专利名称：一种用于分离水溶性聚合物和蛋白用色谱填料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种色谱填料，特别涉及一种用于分离水溶性聚合物和蛋白用色谱填料及其制备方法。
背景技术：
随着色谱技术的迅速发展，色谱填料也在不断的更新和发展，人们已经制备出各种不同种类的新型色谱填料来解决分离科学中存在的各种问题。目前，分离化学中面临的主要问题是复杂生物样品的分离比较困难。由于生物样品的组成极其复杂，许多生物大分子在生物样品中的含量极低，因而分离干扰大、分离纯化步骤繁多、流程长；并且，许多生物大分子在使用有机溶剂作为流动相分离纯化时极易失去活性；因此，生物大分子的分离纯化技术需要以此为依据，而选择合适的色谱分离填料是克服生物大分子在分离纯化过程中存在上述问题、获得对其进行高效分离纯化的关键。体积排阻色谱技术是20世纪60年代初发展的一种快速而又简单的分离技术，又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。所用的固定相是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，是一种按目标物分子大小进行分离的色谱技术。它的分离并不依赖于流动相和固定相间的作用力，按流动相类型不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。其常用的填料主要有硅胶或多聚体两大类，由于硅胶的内水体积更大，且孔径更均一，硅胶比聚合物凝胶有更好的分辨力，常被用于分子量范围在数千至近百万的蛋白质、多肽和生物酶等生物样品的分离。但传统工艺制备分离蛋白、多肽和生物酶等生物大分子的体积排阻色谱填料存在亲水性不够，稳定性较差等问题。因此，提供一种具有较大孔隙容积、较低的疏水性、较高的理论塔板数和较大的峰容量的色谱填料，正成为国内外研究的热点。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种制备分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的方法，该方法制备的色谱填料能用作多种分离保留模式，能分别作为HILIC模式和体积排阻模式用于液相色谱的分离分析，特别适用于水溶性聚合物和蛋白、多肽、生物酶等生物样品。为实现上述目的，本发明提供一种用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤A硅胶活化，制得活化硅胶；B将所述活化硅胶进行环氧基改性，制得环氧基改性硅胶；C在所述环氧基改性硅胶上引入亲水性聚合物，制得亲水性聚合物改性硅胶 '及D将所述亲水性聚合物改性硅胶水解，制得所述用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料。
根据本发明的构思，所述A步骤包括将硅胶用蒸馏水清洗，然后用氢氟酸水溶液浸泡，随后用蒸馏水洗涤至中性，最后用丙酮洗涤并干燥。根据本发明的构思，所述B步骤包括以硼酸缓冲液作为溶剂，将所述活化硅胶与环氧基硅烷化试剂在搅拌和回流下进行改性反应，其中所述环氧基硅烷化试剂有选为Y-(2，3-环氧丙氧)丙基二甲氧基娃烧。根据本发明的构思，所述C步骤包括将所述环氧基改性硅胶与亲水性聚合物在搅拌和回流下进行改性反应，反应结束后，抽滤，并依次用蒸馏水、四氢呋喃、乙腈进行洗涤。根据本发明的构思，所述D步骤包括将所述亲水性聚合物改性硅胶与柠檬酸缓冲液进行水解反应，反应结束后，抽滤，依次用蒸馏水和甲醇洗涤，真空干燥。根据本发明的构思，所述氢氟酸水溶液的质量浓度为O. 08%，且所述硅胶与氢氟酸水溶液的料液比为1:8-1:10。根据本发明的构思，所述硅胶与环氧基硅烷化试剂的质量比为1:2-1: 4，所述活化硅胶进行环氧基改性的反应时间为O. 5-2小时；反应温度为70-100° C。根据本发明的构思，所述硼酸缓冲液的pH值为7. 0-9. 0，所述活化硅胶与硼酸缓冲液的料液比为1:8-1:10。根据本发明的构思，所述亲水性聚合物为可溶性粉、纤维素或葡聚糖。根据本发明的构思，所述硅胶与可溶性淀粉的质量比为1: 2-1: 4，所述环氧基改性硅胶进行亲水性聚合物改性的反应时间为20-24小时；反应温度为70-100° C。根据本发明的构思，所述柠檬酸盐缓冲液的pH值为2. 0-4. 0，所述硅胶与柠檬酸盐缓冲液的料液比为1:8-1:10，所述亲水性聚合物改性硅胶进行水解的反应时间为1-3小时，反应温度为70-90° C。为实现上述目的，本发明同时还提供了一种用于分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料，通过上述任一项所述的制备方法制得。在本发明中，各反应步骤中所述的料液比为质量与体积之比。本发明通过如下的措施来实现首先，通过硅胶表面活性硅羟基与Y-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的反应将环氧基团键合到粒径均一的多孔硅胶表面，形成环氧基改性硅胶，然后通过硅胶表面硅羟基与亲水性聚合物(可溶性淀粉、纤维素以及葡聚糖等)的作用在其表面包覆一层聚合物，最后在酸性条件下使硅胶表面环氧基团水解形成二醇基，获得二醇基改性的分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料。该填料具有较大的孔体积，较低的疏水性，较高的理论塔板数和较大的峰容量。本发明采用分子自组装方式将亲水性聚合物包覆在硅胶微球表面，通过合成聚合物包覆的二醇基色谱填料，大大增强其稳定性。使得水溶性聚合物、蛋白、生物酶、多肽等生物大分子的非特异性吸附极小；具有优良的分辨能力。并且，优越的键合相表面消除了其它的吸附作用，保持了样品的生物活性，因而广泛应用于生物大分子的分离。本发明制备的色谱填料与常规的色谱填料相比具有以下优点1.多孔硅胶表面包覆的亲水性聚合物克服了填料存在亲水性不够理想的问题，并且增强了其稳定性。2.该填料对目标物具有多重保留机理，可以用作HILIC和体积排阻两种色谱分离模式，对水溶性聚合物以及蛋白、多肽、生物酶等生物样品具有极为优异的分离能力；3.该填料所用的流动相几乎为纯水相，分离条件极为温和，因而极大程度地保证了样品在分离过程中具有高生物活性；4.相比常规聚合物基质的色谱填料，硅胶基质的分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料具有较大的孔体积、较低的疏水性、较高的理论塔板数和较大的峰容量。
图1为本发明用于分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的合成示意图。图2为本发明实施例1所制备色谱填料分离头孢米诺钠及其相关物质的效果示意图。图3为本发明实施例1所制备色谱填料分离头孢西丁钠及其相关物质的效果示意图。图4为本发明实施例1所制备色谱填料分离头孢地嗪钠及其相关物质的效果示意图。图5为本发明实施例2所制备色谱填料分离门冬酰胺酶的效果示意图。图6为本发明实施例3所制备色谱填料分离分析胰岛素的效果示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。但本发明并不限于以下的实施例。本发明提供一种用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤A硅胶活化，制得活化硅胶；B将所述活化硅胶进行环氧基改性，制得环氧基改性硅胶；C在所述环氧基改性硅胶上引入亲水性聚合物，制得亲水性聚合物改性硅胶；及D将所述亲水性聚合物改性硅胶水解，制得所述用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料。其中A步骤包括将硅胶用蒸馏水清洗,然后用氢氟酸水溶液浸泡，随后用蒸馏水洗涤至中性，最后用丙酮洗涤并干燥。其中B步骤包括以硼酸缓冲液作为溶剂，将所述活化硅胶与环氧基硅烷化试剂在搅拌和回流下进行改性反应，其中所述环氧基硅烷化试剂有选为Y-(2，3-环氧丙氧)丙
基二甲氧基娃烧。其中C步骤包括将所述环氧基改性硅胶与亲水性聚合物在搅拌和回流下进行改性反应，反应结束后，抽滤，并依次用蒸馏水、四氢呋喃、乙腈进行洗涤。其中D步骤包括将所述亲水性聚合物改性硅胶与柠檬酸缓冲液进行水解反应，反应结束后，抽滤，依次用蒸馏水和甲醇洗涤，真空干燥。具体合成步骤过程，如图1所示。图1为本发明用于分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的合成示意图。以下为本发明制备用于分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的实施例，但本发明的构思及其应用原料/仪器并不限于。实施例1 :分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的制备(I)往500mL反应容器中加入50g硅胶，并加入200mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入400mL质量比为O. 08%氢氟酸水溶液,搅拌24小时后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗涤、过滤，110° C干燥12小时，得到经活化的硅胶；(2)往500mL反应容器中(装有冷凝器、机械搅拌器、温度计)中加入400mLpH=9. O的硼酸缓冲溶液(Tiidsol 缓冲液，购于广州华粤行仪器有限公司)、50g经活化的娃月父和IOOmL Y -(2，3_环氧丙氧)丙基二甲氧基娃烧，80° C揽祥反应30分钟；得到环氧基团改性硅胶；(3)向反应容器中加入IOOg可溶性淀粉，于97° C下回流搅拌反应20_22小时；反应结束后冷却回流一夜(12小时左右)；依次用200mL热的蒸馏水、200mL热的四氢呋喃和200mL热的乙腈清洗制备好的填料，过滤，得到可溶性淀粉改性硅胶；(4)将该可溶性淀粉改性硅胶重新置于反应容器中，加入500mL pH3. O柠檬酸缓
冲液(HydrionR缓冲液，购于广州和为有限公司)，于70° C下回流搅拌反应I小时；反应结束后用400mL蒸馏水、400mL甲醇清洗制备好的填料，过滤、并重复该步骤一次；将清洗好的填料自然晾干，然后在110° C真空干燥2小时，得到分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料。实施例2 :分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的制备(I)往500mL反应容器中加入50g硅胶，并加入200mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入 400mL质量比为O. 08%氢氟酸水溶液,搅拌24小时后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗涤、过滤，110° C干燥12小时，得到经活化的硅胶；(2)往500mL反应容器中(装有冷凝器、机械搅拌器、温度计)中加入450mLpH=9. O的硼酸缓冲溶液、50g活化的硅胶和150mL Y-(2, 3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，80° C搅拌反应30分钟；得到环氧基团改性硅胶；(3)向反应容器中加入150g葡聚糖，于97° C下回流搅拌反应20-22小时；反应结束后冷却回流一夜(12小时左右)；依次用200mL热的蒸馏水、200mL热的四氢呋喃和200mL热的乙腈清洗制备好的填料，过滤；得到葡聚糖改性硅胶；(4)将所得的葡聚糖改性硅胶重新置于反应容器中中，加入400mL pH3. O柠檬酸缓冲液(HydHonk^冲溶液，购于广州和为有限公司)，于70° C下回流搅拌反应I小时；反应结束后用200mL蒸馏水、200mL甲醇清洗制备好的填料，过滤、并重复该步骤一次；将清洗好的填料自然晾干，然后110° C真空干燥2小时，得到分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料。实施例3 :分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料的制备(I)往500mL反应容器中加入50g硅胶，并加入200mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入400mL质量比为O. 08%氢氟酸水溶液,搅拌24小时后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗涤、过滤，110° C干燥12小时，得到经活化的硅胶；(2)往500mL反应容器中(装有冷凝器、机械搅拌器、温度计)中加入450mLpH=9. O的硼酸缓冲溶液、50g活化的硅胶和150mL Y-(2, 3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，80° C搅拌反应30分钟；得到环氧基团改性硅胶；(3)向反应容器中加入150g纤维素，于97° C下回流搅拌反应20_22小时；反应结束后冷却回流一夜(12小时左右)；依次用200mL热的蒸馏水、200mL热的四氢呋喃和200mL热的乙腈清洗制备好的填料，过滤，得到纤维素改性硅胶；(4)将所得的维素改性硅胶重新置于反应容器中中，加入400mL pH3. O柠檬酸缓冲液(Hydrionk缓冲溶液，购于广州和为有限公司)，于70° C下回流搅拌反应I小时；反应结束后用200mL蒸馏水、200mL甲醇清洗制备好的填料，过滤、并重复该步骤一次；将清洗好的填料自然晾干，然后110° C真空干燥2小时，得到分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料。实施例4 :分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料色谱柱体积排阻分离将实施例1中的分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料进行装柱，柱长300mm,柱内径 7. 8_。以磷酸盐缓冲液(ρΗ7· O) [O. 005mol/L磷酸氢二钠溶液-O. 005mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(95:5)为流动相，流速为每分钟O. 8mL，检测波长为254nm，检测头孢米诺钠及其相关物质。如图2所示，图2为本发明实施例1所制备色谱填料分离头孢米诺钠及其相关物质的效果示意图。头孢米诺钠为头孢类抗生素，分子量为667. 67，其色谱图横坐标是保留时间，单位为min (分钟)，纵坐标是检测信号的响应值，单位为mV(毫伏)。由图可以看出头孢米诺钠色谱峰与其杂质色谱峰获得了极大程度的分离，克服了采用常规的C18柱难于分离头孢米诺钠及其杂质等众多问题，说明了该填料具有优异的分离性能。以磷酸盐缓冲液[O. 01mol/L磷酸氢二钠溶液-O. 01mol/L磷酸二氢钠溶液(66:34)]-乙腈(95:5)为流动相，流速为流速为每分钟O. 8mL，检测波长为232nm，测定头孢西丁钠及其相关物质。如图3所示，图3为本发明实施例1所制备色谱填料分离头孢西丁钠及其相关物质的效果 示意图。头孢西丁钠为头孢类抗生素，分子量为449. 43，其色谱图横坐标是保留时间，单位为min (分钟)，纵坐标是检测信号的响应值，单位为10_3mV(毫伏)。根据色谱图可以看出头孢西丁钠与其杂质能够获得较好的分离，并且分离杂质峰的灵敏度较高，充分证明了该填料具有优异的色谱分离性能。以磷酸缓冲溶液(pH=7. O) [O. 005mol/L磷酸氢二钠溶液-O. 005mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(95:5)作为流动相，流速为每分钟O. 8mL，检测波长为231nm，测定头孢地嗪钠及其相关物质。如图4所示，图4为本发明实施例1所制备色谱填料分离头孢地嗪钠及其相关物质的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为min (分钟)，纵坐标是检测信号的响应值，单位为10_3mV(毫伏)。根据色谱图可以看出头孢地嗪钠与其杂质能够获得较好的分离，并且分离杂质峰的灵敏度较高，完全满足药典所规定的分离参数。实施例5 :分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料色谱柱体积排阻分离将实施例2中的分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料进行装柱，柱长300mm，柱内径7. 8mm。以O. lmol/L磷酸盐缓冲液(ρΗ6· 7)(磷酸二氢钠6. Og,磷酸氢二钠20. 2g，加水900mL，用磷酸或氢氧化钠溶液调节pH值至6. 7，加水至IOOOmL)为流动相，流速为每分钟0. 6mL，检测波长为280nm，测定门冬酰胺酶。如图5所示，图5为本发明实施例2所制备色谱填料分离门冬酰胺酶的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为min (分钟)，纵坐标是检测信号的响应值，单位为10_3mV(毫伏)。由图可以明显看出该色谱柱能够将门冬酰胺酶的杂质峰分离，完全符合药典的规定。实施例6 :分离球状蛋白色谱用亲水硅胶色谱填料色谱柱体积排阻分离将实施例3中的分离球状蛋白色谱用亲水硅胶色谱填料进行装柱，柱长300_，柱内径7. 8mm。以乙腈三氟乙酸水=40:0. 1:60为流动相，流速为每分钟1. OmL，检测波长为210nm，测定胰岛素及其相关高分子物质。如图6所示，图6为本发明实施例3所制备色谱填料分离分析胰岛素的效果示意图。横坐标是保留时间，单位为min (分钟)，纵坐标是检测信号的响应值，单位为10_3mV(毫伏)。由图可以看出使用该色谱柱能够得到较好的胰岛素峰型，并获得较高的柱效。对比实施例分离球状蛋白色谱用亲水硅胶色谱填料色谱柱与其他类型的色谱柱对比效果。将实施例3中的分离球状蛋白色谱用亲水硅胶色谱填料进行装柱，柱长300_，柱内径7. 8mm。以磷酸缓冲溶液(pH=7. O) [O. 005mol/L磷酸氢二钠溶液-O. 005mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]-乙腈(95:5)作为流动相，流速为每分钟O. 8mL，检测波长为231nm，测定头孢地嗪钠及其相关物质。并将测定的结果与常规的C18柱、其他公司类似的色谱柱(例如赛分科技的SRT SEC-150)对比，发现使用常规的C18柱无法将头孢地嗪钠和其相关杂质分离开来，其分离度不超过1. 0，而使用赛分公司SRT SEC-150分离头孢地嗪钠和其相关杂质时，其分离度仍然不够理想，目标物头孢地嗪钠与其杂质不能达到基线分离，并且杂质峰的响应也不够理想；而使用本方法制备的分离球状蛋白色谱用亲水硅胶色谱填料色谱柱最大的优势在于目标物头孢地嗪钠与其相关杂质的分离度均能达到基线分离，证明了该色谱填料相比常规的C18色谱柱和其它公司类似的色谱柱具有更为优异的分离效果。全多孔硅胶基质的体积排阻色谱填料具有较大孔隙容积、较低的疏水性、较高的理论塔板数和较大的峰容量。通过合成亲水性聚合物涂层的二醇基色谱填料，可以大大增强了其稳定性(B. Anspach, et al. J. Chromatogr. , 1988, 443, 45)。并且,分离中既不涉及太多的作用力，分离一般在水相条件下，极为温和。另外，硅胶上包覆的亲水性聚合物具有多种保留机理，其表面受二醇基官能团保护而不与蛋白相互作用，色谱柱不会累积强烈吸附的目标物，目标物的回收率较高，不容易发生副反应，使用寿命长，多数蛋白在洗脱过程中的质量回收率接近100%。另外，硅胶表面包覆的亲水性聚合物保证了填料与目标物充分的作用，具有更高的分辨率，能够在更高的温度下操作。以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。
权利要求
1.一种用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤 A硅胶活化，制得活化硅胶； B将所述活化硅胶进行环氧基改性，制得环氧基改性硅胶； C在所述环氧基改性硅胶上引入亲水性聚合物,制得亲水性聚合物改性硅胶；及 D将所述亲水性聚合物改性硅胶水解，制得所述用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于， 所述A步骤包括 将硅胶用蒸馏水清洗，然后用氢氟酸水溶液浸泡，随后用蒸馏水洗涤至中性，最后用丙酮洗涤并干燥； 所述B步骤包括 以硼酸缓冲液作为溶剂，将所述活化硅胶与环氧基硅烷化试剂在搅拌和回流下进行改性反应； 所述C步骤包括 将所述环氧基改性硅胶与亲水性聚合物在搅拌和回流下进行改性反应，反应结束后，抽滤，并依次用蒸馏水、四氢呋喃、乙腈进行洗涤； 所述D步骤包括 将所述亲水性聚合物改性硅胶与柠檬酸缓冲液进行水解反应，反应结束后，抽滤，依次用蒸馏水和甲醇洗涤，真空干燥。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述氢氟酸水溶液的质量浓度为O.08%,且所述娃胶与氢氟酸水溶液的料液比为1:8-1:10。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述环氧基硅烷化试剂为Y-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶与环氧基硅烷化试剂的质量比为1:2-1:4，所述活化硅胶进行环氧基改性的反应时间为O. 5-2小时；反应温度为70-100。 Co
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硼酸缓冲液的pH值为7.0-9. 0，所述活化硅胶与硼酸缓冲液的料液比为1:8-1:10。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述亲水性聚合物为可溶性粉、纤维素或葡聚糖。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述硅胶与可溶性淀粉的质量比为1:2-1:4，所述环氧基改性硅胶进行亲水性聚合物改性的反应时间为20-24小时；反应温度为 70-100° C。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸盐缓冲液的pH值为2.0-4. 0，所述硅胶与柠檬酸盐缓冲液的料液比为1:8-1:10，所述亲水性聚合物改性硅胶进行水解的反应时间为1-3小时，反应温度为70-90° C。
10.一种用于分离水溶性聚合物和蛋白用亲水硅胶色谱填料，通过如权利要求1-9中任一项所述的制备方法制得。
全文摘要
本发明提供了一种用于分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料及其制备方法。其制备方法包括A硅胶活化，制得活化硅胶；B将所述活化硅胶进行环氧基改性，制得环氧基改性硅胶；C在所述环氧基改性硅胶上引入亲水性聚合物，制得亲水性聚合物改性硅胶；D将所述亲水性聚合物改性硅胶水解，制得分离水溶性聚合物和蛋白的亲水性硅胶色谱填料。该色谱填料具有较大孔隙容积、较低的疏水性、较高的理论塔板数和较大的峰容量。
文档编号B01J20/30GK103055832SQ20121059450
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者赵岳星, 薛昆鹏, 姚立新 申请人:浙江月旭材料科技有限公司