ctactggaac gaaatctact tggacactcg gaatg 45<210>5<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ctgactttca actctgtctc ct 22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tactcccctg ccctcaacaa 20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7tgcacccttg gtctcctcca c21<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ctcgcttagt gctcccggg 19
<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9gtttcccag tcacgacgtt g 21<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10tgagcggata acaatttcac acag 2权利要求
1.一种基质，包括有规则地间隔的、大小受控的大分子的分子层，所述的大分子包括含分枝区域和线性区域的聚合物，其中分枝区域的许多末端与基质结合，线性区域的末端被官能化。
2.根据权利要求1的基质，其中大分子以规则的间隔隔开。
3.根据权利要求2的基质，其中所述大分子的线性官能团之间被约0.1nm至约100nm的规则间隔隔开。
4.根据权利要求3的基质，其中所述大分子以约10nm的规则间隔隔开。
5.根据权利要求1的基质，其中分枝区域末端可以被-COZ、-NHR、-OR’或-PR”3官能化，其中Z为离去基团，其中R为烷基，其中R’为烷基、芳基或醚，并且R”为H、烷基或烷氧基。
6.根据权利要求5的基质，其中COZ为酸、酯、活化酯、酰卤、活化酰胺或CO-咪唑基。
7.根据权利要求1的基质，其中聚合物为锥形分子。
8.根据权利要求1的基质，其中线性区域包括间隔基团区域。
9.根据权利要求8的基质，其中间隔基团区域通过第一官能团与分枝区域连接。
10.根据权利要求9的基质，其中第一官能团为-NH2、-OH、-PH3、-COOH、-CHO或-SH。
11.根据权利要求8的基质，其中间隔基团区域包括与第一官能团共价连接的连接基团区域。
12.根据权利要求11的基质，其中连接基团区域包括取代的或未被取代的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、醚、聚醚、酯或氨基烷基基团。
13.根据权利要求8的基质，其中间隔基团区域包括第二官能团。
14.根据权利要求13的基质，其中第二官能团为-NH2、-OH、-PH3、-COOH、-CHO或-SH。
15.根据权利要求13的基质，其中第二官能团位于线性区域的末端。
16.根据权利要求1的基质，其中保护基团结合至线性区域的末端。
17.根据权利要求16的基质，其中保护基团对酸或碱不稳定。
18.根据权利要求1的基质，其中靶标特异性配体结合至线性区域的末端。
19.根据权利要求18的基质，其中靶标特异性配体为化合物、DNA、RNA、PNA、适体、肽、多肽、糖类、抗体、抗原、仿生物质、核苷酸类似物或其组合。
20.根据权利要求18的基质，其中在大分子的线性区域结合的靶标特异性配体之间的距离为约0.1至约100nm。
21.根据权利要求1的基质，其中基质由半导体、合成有机金属、合成半导体、金属、合金、塑料、硅、硅酸盐、玻璃或陶瓷制成。
22.根据权利要求21的基质，其中基质为片状物、颗粒、珠状物、微孔或多孔材料。
23.根据权利要求22的基质，其中多孔材料为膜、明胶或水凝胶。
24.根据权利要求22的基质，其中珠状物为控孔珠状物。
25.一种制备有规则地间隔的、大小受控的大分子的分子层的方法，所述的大分子包括含分枝区域和线性区域的聚合物，其中分枝区域的许多末端与基质结合，线性区域的末端被官能化，所述的方法包括(i)使基质官能化以便其与大分子的末端发生反应；以及(ii)使大分子与基质接触以便末端与基质成键。
26.根据权利要求25的方法，其中基质可由半导体、合成有机金属、合成半导体、金属、合金、塑料、膜、硅、硅酸盐、玻璃或陶瓷制成。
27.根据权利要求25的方法，其中所述基质为片状物、珠状物、微孔或多孔材料。
28.根据权利要求27的方法，其中多孔材料为水凝胶、明胶或膜。
29.根据权利要求27的方法，其中珠状物为控孔珠状物。
30.根据权利要求25的方法，其中将靶标特异性配体固定到线性区域的末端，包括以下步骤i)从在基质上的大分子的线性区域的末端脱去保护基团；以及ii)将靶标特异性配体或连接靶标特异性配体的连接分子与在基质上的大分子的线性区域的末端接触，以使配体或连接分子与末端成键，其中连接分子为同型双功能团的或异型双功能团的连接分子。
31.根据权利要求30的方法，其中基质上所述大分子的存在使所述靶标特异性配体与线性末端的结合受到的干扰最小化。
32.根据权利要求30的方法，其中基质上所述大分子的存在使对所述靶标特异性配体特异性的靶标的检测受到的干扰最小化。
33.根据权利要求30的方法，其中所述靶标特异性配体以规则的间隔隔开。
34.根据权利要求30的方法，其中所述基质包括低密度的靶标特异性配体。
35.根据权利要求34的方法，其中所述靶标特异性配体的低密度范围为约0.01探针/nm2至约0.5探针/nm2。
36.根据权利要求30的方法，其中所述靶标特异性配体为化合物、DNA、RNA、PNA、适体、肽、多肽、酶、糖类、多糖、抗体、抗原、仿生物质、核苷酸类似物或其组合。
37.一种用于检测基因中突变的诊断体系，其包括根据权利要求1的基质，其中线性区域的末端固定靶标特异性寡核苷酸。
38.根据权利要求37的诊断体系，其中基质包括对癌症相关基因特异的寡核苷酸。
39.根据权利要求38的诊断体系，其中所述的癌症相关基因为p53。
40.一种用于检测基因中突变存在的方法，包括将根据权利要求1的基质与含有待分析基因的样品相接触，其中线性区域的末端固定靶标特异性寡核苷酸。
41.根据权利要求40的方法，其中基因为癌症相关基因。
42.根据权利要求41的方法，其中基因为p53。
全文摘要
本发明公开一种基质，包括有规则地间隔的、大小受控的大分子的分子层，所述的大分子包括含分枝区域和线性区域的聚合物，其中分枝区域的许多末端与基质结合，线性区域的末端被官能化。
文档编号G01N33/00GK1882701SQ200480034008
公开日2006年12月20日 申请日期2004年9月17日 优先权日2003年9月18日
发明者朴准远, 洪凤振, 崔永瑞, 吴淳振, 崔宽镕 申请人:Posco公司, 学校法人 浦项工科大学校