一种重组蛋白a及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种新型重组金黄色葡萄球菌蛋 白A及其在蛋白分离纯化中的应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A, SpA)包括5个结构域，分别为 E、D、A、B、C，其中B结构域（B片段）对结合免疫球蛋白结合力最强。野生型葡萄球菌蛋白 A以及重组葡萄球菌蛋白A(rPA)和改良型蛋白已经被广泛用于亲和层析领域，由葡萄球菌 蛋白A制成的亲和层析介质被广泛地用于捕获抗体，去除宿主蛋白和残留DNA。
[0003] 亲和层析介质往往需要清洗，目的是为保留亲和配基的选择性和高度特异性以及 防止细菌污染，通常采用0.1~0.5M NaOH溶液进行冲洗，其pH范围在12~14之间。由 于蛋白在此碱性条件下易发生变性，失去活性功能。因此，将亲和层析介质进行碱液原位清 洗，多次循环后，介质对靶分子的结合力将显著丧失，不仅加重了纯化成本，而且，由于蛋白 A的脱落，也降低了目标产物的纯度。
[0004] 金黄色葡萄球菌蛋白A的B片段经改造成Z片段，其氨基酸序列第29位的甘氨酸 被替换为丙氨酸（Stahl 等，1999. Affinity fusions in biotechnology:focus on protein A and protein G, in The Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation, Bioc atalysis and Bioseparation· M. C. Fleckinger 和 S. W. Drew,编辑· John Wiley and Sons Inc.，纽约，8-22)。Z片段被用作亲和层析中的配基，相较于B片段，Z片段显示出对除了 NaOH之外的某些化学试剂增强的稳定性，但是在较高的碱性条件下，仍然是不稳定的，不能 满足于工业上在线清洗（Cleaning In Place，CIP)再生的需要。因此，本领域仍然需要开 发一种更稳定，尤其是耐碱性更强的蛋白A。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型重组金黄色葡萄球菌蛋白A聚体，其功能包括但不 限于作为一种配基特异性地结合免疫球蛋白。
[0006] 在本发明的第一方面中，提供了 一种重组蛋白A聚体，所述重组蛋白A聚体是两个 或多个金黄色葡萄球菌蛋白A的Z片段串联形成的多聚体，并且各Z片段中的至少一个为 具有以下氨基酸突变的Z片段突变体：Asn3Asp、Asn6Leu和Asn23Thr。
[0007] 在另一优选例中，所述的Z片段中的每一个为具有以下氨基酸突变的Z片段突变 体：Asn 3Asp、Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0008] 在另一优选例中，所述的重组蛋白A聚体为2-20聚体，较佳地4-10聚体。
[0009] 在另一优选例中，所述的重组蛋白A聚体为4聚体、6聚体、8聚体、10聚体。
[0010] 在另一优选例中，所述的重组蛋白A聚体中相邻的两个Z片段直接相连，或通过连 接肽相连。
[0011] 在另一优选例中，所述重组蛋白A聚体由Z片段和连接肽构成；所述连接肽存在 于Z片段之间，并且所述Z片段全部是具有以下氨基酸突变的Z片段突变体：Asn3Asp、 Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0012] 在另一优选例中，所述的重组蛋白A聚体具有式（I)所示的结构：
[0013] Pa-(Za_L) n-Za-Pb (I)
[0014] 式中，
[0015] Pa为无、Met、前导序列、分泌肽序列、用于纯化的标签序列或其组合；
[0016] 各Za独立地为金黄色葡萄球菌蛋白A的Z片段的氨基酸序列，并且至少一个Za 为具有以下氨基酸突变的Z片段突变体：Asn3Asp、Asn6Leu和Asn23Thr ;
[0017] L独立地为无、或连接肽序列；
[0018] η为彡1的正整数；
[0019] Pb为无、Cys、纯化的标签序列或其组合。
[0020] 在另一优选例中，η为1-50的正整数，较佳地2-20的正整数，较佳地2、3、4、5、6、 7或8。
[0021] 在另一优选例中，所有的Za为具有以下氨基酸突变的Ζ片段突变体:Asn3Asp、 Asn6Leu 和 Asn23Thr。
[0022] 在另一优选例中，所述的Za的序列如SEQ ID No. :3所示。
[0023] 在另一优选例中，所述的L为长度3-50个（较佳地3-20个）氨基酸的连接肽序 列。
[0024] 在另一优选例中，所述的L选自下组：QKDAVFP、ASTKGP。
[0025] 在另一优选例中，所述的重组蛋白A聚体具有式（II)所示结构：
[0026] Met-Za-L-Za-L-Za-L-Za-Cys (II)
[0027] 其中，Za、L定义同上。
[0028] 在另一优选例中，所述重组蛋白A聚体为具抗体结合能力的蛋白。
[0029] 在另一优选例中，所述的抗体包括IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体。
[0030] 在另一优选例中，所述重组蛋白A聚体的C末端还含有氨基酸残基Cys。
[0031] 在另一优选例中，所述重组蛋白A聚体具有如SEQ ID No. :5所示的氨基酸序列。
[0032] 本发明在第二方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面项所 述重组蛋白A聚体。
[0033] 在已知蛋白质氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以根据需要设计合适的编 码所述氨基酸序列的多核苷酸序列，并将其表达。
[0034] 在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID N0. :1所示。
[0035] 本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷 酸。
[0036] 本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所 述的载体或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0037] 本发明的第五方面提供了一种生产本发明第一方面所述重组蛋白A聚体的方法， 包括步骤：
[0038] (a)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的重组 蛋白A聚体；和
[0039] (b)从培养体系中分离或纯化所述的重组蛋白A聚体。
[0040] 本发明的第六方面提供了一种亲和层析介质，所述亲和层析介质含有本发明第一 方面所述的重组蛋白A聚体。
[0041] 在另一优选例中，在所述亲和层析介质中，所述的重组蛋白A聚体被固定于或结 合于载体。
[0042] 在另一优选例中，所述的重组蛋白A聚体通过硫醚键偶联结合于载体。
[0043] 本发明的第七方面提供了一种纯化方法，包括步骤：对于待纯化的原料，用本发明 第六方面所述的亲和层析介质进行亲和层析。
[0044] 在另一优选例中，所述的纯化是用于纯化抗体。
[0045] 在另一优选例中，所述的待纯化的原料是含有待纯化抗体的液态原料（如培养 液、发酵液等）。
[0046] 本发明的重组蛋白A具有较高的耐碱性，采用所述的重组蛋白A可提高亲和层析 过程中蛋白的稳定性和最大载量。
[0047] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0048] 图1为表达质粒pET30a_4Z'的图谱。
[0049] 图2为含有质粒pET30a-4Z'的大肠杆菌BL21 (DE3)经IPTG诱导表达重组蛋白A 聚体的SDS-PAGE电泳图，其中各泳道分别为：1 :诱导前，2 :诱导后2h